本發(fā)明涉及用于制備蟲草提取物的方法。更具體地講，本發(fā)明涉及用于制備包含高濃度腺苷的蟲草提取物的方法。
背景技術(shù)：
：本說明書中對現(xiàn)有技術(shù)的任何論述絕不應(yīng)被視為承認(rèn)此現(xiàn)有技術(shù)是廣泛已知的或構(gòu)成本領(lǐng)域公知常識的一部分。蟲草(cordyceps)是主要在昆蟲和其它節(jié)肢動物身上生長的子囊菌真菌屬。蟲草是眾所周知的傳統(tǒng)中藥成分。蟲草也稱為冬蟲夏草，英文名稱為“caterpillarfungus”或“winterwormsummergrass”。當(dāng)在傳統(tǒng)中藥中使用時，這種成分實際上由真菌連同其上所寄生的蛾幼蟲組成。在本說明書的其余部分，術(shù)語“蟲草”是指傳統(tǒng)醫(yī)藥成分，如在傳統(tǒng)中藥中所用。在提及真菌菌種時，菌種或?qū)俚拿Q首字母應(yīng)大寫并以斜體表示，例如蟲草菌(cordycepssinensis)。按照傳統(tǒng)中藥學(xué)，蟲草常用作補藥，并用于諸如補腎、益肺等醫(yī)治目的以及用于消除疲勞。由于蟲草菌稀有且療效出色，已經(jīng)從野生型蟲草菌絲中分離出若干菌株。這些分離的菌株用于發(fā)酵工藝，然后通常作為功能性食物產(chǎn)品出售。蟲草菌及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制對于確保其安全性和功效至關(guān)重要。此外，也已經(jīng)使用一些替代物如蛹蟲草(c.militaris)和摻雜蟲草(c.adulterants)。蟲草似乎是諸如蟲草素(3′-脫氧腺苷)、腺苷及其衍生物、麥角固醇或多糖等感興趣的化學(xué)組分的來源。腺苷是一種嘌呤核苷，在生物化學(xué)過程諸如能量傳遞中(作為腺苷三磷酸(atp)和腺苷二磷酸(adp))以及在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(作為環(huán)腺苷一磷酸鹽(camp))中發(fā)揮重要作用。它也是一種神經(jīng)調(diào)質(zhì)，用于促進(jìn)睡眠和抑制興奮。腺苷也在通過血管舒張調(diào)節(jié)流向各個器官的血流時發(fā)揮重要作用。腺苷通過位于例如免疫、神經(jīng)、循環(huán)、呼吸或泌尿系統(tǒng)中的幾種類型的受體起作用。研究指出，腺苷和蟲草素是一些生物活性化合物，提供蟲草的抗炎、抗氧化和心臟保護(hù)療效。通常認(rèn)為蟲草素(3′-脫氧腺苷)和腺苷是蟲草的品質(zhì)標(biāo)記物。新鮮蟲草還包含大量水。因此，出于商業(yè)和長時間放存目的必須干燥蟲草。另外，用于食用的蟲草必須符合法規(guī)要求。舉例來說，在中國，蟲草產(chǎn)品必須包含至少50mg/100g的腺苷并且具有低于10000的菌落總數(shù)(tpc)。多年研究表明，人工培養(yǎng)的蟲草菌的特性和營養(yǎng)組分與野生蟲草菌的特性和營養(yǎng)組分相同，或者更強。另有研究表明蟲草菌經(jīng)過人工培養(yǎng)可產(chǎn)生孢子，而孢子被視為蟲草菌最好的部分。制備蟲草的傳統(tǒng)方法包括干燥、研磨、滅菌和包裝。然而，按傳統(tǒng)方法制備的蟲草提取物不具有所需的腺苷含量并且不滿足微生物安全標(biāo)準(zhǔn)。為了使成品具有高腺苷濃度，供應(yīng)商在選擇新鮮蟲草和工藝參數(shù)時必須非常謹(jǐn)慎。然而，這些操作仍然不能保證產(chǎn)品的一致性，尤其是可再現(xiàn)的批次質(zhì)量。此外，為了消除微生物風(fēng)險，供應(yīng)商通常應(yīng)用滅菌或輻射。然而，這些操作可能引起腺苷損失或其它活性組分性能劣化，繼而可能導(dǎo)致合規(guī)性問題。希望克服或改善現(xiàn)有技術(shù)的至少一個缺點，或提供有用的替代方案。具體地講，希望提供制備具有一致的批次質(zhì)量、足夠的腺苷含量和低微生物污染的蟲草提取物的方法。同樣希望蟲草提取物可易于制備食物產(chǎn)品或飲料，諸如功能性食物產(chǎn)品。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的憑借獨立權(quán)利要求的主題實現(xiàn)。從屬權(quán)利要求進(jìn)一步拓展本發(fā)明的構(gòu)想。因此，在第一方面，本發(fā)明提供用于制備蟲草提取物的方法，該方法包括以下步驟：a)研磨蟲草，b)漂白所述蟲草，c)干燥所述漂白的蟲草，其中漂白包括在27℃至90℃的溫度下在水中處理所述蟲草20至240分鐘。