一株具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌JYM841(Bacillus subtilis JYM841)，已于2014年1月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2014012。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌JYM841對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌都具有較強的抑制作用，該菌株抑菌性強、抑菌譜廣、產(chǎn)酶比較高，對細菌抗生素敏感，對真菌抗生素耐藥；耐高溫能力較強，在100℃處理20min還有較強的抑菌性，對胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K等多種酶具有耐受性；對酸堿較耐受，能耐酸堿pH值的范圍為6-10，代謝產(chǎn)物穩(wěn)定。因此該菌株可以在制備治療生殖道感染的藥物中應用。
CCTCC NO:M2014012
20140110
【專利說明】一株具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌及其應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素是某些微生物通過酶促反應將初級代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)性的次級代謝產(chǎn) 物。抗生素不合理的大量使用、濫用，加上缺乏嚴格的監(jiān)管，導致死亡、耐藥微生物及超級耐 藥菌株的產(chǎn)生，抗生素的誤用也置病人于不必要的抗藥性風險中；由不良藥物反應導所致 的住院治療費用已增長至億萬美元，大大增加了醫(yī)療成本，濫用抗生素產(chǎn)生的副作用已成 為全球性亟待解決的問題。
[0003] 外陰陰道假絲酵母菌（Vulvovaginal candidiasis，VVC)及細菌性陰道病 (Bacterial Vaginosis，BV)是陰道微生態(tài)失衡所致的一種感染，S卩由白色念珠菌（Candida albicans)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、大腸桿菌（Escherichia coli)等 大量繁殖所致，常常表現(xiàn)為分泌物增多、有異味，外陰瘙癢、白帶異常，顏色發(fā)黃或灰白、質(zhì) 稀薄或呈豆渣樣、有腥臭味，或有燒灼感、下腹疼痛或腰疼、腰酸等，嚴重影響廣大女性的工 作和生活。據(jù)調(diào)查：75%的育齡婦女一生中至少有一次發(fā)病，全球數(shù)以萬計的婦女一直被這 種陰道病困擾著。
[0004] 目前治療陰道感染的措施主要是運用抗生素、滅滴靈、雌激素以及酸化陰道的制 劑等來殺滅陰道內(nèi)的病原微生物。抗生素在殺死病源微生物的同時也殺死正常菌群，引起 致病菌或條件致病菌的過度繁殖，造成反復感染、多重感染，產(chǎn)生耐藥性、抗藥性，增加治療 的難度和成本。中藥治療，采用熏洗的方法，往往對BV效果不佳，目前市面上常見的中成藥 物凝膠劑、栓劑、泡騰片等，主要是用于抗菌藥物的輔助治療。據(jù)調(diào)查很多藥物效果不佳，特 別是對VVC、復發(fā)性念珠陰道?。╮ecurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)，療程長易 反復。
[0005] 因此，開發(fā)無毒副作用、安全高效的具有抗感染性能的益生菌菌株，可以減少、 替代甚至取代抗生素的使用，有效降低抗生素帶來的一系列的副作用。枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)是自然界中廣泛存在的一種非致病性細菌，能產(chǎn)生多種抗真菌和細 菌的代謝物，不會產(chǎn)生耐藥性，將其作為抗生素的替代品，其研宄和開發(fā)意義重大，市場前 景廣闊。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一株具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌及其應用。
[0007] 本發(fā)明提供的具有抑菌活性枯草芽孢桿菌，該菌株命名為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)JYM841，已于2014年1月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號為 CCTCC N0:M 2014012。
[0008] 所述菌株的主要生物學特征為：該菌種的細胞大小為通常為（0.7 ym? 0. 8 ym) X (2.0 ym?3.0 ym)，桿狀，很少成鏈，染色均勻，無莢膜，鞭毛側(cè)生，能運動；芽孢 呈橢圓形或柱狀，中生或偏生，大小為0. 8 y mX (1. 5 y m?1. 8 y m);游離孢子表面著色弱； 培養(yǎng)基上的菌落圓或者不規(guī)則形，表面色暗，變厚和不透明，可起皺，可呈奶油色或微粉色； 革蘭氏陽性，接觸酶陽性，能發(fā)生V-P反應；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸， 能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；生長溫度最高值45°C?55°C，最低值5°C?20°C，最適 溫度為37°C。
[0009] 本發(fā)明還提供一種菌劑，它的活性成分為枯草芽孢桿菌JYM841，CCTCC NO:M 2014012。
[0010] 生產(chǎn)所述菌劑的工藝為：斜面接種-搖瓶接種-種子罐-發(fā)酵罐-產(chǎn)品，產(chǎn)品的包 裝劑型為液體菌劑或粉劑。
