一種磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒及提取方法
【專利摘要】一種磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒及提取方法，包含組分為細菌裂解液、磁珠結(jié)合液、磁珠洗滌液和核酸洗脫液。所述細菌裂解液含有十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷和氯化鈉；所述磁珠結(jié)合液含有聚乙二醇-8000和氯化鈉；所述磁珠洗滌液含有乙醇；所述核酸洗脫液含有羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸；本發(fā)明的試劑盒中含有獨特的細菌裂解液，對各種細菌均有較強的裂解作用；該試劑盒可以用于手工提取，也可以結(jié)合現(xiàn)在市售的核酸提取儀進行儀器提取，均能提取出純度和濃度較高的細菌核酸。
【專利說明】一種磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒及提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及核酸提取的生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種基于磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒。本發(fā)明還涉及使用磁珠法提取細菌中核酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain React1n, PCR)技術(shù)自80年代面世以來，越來越多的應用于分子生物學領(lǐng)域，核酸的分子生物學技術(shù)是進行病原微生物檢測，構(gòu)建基因庫，物種起源、多樣性評估及其親緣關(guān)系、系統(tǒng)進化等常用研宄手段之一。但核酸的提取是PCR技術(shù)應用的前提，且能否提取出高質(zhì)量的核酸分子是許多核酸分子生物學試驗中的關(guān)鍵，提取方法的靈敏度、特異性也將直接關(guān)系到后續(xù)試驗的成敗。堿裂解提取法到柱純化等提取技術(shù)，目前廣泛地用于細菌的DNA和RNA的提取，但這些方法還是存在諸多缺點，如耗時長、效率低，并且由于采用苯酚等毒性有機溶劑，操作有一定的風險性。
[0003]相比上述核酸提取技術(shù)，磁性分離法是一種簡單有效的核酸提純方法。該方法使用的磁珠表面連接了可特異地與DNA發(fā)生作用的功能基團，具有可逆吸附DNA的特性。磁珠法提純核酸最大的優(yōu)點是自動化，以及提供的試劑可用于磁性工具，該種方法不需要任何有機溶劑，也不需要反復離心，真空過濾或柱分離等步驟，僅僅是以核酸結(jié)合磁粉為基礎(chǔ)，大大減少了試驗對工作人員的危害，以及降低了對試驗設(shè)備的特殊要求。磁珠法所用試劑種類與濃度等參數(shù)的選擇決定了提取核酸的質(zhì)量與效率，也與成本密切相關(guān)，因此不斷探索更為便捷和高效的提取工具和提取方法，對核酸提取相關(guān)的基因工程的各項研宄具有重大的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種新的細菌核酸快速提取的試劑盒及提取核酸的方法，該試劑盒具有操作簡單快速、使用安全、提取效率高、制造成本低的特點。應用該試劑盒及方法，可以對用于PCR技術(shù)檢測的生物學中的多種細菌中的核酸實現(xiàn)快速提取。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0006]一種磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒，包含組分為:細菌裂解液、磁珠結(jié)合液、磁珠洗滌液和核酸洗脫液。所述細菌裂解液含有十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷和氯化鈉；所述磁珠結(jié)合液含有聚乙二醇-8000和氯化鈉；所述磁珠洗滌液含有乙醇；所述核酸洗脫液含有羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸；
[0007]優(yōu)選的，所述磁珠結(jié)合液中，聚乙二醇-8000的濃度為20-30mmol/L，氯化鈉的濃度為 3mol/L ；
[0008]優(yōu)選的，所述磁珠洗滌液中，乙醇的體積比濃度為70% -90% ;
[0009]優(yōu)選的，所述核酸洗脫液中，三羥甲基氨基甲烷的濃度為為5-15mmol/L，所述乙二胺四乙酸的濃度為1.30-1.50mmol/L ；
[0010]進一步優(yōu)選的，所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為lOmmol/L，所述乙二胺四乙酸的濃度為 1.35mmol/L ；