在第二方面，本發(fā)明提供采用根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法制備的蟲草提取物，其中所述蟲草提取物包含100mg-220mg腺苷/100g提取物。在第三方面，本發(fā)明提供包含可通過根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法獲得的蟲草提取物或根據(jù)本發(fā)明第二方面的蟲草提取物的營養(yǎng)組合物。該營養(yǎng)組合物可為食物產(chǎn)品、飲料、功能保健食品、營養(yǎng)劑、食品添加劑、營養(yǎng)配方和寵物食品。在第四方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第二方面的蟲草提取物或通過根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法制備的蟲草提取物用于制備治療或預(yù)防疲勞、心血管疾病或炎癥或者提高免疫力的營養(yǎng)組合物的用途。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在結(jié)合附圖閱讀對本發(fā)明實施方案的詳細(xì)描述后，會更清楚地了解本發(fā)明的這些及其他方面、特征和優(yōu)點。附圖說明圖1為示出蟲草傳統(tǒng)制備方法的流程圖，如實施例1中所述(現(xiàn)有技術(shù))。圖2至圖5為示出根據(jù)本發(fā)明的制備蟲草提取物方法的實施方案的流程圖，如實施例2至5中所述。圖6為uplc-pda分析所得蟲草提取物的色譜圖，如在試驗實施例6中所述。具體實施方式貫穿本說明書，詞語“包括”、“包含”等都應(yīng)解釋為與排他性或窮舉性含義相反的包含性含義，也就是說，是“包括但不限于”的意思。如本說明書中所用，單數(shù)形式“一個/一種”、“該/所述”包括復(fù)數(shù)指代物，除非語境明確地另有所指。除非另有說明，否則本說明書中的所有百分比都指重量百分比。除非另有定義，否則所有科技術(shù)語都具有并且應(yīng)當(dāng)被賦予與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。本文所用的蟲草是指所有蟲草菌種，包括蟲草菌、蛹蟲草、頭狀蟲草(c.capita)、粉被蟲草(c.pruinosa)和大團囊蟲草(c.ophioglossoides)。在一個實施方案中，蟲草菌種選自蟲草菌、蛹蟲草、頭狀蟲草、粉被蟲草和大團囊蟲草，優(yōu)選地選自蟲草菌、蛹蟲草和大團囊蟲草。在制備根據(jù)本發(fā)明的蟲草提取物時，可使用不同蟲草菌種的混合，諸如包括蟲草菌和大團囊蟲草兩者的混合蟲草。優(yōu)選的是，蟲草是新鮮的。這樣，蟲草提取物的品質(zhì)相比干燥蟲草有所改善。然而，同樣可以基于干燥蟲草來制備蟲草提取物。用于制備蟲草提取物的方法的示例示于圖2至圖5中。在圖2至圖5中，可選步驟以虛線框表示。灰色框?qū)?yīng)于漂白步驟，如下文所說明。對于蟲草提取物制備方法的所有實施方案而言，相同的一點是將蟲草研磨成粉末?？稍谒羞M(jìn)行研磨，以直接得到蟲草漿液。研磨增大了蟲草顆粒的表面/體積比，從而提高了提取效率。研磨可通過剁、切或其它方法實現(xiàn)。優(yōu)選地，將蟲草研磨成0.5mm至5mm的粒徑，更優(yōu)選1mm至3mm的粒徑。優(yōu)選地，使用新鮮蟲草，但也可使用干燥蟲草。如在圖2至圖5的流程圖中所示，在研磨后的蟲草中加入水，以得到蟲草漿液。如前文所述，也可在研磨之前將水加入蟲草中。蟲草與水的重量比不固定。通常蟲草與水的重量比在0.5∶1至2∶1的范圍內(nèi)，并且優(yōu)選地在1∶1至1.5∶1的范圍內(nèi)。如果使用較少水，則提取效率可能較低。如果相對于蟲草使用太多水，則必須蒸發(fā)掉過量的水，而這需要消耗更多能量。水可為蒸餾水或自來水。優(yōu)選地，使用蒸餾水來降低微生物污染的風(fēng)險，尤其是在未對蟲草提取物滅菌時。然后在水中漂白蟲草漿液。漂白包括在27℃至90℃的溫度下在水中處理所述蟲草20至240分鐘。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，漂白蟲草漿液提高了蟲草提取物的腺苷含量。漂白步驟的持續(xù)時間取決于漂白溫度。在一些實施方案中，漂白在一個步驟中完成。