[0011] 用所述菌株制備所述菌劑具體可采用如下步驟：
[0012] (1)菌種：選用枯草芽孢桿菌JYM841 ;
[0013] (2)斜面培養(yǎng)：將凍干粉菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在35°C?40°C培養(yǎng) 24h ?26h ;
[0014] (3) -級種子培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的斜面，在無菌條件下接種，用接種環(huán)取一到兩環(huán)于 50mL?100mL種子液體培養(yǎng)基中，在35°C?40°C，180rpm下震蕩培養(yǎng)24h?30h，制得一級 種子液；
[0015] (4)擴大培養(yǎng)：以0.5?1%的接種量（按體積百分數(shù)），將一級種子液接于 500mL?1000mL種子液體培養(yǎng)基中，在35°C?40°C，180rpm下震蕩培養(yǎng)24h?26h，制得二 級種子液；
[0016] (5)發(fā)酵罐培養(yǎng)：以0. 5?1%的接種量（按體積百分數(shù)），將二級種子液接于液 體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C?28°C，罐壓0. 05MPa，通氣量600m3/h條件下培養(yǎng)18h?22h ;
[0017] 上述步驟⑶和⑷中，所述種子液體培養(yǎng)基的配方為：按質(zhì)量百分數(shù)計，硫酸鎂 0.01%，葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，磷酸二氫鉀0. 15%，氯化鈉1%，使用時調(diào) 節(jié)pH為6. 5?7. 0 ;
[0018] 步驟（5)中所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：按質(zhì)量百分數(shù)計，葡萄糖0.4%，蛋白 胨〇? 75 %，氯化鈉0? 25 %，酵母膏0? 4 %，使用時調(diào)節(jié)pH為6. 5?7. 0 ;
[0019] 步驟（2)中所述固體斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分數(shù)為 1.5?2.0 %的瓊脂粉。
[0020] 所述菌株和/或所述菌劑在制備治療生殖道感染的藥物中的應用也屬于本發(fā)明 的保護范圍；所述生殖道感染是由白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌大量繁殖引起 的。
[0021] 本發(fā)明還提供一種用于治療女性生殖道感染的藥物制劑；所述藥物制劑的劑型為 凝膠劑。
[0022] 該藥物制劑的配方組成為：按質(zhì)量百分數(shù)計，卡波姆1. 5?3%，殼聚糖0. 2? 0. 6 %，甘油3?5 %，薄荷油0. 2?0. 5 %，中藥提取濃縮液40?45 % (生藥量與濃縮液體 積比m/V為1:1)，菌株JYM841發(fā)酵離心液30?35 %，余量為水。
[0023] 所述中藥提取濃縮液為黃芩、苦參、薄荷和桑葉按質(zhì)量比為10:8:3:2混合的混合 藥材的水提液，濃縮至中藥生藥量與中藥液體積的比為1:1，單位g/mL。
[0024] 本發(fā)明還提供了該藥物制劑的制備方法，步驟為：稱取卡波姆，用菌株JYM841發(fā) 酵離心液溶解，邊加邊攪拌，再加入中藥提取濃縮液、殼聚糖，攪勻，直至細膩均勻無顆粒， 用質(zhì)量濃度為10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至4. 0-6. 5,加入甘油及薄荷油，加水至總量，攪 勾，即得。
[0025] 本發(fā)明的有益效果：
[0026] (1)本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌JYM841對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌都具有 較強的抑制作用，該菌株抑菌性強、抑菌譜廣、產(chǎn)酶比較高，對細菌抗生素敏感，對真菌抗生 素耐藥。
[0027] (2)本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌JYM841耐高溫能力較強，在100°C處理20min還 有較強的抑菌性，對胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K等多種酶具有耐受性，對酸堿較耐受： 能耐酸堿pH值的范圍為6. 0?10. 0,代謝產(chǎn)物穩(wěn)定。
[0028] (3)本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌JYM841的發(fā)酵周期為18?22h，抑菌性蛋白含 量較高，抑菌性較強，發(fā)酵液的活菌數(shù)數(shù)量級最高達到l〇 1(lCfu/g，噴干粉的芽孢活菌數(shù)到達 1. 4 X 1013cfu/g，酶活10940U/g，最低抑菌濃度為2 %。
[0029] (4)急性毒性試驗結(jié)果表明菌株JYM841是安全無毒的，以菌株JYM841或/和菌 劑作為活性成分制備的用于治療陰道感染的藥物不會產(chǎn)生副作用和不良藥物反應，安全性 好。避免應用抗生素帶來反復發(fā)作、耐藥性、超級細菌的產(chǎn)生等不良反應，還能夠保留體內(nèi) 的固有菌，再補充優(yōu)勢菌加速微生態(tài)菌群的平衡。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖la為分離菌株對白色念珠菌的抑菌圖片；