[0011]優(yōu)選的，在所述細菌裂解液中，十二烷基硫酸鈉的濃度為40-60mmol/L，所述乙二胺四乙酸的濃度為20-40mmol/L，所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為90-115mmol/L，所述氯化鈉的濃度為480-520mmol/L，余量為無菌水；所述細菌裂解液通過加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至 7.5-8.5。
[0012]一種磁珠法提取細菌中核酸的提取方法，包括以下步驟:
[0013]步驟1:將細菌及培養(yǎng)液混合物離心分離，去上清除去細胞培養(yǎng)液，留下細菌菌體；離心分離的轉(zhuǎn)速為13000r/min，離心分離的時間為2分鐘；
[0014]步驟2:向菌體中加入細菌裂解液，混勻；
[0015]步驟3:加入磁珠及磁珠結(jié)合液，磁鐵吸附去上清；
[0016]步驟4:加入磁珠洗滌液，使用磁鐵吸附磁珠，去上清；
[0017]步驟5:加入核酸洗脫液，使用磁鐵吸附磁珠，轉(zhuǎn)移洗脫液，得到細菌的核酸溶液。
[0018]優(yōu)選的，上述步驟2中加入的細菌裂解液的體積與細菌培養(yǎng)液的體積比為1:1-1:5,步驟3中加入的磁珠與磁珠結(jié)合液與細菌裂解液的體積比為1:10-1:20，步驟4中磁珠洗滌液與細菌裂解液的體積比為1:0.1-1:0.5，步驟5中核酸洗脫液與細菌裂解液的體積比為1:10-1:20。
[0019]一種磁珠法提取細菌中核酸的提取方法，包括以下步驟:
[0020]步驟1:將細菌及培養(yǎng)液混合物離心分離，去上清除去細胞培養(yǎng)液，留下細菌菌體；離心分離的轉(zhuǎn)速為13000r/min，離心分離的時間為2分鐘；
[0021]步驟2:向菌體中加入細菌裂解液，混勻后，轉(zhuǎn)移至96孔反應板的1排和7排；在2排和8排加入磁珠及磁珠結(jié)合液；在3排、4排、5排和9排、10排、11排加入磁珠洗滌液；在6排和12排加入核酸洗脫液；
[0022]步驟3:將注入試劑的96孔反應板放入核酸提取儀，自動運行結(jié)束后得到細菌核酸洗脫液。
[0023]優(yōu)選的，上述步驟2中注入96孔反應板的細菌裂解液的體積為200-300 μ L，與200-400 μ L無水乙醇混勻；注入的磁珠及磁珠結(jié)合液的體積為50-150 μ L，與300-400 μ L雙蒸水混勻；注入的磁珠洗滌液的體積為500-700 μ L ;注入的核酸洗脫液的體積為50_300uL0
[0024]本發(fā)明技術(shù)方案具有以下優(yōu)點:
[0025]1.本發(fā)明的試劑盒中含有獨特的細菌裂解液，對各種細菌均有較強的裂解作用；
[0026]2.本發(fā)明提供了手動和自動兩種方法，利用試劑盒可以進行手工提取，也可以結(jié)合現(xiàn)在市售的核酸提取儀進行儀器提取，均能提取出純度和濃度較高的細菌核酸；使用儀器提取過程為一步自動完成，整個提取過程無須再次打開儀器進行二次操作；
[0027]3.使用本發(fā)明試劑盒提取核算過程中無需加熱，與傳統(tǒng)試劑盒相比操作更加簡便；
[0028]4.本發(fā)明使用較少的步驟，減少管間的交叉污染和對環(huán)境的污染，核酸提取過程中不使用有毒試劑和有機溶劑，大大減少了對實驗人員的身體傷害。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明方法提取核酸時使用的96深孔反應板的立體圖；
[0030]圖2為按照本發(fā)明方法向96深孔反應板各排中注入試劑的示意圖。

【具體實施方式】
[0031]以下結(jié)合附圖通過實施例對本發(fā)明做進一步說明，以便更好地理解本發(fā)明。
[0032]實施例1:
[0033]1.細菌中核酸提取試劑盒及其試劑的配制方法:
[0034]①細菌裂解液的配制:先在容量瓶中加入少量無菌水，加入濃度為55mmoL/L的十二烷基硫酸鈉、加入濃度為25mmol/L的乙二胺四乙酸、加入濃度為lOOmmol/L的三羥甲基氨基甲燒、加入濃度為500mmol/L的氯化鈉，加入無菌水至所需體積，使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值使所述細菌裂解液的pH值為8.0，高壓蒸汽滅菌10分鐘。
[0035]②磁珠結(jié)合液的配制:先在容量瓶中加入少量無菌水，加入濃度為25mmol/L的聚乙二醇-8000，濃度為3mol/L的氯化鈉，加入無菌水至所需體積，高壓蒸汽滅菌10分鐘。
[0036]③磁珠洗滌液的配制:100 %乙醇。
[0037]④核酸洗脫液的配制:先在容量瓶中加入少量無菌水，加入濃度為10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷，加入濃度為13.7mmol/L的乙二胺四乙酸，加入無菌水至所需體積，高壓蒸汽滅菌10分鐘。
[0038]2.試劑盒的應用:
[0039]試劑盒的應用對象為培養(yǎng)16個小時的大腸桿菌。應用的具體操作為:培養(yǎng)大腸桿菌，配置大腸桿菌培養(yǎng)液，稱取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，加水定容至1L，高壓蒸汽滅菌10分鐘，安全柜內(nèi)接種對數(shù)生長期的大腸桿菌，接種后搖床37攝氏度搖晃16小時；取大腸桿菌菌液1ml加入至EP管中，13000r/min離心2分鐘后，棄去上清液，加入細菌裂解液1ml，混勾；5分鐘后加入磁珠10ug/ml的磁珠50 μ L，加入磁珠結(jié)合液50 μ L，混勻；5分鐘后磁鐵吸附磁珠，棄去上清液；加入磁珠洗滌液500 μ L，混勻后，磁鐵吸附磁珠，棄去上清液，洗滌3次；加入核酸洗脫液100 μ L，混勻；5分鐘后磁鐵吸附磁珠，將洗脫液轉(zhuǎn)移至新的ΕΡ管中，得到可用于PCR擴增的DNA溶液。
[0040]對比的傳統(tǒng)方法為:取培養(yǎng)16小時的大腸桿菌菌液2mL，5000r/min離心3min后棄上清；加生理鹽水0.lmL，混勻后加入1001^511101/1蛋白酶1(充分震蕩lOmin，加氯仿/異戊醇(24:1) 200 μ L震蕩30s，10000r/min離心5min，取上清100 μ L ;加異丙醇60 μ L輕輕混勾，10000r/min離心5min，棄上清；加冷無水乙醇lmL，10000r/min離心5min，棄無水乙醇(輕輕倒出，并倒置于濾紙上吸凈乙醇)，真空干燥后加30 μ L無菌超純水混勻溶解。
[0041]3.對試劑盒應用的效果檢測盒評價:
[0042]One-Drop 0D-1000分光光度計檢測核酸濃度及純度對上述洗脫液進行檢測，結(jié)果是，采用發(fā)明中的試劑盒提取培養(yǎng)16個小時的大腸桿菌的核酸的濃度和純度均較高，說明本發(fā)明提供的試劑盒能有效的提取細菌中的核酸。
[0043]另外，本發(fā)明試劑盒提取出的細菌核酸，在不經(jīng)過PCR的情況下，瓊脂糖凝膠電泳顯示出明顯的DNA條帶和RNA條帶，核酸濃度的平均值為220ng/ μ L，0D260/0D280平均值為1.78。說明本發(fā)明的試劑盒不僅操作簡單且有更高的提取效率。
[0044]對比的傳統(tǒng)方法使用氯仿等有機溶劑，對人的身體傷害大，與實施例1的磁珠法相比，提取細菌核酸的效率低，相同體積的菌液提取的核酸的濃度和純度都偏低，且耗時較長，還需使用多次咼心。
[0045]實施例2:
[0046]1.細菌中核酸提取試劑盒及其試劑的配制方法:同實施例1。
[0047]2.試劑盒的應用:
[0048]細菌培養(yǎng)同實施例1 ;
[0049]取大腸桿菌菌液1ml加入至EP管中，13000r/min離心2分鐘后，棄去上清液，加入細菌裂解液300 μ L，混勻；將上述液體加入96深孔反應板的1排、7排，并加入300 μ L乙醇；將磁珠100 μ L、磁珠結(jié)合液100 μ L、雙蒸水400 μ L加入至96深孔反應板的2排、8排；將磁珠洗滌液600 μ L加入至96深孔反應板的3-5排、9_11排；將核酸洗脫液100 μ L加入至96深孔反應板6排、12排；將96深孔反應板放至核酸提取儀中，設(shè)置裂解時間5分鐘，結(jié)合時間5分鐘，洗滌時間2分鐘，洗脫時間5分鐘，運行核酸提取儀；將洗脫液孔(6排、12排)內(nèi)的液體轉(zhuǎn)移至新的ΕΡ管中，得到可用于PCR擴增的DNA溶液。使用One-Drop 0D-1000分光光度計檢測核酸濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸提取效果。
[0050]對比的現(xiàn)有技術(shù)磁珠法一般為:取大腸桿菌菌液1ml加入至EP管中，13000r/min離心2分鐘后，棄上清，加入細菌裂解液200 μ 1，混勻；將上述液體加入96深孔反應板的1排、7排，將96深孔板放入儀器內(nèi)，裂解一段時間后，將儀器打開，將96深孔板取出，然后再向1排、7排中加入磁珠及磁珠結(jié)合液，2-5排、8-11排加入四種洗滌液，6排、12排加入洗脫液，將96深孔反應板放入核酸提取儀中，運行核酸提取儀，自動運行的提取儀在洗脫過程中需要加熱；結(jié)束后，將洗脫液孔6排、12排內(nèi)的液體轉(zhuǎn)移至新的ΕΡ管中，得到可用于PCR擴增的DNA溶液。
[0051]3.對試劑盒應用的效果檢測盒評價:
[0052]One-Drop 0D-1000分光光度計檢測核酸濃度及純度對上述洗脫液進行檢測，結(jié)果是，采用發(fā)明中的試劑盒提取培養(yǎng)16個小時的大腸桿菌的核酸的濃度和純度均較高，說明本發(fā)明提供的試劑盒能有效的應用核酸提取儀提取細菌中的核酸。
[0053]與現(xiàn)有技術(shù)磁珠法提取核酸的試劑盒相比，本實施例的試劑盒在洗脫時不需加熱；整個提取過程無需取出96孔板，放入96孔板后即可一步自動完成。
[0054]應理解，上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于供本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并非【具體實施方式】的窮舉，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。