例如，在30℃至85℃的溫度下漂白蟲草漿液30分鐘至200分鐘，優(yōu)選地在30℃至45℃的溫度下漂白蟲草漿液120分鐘至200分鐘。在一個實施方案中，通過在30℃至40℃的溫度下浸泡150分鐘至200分鐘來漂白蟲草漿液。在另一個實施方案中，在70℃至90℃的溫度下漂白蟲草漿液30分鐘至60分鐘。在其它優(yōu)選的實施方案中，漂白分為兩個步驟：第一步為在水中溫和熱處理，然后進(jìn)行第二步即水中強效熱處理。例如，首先在30℃至45℃的溫度下在水中浸泡蟲草漿液120分鐘至200分鐘，然后將漿液加熱至70℃至90℃的溫度并在水中再保持30分鐘至60分鐘。在另一個優(yōu)選的實施方案中，蟲草漿液的漂白是通過以下方式完成的：在30℃至45℃的第一溫度下在水中浸泡蟲草漿液120分鐘至200分鐘，然后在5至15分鐘內(nèi)使溫度升高至70℃至90℃的第二溫度，并保持第二溫度30至45分鐘。如將在實施例中示出，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在30℃下浸泡蟲草漿液180分鐘(溫和熱處理)，然后將蟲草漿液加熱至85℃并保持30分鐘(強效熱處理)，能夠制備具有最高腺苷含量的提取物。優(yōu)選在干燥之前對漂白過的蟲草漿液滅菌。滅菌用于減少潛在污染并使產(chǎn)品的保質(zhì)期更長。在98℃至101℃的溫度下對漂白過的蟲草漿液滅菌10至15分鐘，更優(yōu)選約15分鐘。在滅菌之后，例如通過冷凍干燥法、烘箱干燥法或真空干燥法來干燥蟲草漿液?？蓪⒏稍锖蟮南x草研磨成30至200目尺寸，并且更優(yōu)選50至100目尺寸的粉末。通過上述方法制備蟲草提取物時，可得到包含高濃度腺苷的蟲草提取物，例如每100g蟲草提取物中100mg至220mg腺苷的濃度。這遠(yuǎn)高于根據(jù)先前制備方法所得的25mg/100g濃度(圖1和下文實施例1)。在一些實施方案中，可達(dá)到高于110mg/100g，并且甚至高于150mg/100g的腺苷濃度。腺苷的最終濃度取決于漂白條件，包括漂白時間和溫度以及漂白步驟。本發(fā)明的一方面涉及包含可利用上述方法獲得的蟲草提取物的營養(yǎng)組合物。該營養(yǎng)組合物可為食物產(chǎn)品、飲料、功能保健食品、營養(yǎng)劑、食品添加劑、營養(yǎng)配方和寵物食品。該營養(yǎng)組合物可通過將蟲草提取物混合到標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)產(chǎn)品中來制備。當(dāng)需要干式營養(yǎng)產(chǎn)品時，可將干燥蟲草提取物干混到干燥營養(yǎng)產(chǎn)品中。例如，可將干燥蟲草提取物混合到奶粉中。當(dāng)需要濕式營養(yǎng)產(chǎn)品時，可能希望在對濕式營養(yǎng)產(chǎn)品進(jìn)行滅菌或熱處理之前，將漂白后的蟲草漿液(可能經(jīng)過濃縮或滅菌)混合到濕式營養(yǎng)產(chǎn)品中。在第四方面，本發(fā)明提供所含腺苷量范圍在100mg/100g至220mg/100g之間的蟲草提取物用于制備治療或預(yù)防疲勞、心血管疾病或炎癥或者提高免疫力的營養(yǎng)組合物的用途。該營養(yǎng)組合物可為食物產(chǎn)品、飲料、功能保健食品、營養(yǎng)劑、食品添加劑、營養(yǎng)配方和寵物食品。實施例實施例1：蟲草的傳統(tǒng)制備方法如圖1所示，收集50g新鮮蟲草子實體，將其在101℃下巴氏滅菌10分鐘。然后將經(jīng)過巴氏滅菌的蟲草在-50℃下冷凍干燥12小時。收集并研磨經(jīng)冷凍干燥的蟲草。獲得棕色粉末。通過uplc分析腺苷含量，如試驗實施例6中所述。蟲草粉末包含25mg腺苷/100g粉末。實施例2：制備蟲草提取物如圖2所示，收集50g新鮮蟲草子實體，在銑床中剁碎以得到蟲草漿液。向蟲草漿液中加入500g水。然后分兩步(在圖2中以灰色框示出)進(jìn)行漂白：在30℃下處理(浸泡)蟲草漿液3小時(180分鐘)，接著在85℃下進(jìn)一步處理蟲草漿液30分鐘。最后，在101℃下對蟲草漿液滅菌10分鐘，并在-50℃下過夜冷凍干燥。收集經(jīng)冷凍干燥的蟲草，并研磨得到棕色粉末。通過uplc分析腺苷含量，如試驗實施例6中所述。蟲草粉末包含176mg腺苷/100g粉末。實施例3：制備蟲草提取物如圖3所示，收集50g新鮮蟲草子實體，在銑床中剁碎以得到蟲草漿液。向蟲草漿液中加入500g水。然后分兩步(在圖3中以灰色框示出)進(jìn)行漂白：在30℃下處理(浸泡)蟲草3小時(180分鐘)，接著在85℃下進(jìn)一步處理蟲草漿液30分鐘。