[0031] 圖lb為分離菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌圖片；
[0032] 圖2為菌株JYM841系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0033] 圖3為菌株JYM841凝膠蛋白分子量大小分析圖；
[0034] 圖4a為陰性對照組陰道切片（X40);圖4b為陰性對照組陰道切片（X200);
[0035] 圖5a為染毒組陰道切片（X 40);圖5b為染毒組陰道切片（X 200);
[0036] 圖6a為陽性對照組陰道切片（X40);圖6b為陽性對照組陰道切片（X200);
[0037] 圖7為治療7天后家兔的飲食變化趨勢圖；
[0038] 圖8為造模期間家兔陰道分泌物菌群變化；
[0039] 圖9為正常對照組陰道分泌物鏡檢涂片；
[0040] 圖10為灌注抗生素后陰道分泌物鏡檢涂片；
[0041] 圖11為攻毒后陰道分泌物鏡檢涂片；
[0042] 圖12實驗結(jié)束后各實驗組家兔陰道分泌物菌群變化；
[0043] 圖13為自然恢復組陰道分泌物鏡檢涂片；
[0044] 圖14為治療組陰道分泌物鏡檢涂片；
[0045] 圖15為陽性對照組陰道分泌物鏡檢涂片；
[0046] 圖16為正常對照組陰道組織切片圖（X40);
[0047] 圖17為模型組陰道組織切片圖（X40);
[0048] 圖18為治療組陰道組織切片圖（X40);
[0049] 圖19為陽性對照組陰道組織切片圖（X40)。

【具體實施方式】
[0050] 結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。
[0051] 本發(fā)明中未詳盡描述的試劑、方法均為所屬領(lǐng)域的常規(guī)試劑、方法。
[0052] 實施例1 :菌株JYM841的獲得和鑒定
[0053] 一、菌株JYM841的獲得
[0054] 1.培養(yǎng)基
[0055] (1)胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨1. 5%，大豆蛋白胨0. 5%，氯化鈉0. 5%， 瓊脂 1. 6%，pH7. 2 ;
[0056] (2)沙堡瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，瓊脂2%，pH5 ;
[0057] (3)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，PH 7. 2-7. 4,瓊脂 1. 6%〇
[0058] (4)芽孢菌基礎培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，酵母膏 0. 5%，pH7. 0。
[0059] (5)乳酸菌培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）：葡萄糖2.0%，檸檬酸銨0.2%，乙酸鈉0.5%， 磷酸氫二鉀0.5%，硫酸錳0.02%，硫酸鎂0.05%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，酵母膏 0? 5 %，吐溫-800. 1 %，pH6. 0。
[0060] (6)LB液體培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，酵母膏0.5%，pH 值 7.0。
[0061] (7)LB斜面培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，酵母膏0.5%，pH 值7.0,瓊脂1.6%。
[0062] (8)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖0. 4%，蛋白胨0. 75 %，氯化鈉0. 25%，酵母膏 0.4%，使用時調(diào)節(jié)pH為7.0。上述均按質(zhì)量百分數(shù)計。
[0063] 2.菌株的分離、篩選：無菌取中藥金銀花、苦參、黃芩各0.8g，分別加入到盛有 100mL滅菌生理鹽水的三角燒瓶中，震蕩搖勻，然后用接種環(huán)蘸取溶液于盛有已凝固的LB 培養(yǎng)基的平板中，劃線，37°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24h，挑取單菌落繼續(xù)劃線，革蘭氏染色鏡 檢，直至純化的無雜菌。
[0064] 3.菌株的純化：將篩選到的單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37°C，150rpm震搖 24h，能夠形成芽孢，將發(fā)酵液在80°C的水浴鍋中處理30min，用接種環(huán)在平板中劃線，挑取 單菌落保存到試管斜面上，做革蘭氏染色，鏡檢。
[0065] 4.分離菌株的抑菌性比較：用接種環(huán)取純化好的斜面菌株兩環(huán)于LB液體培養(yǎng)基 中，37°C，180rpm震蕩培養(yǎng)20h，用無菌鑷子取直徑為6mm，并加有20 y L經(jīng)lOOOOrpm離心 10min之后的發(fā)酵上清液的濾紙片，貼在已涂白色念珠菌的沙堡培養(yǎng)基，涂金黃色葡萄球菌 的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、涂大腸桿菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，每個菌貼有3片，在37°C培養(yǎng) 箱中恒溫培養(yǎng)16h，觀察并用游標卡尺量取抑菌圈的直徑。（紙片瓊脂擴散法）。初篩得到32 株較純的菌株，對32株菌進行抑菌性的復篩，得到7株抑菌性能較好的菌株，其形態(tài)學特征 見表1。測定7株菌株的抑菌性能，方法為：將活化后的7株菌以及枯草芽孢桿菌N9-1-35、 B7348分別接種于20mL/50mL的三角瓶中，37°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)22h后，然后以1%的接 種量（體積百分比）轉(zhuǎn)接到裝有l(wèi)OOmL LB液體培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，lOOOOrpm離心 lOmin，取上清分別做抑菌性試驗，結(jié)果見表2,圖la和圖lb。最終獲得1株最高效抑制白 色念珠菌和金黃色葡萄球菌的菌株，編號為JYM841。