【權(quán)利要求】
1.一種磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒，所述試劑盒中的試劑含有以下組分:細菌裂解液、磁珠結(jié)合液、磁珠洗滌液和核酸洗脫液，其特征在于: 所述細菌裂解液含有以下組分:十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷和氯化鈉； 所述磁珠結(jié)合液含有以下組分:聚乙二醇-8000和氯化鈉； 所述磁珠洗滌液含有以下組分:乙醇； 所述核酸洗脫液含有以下組分:三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒，其特征在于:在所述磁珠結(jié)合液中，聚乙二醇-8000的濃度為20-30mmol/L，氯化鈉的濃度為3mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒，其特征在于:在所述磁珠洗滌液中，乙醇的體積比濃度為70 % -90 %。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒，其特征在于:在所述核酸洗脫液中，三羥甲基氨基甲烷的濃度為5-15mmol/L，乙二胺四乙酸的濃度為1.30-1.SOmmoI /L
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒，其特征在于:所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為lOmmol/L，所述乙二胺四乙酸的濃度為1.35mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的磁珠法提取細菌中核酸的試劑盒，其特征在于:所述十二烷基硫酸鈉的濃度為40-60mmol/L，所述乙二胺四乙酸的濃度為20-40mmol/L，所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為90-115mmol/L，所述氯化鈉的濃度為480-520mmol/L，余量為無菌水；所述細菌裂解液通過加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至7.5-8.5。
7.—種磁珠法提取細菌中核酸的提取方法，其特征在于包括以下步驟: 步驟1:將細菌及培養(yǎng)液混合物離心分離，去上清除去細胞培養(yǎng)液，留下細菌菌體；離心分離的轉(zhuǎn)速為13000r/min，離心分離的時間為2min ； 步驟2:向菌體中加入細菌裂解液，混勻； 步驟3:加入磁珠及磁珠結(jié)合液，磁珠與核酸結(jié)合后，磁鐵吸附磁珠去上清； 步驟4:加入磁珠洗滌液，使用磁鐵吸附磁珠，去上清； 步驟5:加入核酸洗脫液，使用磁鐵吸附磁珠，轉(zhuǎn)移洗脫液，得到細菌的核酸溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的磁珠法提取細菌中核酸的提取方法，其特征在于:步驟2中加入的細菌裂解液的體積與細菌培養(yǎng)液的體積比為1:1-1:5，步驟3中加入的磁珠與磁珠結(jié)合液與細菌裂解液的體積比為1:10-1:20，步驟4中磁珠洗滌液與細菌裂解液的體積比為1:0.1-1:0.5，步驟5中核酸洗脫液與細菌裂解液的體積比為1:10-1:20。
9.一種磁珠法提取細菌中核酸的提取方法，其特征在于包括以下步驟: 步驟1:將細菌及培養(yǎng)液混合物離心分離，去上清除去細胞培養(yǎng)液，留下細菌菌體；離心分離的轉(zhuǎn)速為13000r/min，離心分離的時間為2min ； 步驟2:向菌體中加入細菌裂解液，混勻后，轉(zhuǎn)移至96孔反應板的I排和7排；在2排和8排加入磁珠及磁珠結(jié)合液；在3排、4排、5排和9排、10排、11排加入磁珠洗滌液；在6排和12排加入核酸洗脫液； 步驟3:將注入試劑的96孔反應板放入核酸提取儀，自動運行結(jié)束后得到細菌核酸洗脫液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的磁珠法提取細菌中核酸的提取方法，其特征在于:步驟2中注入96孔反應板的細菌裂解液的體積為200-300 μ L，與200-400 μ L無水乙醇混勻；注入的磁珠及磁珠結(jié)合液的體積為50-150 μ L，與300-400 μ L雙蒸水混勻；注入的磁珠洗滌液的體積為500-700 μ L ;注入的核酸洗脫液的體積為50-300 μ L。
【文檔編號】C12N15/10GK104450684SQ201410828555
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月26日
【發(fā)明者】王煒, 孟慶海, 李智洋, 何農(nóng)躍, 曲文靜 申請人:南京中科神光科技有限公司