最后，在-50℃下將蟲草漿液過夜冷凍干燥。收集經(jīng)冷凍干燥的蟲草，并研磨得到棕色粉末。通過uplc分析腺苷含量，如試驗實施例6中所述。蟲草粉末包含205mg腺苷/100g粉末。在實施例3中，與實施例2相反，漂白后的蟲草漿液未經(jīng)滅菌。滅菌似乎對腺苷含量具有負(fù)面影響。實施例4：制備蟲草提取物如圖4所示，收集50g新鮮蟲草子實體，在銑床中剁碎以得到蟲草漿液。向蟲草漿液中加入500g水。漂白在一個步驟(在圖4中以灰色框示出)中進(jìn)行：在85℃下處理蟲草漿液30分鐘。最后在101℃下對蟲草漿液滅菌10分鐘，并在-50℃下過夜冷凍干燥。收集經(jīng)冷凍干燥的蟲草，并研磨得到棕色粉末。通過uplc分析腺苷含量，如試驗實施例6中所述。蟲草粉末包含109mg腺苷/100g粉末。在實施例4中，與實施例2和3相反，使用一步漂白。一步漂白相比于兩步漂白似乎得到更低的腺苷含量。實施例5：制備蟲草提取物如圖5所示，收集50g新鮮蟲草子實體，在銑床中剁碎以得到蟲草漿液。向蟲草漿液中加入500g水。漂白在一個步驟(在圖5中以灰色框示出)中進(jìn)行：在30℃下處理蟲草漿液180分鐘。最后在101℃下對蟲草漿液滅菌10分鐘，并在-50℃下過夜冷凍干燥。收集經(jīng)冷凍干燥的蟲草，并研磨得到棕色粉末。通過uplc分析腺苷含量，如試驗實施例6中所述。蟲草粉末包含158mg腺苷/100g粉末。在實施例5中，與實施例4相反，使用一步溫和漂白。溫和漂白相比于強效漂白似乎得到更高的腺苷含量。下表匯總了實施例1-5的主要工序并比較了研磨蟲草提取物的腺苷含量。實施例與圖漂白滅菌腺苷(mg/100g)1無有252兩步，溫和然后強效有176.373兩步，溫和然后強效無2054一步，強效有108.735一步，溫和有157.77試驗實施例6：分析腺苷含量的方法參考中國藥典中的方法，在超聲條件下用甲醇∶水(1∶1，體積/體積)萃取精細(xì)蟲草提取物粉末30分鐘，并采用c18柱(例如，acquitybehc18，2.1*100mm，1.7μm)通過uplc-pda定量。該分析采用等度方法，在室溫下以1.0ml/分鐘的流速進(jìn)行。流動相為水∶甲醇(95∶5，體積/體積)。用于定量的吸收波長為259.4nm。用acquityuplc-pda(美國沃特世公司(waters，usa))分析蟲草提取物。uplc的詳細(xì)參數(shù)示于下表中。這種方法用于分析實施例1至5中所述的蟲草提取物中的腺苷含量。圖6為uplc-pda分析所得蟲草提取物色譜圖的示例。根據(jù)通過注入不同含量的標(biāo)準(zhǔn)物形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算腺苷的濃度。例如，注入下面所列舉標(biāo)準(zhǔn)物以得到校準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)物名稱濃度(x值)腺苷響應(yīng)(y值)1μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)物1μg/ml164152μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)物2μg/ml290554μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)物4μg/ml640638μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)物8μg/ml13066115μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)物15μg/ml24686030μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)物30μg/ml47644850μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)物50μg/ml810322根據(jù)上述結(jié)果，得到腺苷校準(zhǔn)方程式，諸如y＝ax+b。然后注入未知樣品，得到響應(yīng)y值，并計算以μg/ml表示的x值。最后樣品中的腺苷含量a可根據(jù)下式以mg/100g表示：x如采用校準(zhǔn)方程式計算得出的腺苷濃度(μg/ml)m樣品重量(g)50稀釋體積(ml)1000從μg至mg的轉(zhuǎn)換因子當(dāng)前第1頁12