[0066] 表1各株菌的形態(tài)學結(jié)果
[0067]

【權(quán)利要求】
1. 一株具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌，其特征在于，命名為枯草芽孢桿菌 JYM841(Bacillus subtilis JYM841)，已于2014年1月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2014012。
2. -種菌劑，其特征在于，其活性成分為權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌 JYM841,CCTCC NO:M 2014012〇
3. 如權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于，所述菌劑的劑型為液體菌劑或粉劑。
4. 權(quán)利要求2所述菌劑的制備方法，其特征在于，步驟如下： (1) 斜面培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌JYM841菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在35°C?40°C 培養(yǎng)24h?26h ; (2) -級種子培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的斜面，在無菌條件下接種，用接種環(huán)取一到兩環(huán)于 50mL?100mL種子液體培養(yǎng)基中，在35°C?40°C，180rpm下震蕩培養(yǎng)24h?30h，制得一級 種子液； ⑶擴大培養(yǎng)：以〇. 5?1 %的接種量，將一級種子液接于500mL?1000mL種子液體培 養(yǎng)基中，在35°C?40°C，180rpm下震蕩培養(yǎng)24h?26h，制得二級種子液； (4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：以0. 5?1 %的接種量，將二級種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于 25°C?28°C，罐壓0. 05MPa，通氣量600m3/h條件下培養(yǎng)18h?22h ; 上述步驟（2)和（3)中，所述種子液體培養(yǎng)基的配方為：按質(zhì)量百分數(shù)計，硫酸鎂 0.01%，葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，磷酸二氫鉀0. 15%，氯化鈉1%，使用時調(diào) 節(jié)pH為6. 5?7. 0 ; 步驟（4)中所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：按質(zhì)量百分數(shù)計，葡萄糖0.4%，蛋白胨 0? 75 %，氯化鈉0? 25 %，酵母膏0? 4 %，使用時調(diào)節(jié)pH為6. 5?7. 0 ; 步驟（1)中所述固體斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分數(shù)為1. 5? 2.0 %的瓊脂粉。
5. 權(quán)利要求1所述菌株和/或權(quán)利要求2所述菌劑在制備治療生殖道感染的藥物中的 應用。
6. 如權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述生殖道感染是由白色念珠菌、金黃色葡 萄球菌或大腸桿菌大量繁殖引起的。
7. -種用于治療女性生殖道感染的藥物制劑，其特征在于，其活性成分為權(quán)利要求1 所述的枯草芽孢桿菌JYM841，CCTCC N0:M 2014012的發(fā)酵離心液。
8. 如權(quán)利要求7所述的用于治療女性生殖道感染的藥物制劑，其特征在于，是由以下 質(zhì)量百分數(shù)比的原料制成的： 卡波姆1. 5?3%，殼聚糖0. 2?0. 6%，甘油3?5%，薄荷油0. 2?0. 5%，中藥提取 濃縮液40?45%，菌株JYM841發(fā)酵離心液30?35%，余量為水。 所述中藥提取濃縮液為黃芩、苦參、薄荷和桑葉按質(zhì)量比為10:8:3:2混合的混合藥材 的水提液，濃縮至中藥生藥量與中藥液體積的比為1:1，單位g/mL。
9. 如權(quán)利要求8所述的藥物制劑，其特征在于，該藥物制劑的劑型為凝膠劑。
10. 權(quán)利要求8所述的藥物制劑的制備方法，其特征在于，步驟如下： 將卡波姆用菌株JYM841發(fā)酵離心液溶解，邊加邊攪拌，再加入中藥提取濃縮液、殼聚 糖，攪勻，直至細膩均勻無顆粒，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至4. 0-6. 5,加入甘油及薄荷油，加水 至總量，攪勻，即得。
【文檔編號】C12R1/125GK104450590SQ201410828421
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月26日
【發(fā)明者】單寶龍, 陳雷, 谷巍, 程秀芳, 王紅, 劉虹, 張建梅, 黃啟亮, 翟延慶 申請人:山東寶來利來生物工程股份有限公司