生物反應(yīng)芯片及其在pcr反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物反應(yīng)芯片及其在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用。所涉及的生物反應(yīng)芯片包括主體板，所述主體板上開設(shè)有多級(jí)反應(yīng)槽，每級(jí)反應(yīng)槽中可容納生物反應(yīng)試劑的量不同。將多級(jí)反應(yīng)槽按可容納生物反應(yīng)試劑的量從大到小排序，相鄰級(jí)的反應(yīng)槽可容納生物反應(yīng)試劑的體積量比為定值。本發(fā)明提供的生物反應(yīng)芯片在進(jìn)行PCR反應(yīng)定量檢測(cè)時(shí)無(wú)需定量標(biāo)準(zhǔn)品，可以進(jìn)行溶液核酸濃度的定量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸分子進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】生物反應(yīng)巧片及其在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生化領(lǐng)域試驗(yàn)用儀器，具體設(shè)及一種生物反應(yīng)巧片及其在PCR反應(yīng)中 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)是一種簡(jiǎn)單、高效、特異性強(qiáng)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。經(jīng) 過(guò)30多年的發(fā)展已經(jīng)衍生出了多種多樣的擴(kuò)增流程，如實(shí)時(shí)巧光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (RT-qPCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP)、指數(shù)后線性擴(kuò)增PCR技術(shù)（LATE-PCR)等。該些技 術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，使得PCR技術(shù)逐步成為分子生物學(xué)應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，特別是在 病原微生物鑒定方面，實(shí)現(xiàn)了快速而又高特異性鑒別。因此，在各衛(wèi)生防疫部口、檢驗(yàn)檢疫 中屯、實(shí)驗(yàn)室廣泛配置了 PCR定量裝置。然而，類似實(shí)時(shí)巧光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR) 的定量體系，必須使用標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行的是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度的相對(duì)定量，而且由于檢測(cè)精密 度要求高，巧光定量檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)備昂貴、環(huán)境要求高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明的目的之一是提供一種生物反應(yīng)巧片。
[0004] 為此，本發(fā)明提供的生物反應(yīng)巧片包括主體板，所述主體板上開設(shè)有多級(jí)反應(yīng)槽， 每級(jí)反應(yīng)槽中可容納生物反應(yīng)試劑的量不同。
[0005] 進(jìn)一步，將多級(jí)反應(yīng)槽按可容納生物反應(yīng)試劑的量從大到小排序，相鄰級(jí)的反應(yīng) 槽可容納生物反應(yīng)試劑的體積量比為定值。
[0006] 優(yōu)選的，相鄰級(jí)的反應(yīng)槽可容納生物反應(yīng)試劑的體積量比大于等于5。
[0007] 更優(yōu)選的，相鄰級(jí)的反應(yīng)槽可容納生物反應(yīng)試劑的體積量比為5-20。
[000引更進(jìn)一步，每級(jí)反應(yīng)槽包括若干個(gè)單體反應(yīng)槽，且每級(jí)反應(yīng)槽包括的單體反應(yīng)槽 個(gè)數(shù)相同或不同，同一級(jí)反應(yīng)槽中的若干個(gè)單體反應(yīng)槽之間相互獨(dú)立且彼此可容納的生物 反應(yīng)試劑的量相同。
[0009] 可選的，每級(jí)反應(yīng)槽中單體反應(yīng)槽的個(gè)數(shù)為5-20。一般相鄰級(jí)的反應(yīng)槽體積量比 越小每級(jí)反應(yīng)槽個(gè)數(shù)取值越大。
[0010] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明的目的之二是提供上述生物反應(yīng)巧片在PCR 反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0011] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明的目的之S是提供上述生物反應(yīng)巧片在PCR 反應(yīng)絕對(duì)定量檢測(cè)中的應(yīng)用。
[001引為此，本發(fā)明提供的生物反應(yīng)巧片在PCR反應(yīng)定量檢測(cè)中的應(yīng)用包括：
[0013] 將待測(cè)樣品和PCR反應(yīng)試劑裝載在上述生物反應(yīng)巧片中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，讀 取數(shù)據(jù)和計(jì)算待測(cè)樣品中被測(cè)物質(zhì)的含量；
[0014] 所述讀取數(shù)據(jù)為讀取每級(jí)反應(yīng)槽中呈陽(yáng)性的單體反應(yīng)槽的個(gè)數(shù)，其中第i級(jí)反應(yīng) 槽中呈陽(yáng)性的單體反應(yīng)槽的個(gè)數(shù)為a;，i = 1，2, 3,…，I ;1 > 2, 1 ;
[0015] 利用（式1)計(jì)算待測(cè)樣品中被測(cè)物質(zhì)的含量c: 口 / 巧
[0016] 之W =以=1 n,' . Uj (式 1)
[0017] 其中；
[001引 Vi為第i級(jí)反應(yīng)槽的單體反應(yīng)槽的體積，V i取值范圍；1化-lOOuL ;
[0019] 叫為第i級(jí)反應(yīng)槽的單體反應(yīng)槽的個(gè)數(shù)，n 2。
[0020] 所述的待測(cè)樣品為病原微生物核酸。
[0021] 待測(cè)樣品中被測(cè)物質(zhì)含量的校準(zhǔn)值(；。。1為：
[00巧 Creal= C ? Rs，其中Rs為PCR反應(yīng)的最小檢出限。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0024] 1、本發(fā)明提供的生物反應(yīng)巧片無(wú)需定量標(biāo)準(zhǔn)品，可W進(jìn)行溶液核酸濃度的定量檢 測(cè)。
[0025] 2、利用本發(fā)明的生物反應(yīng)巧片進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，定量檢測(cè)的濃度由檢測(cè)數(shù)值直接 獲得，因此為溶液核酸的絕對(duì)濃度。與現(xiàn)有技術(shù)依賴定量標(biāo)準(zhǔn)品所獲得的相對(duì)溶液濃度值 相比，具有更高的可靠性。
[0026] 3、本發(fā)明提供的生物反應(yīng)巧片，與現(xiàn)有PCR定量檢測(cè)技術(shù)相比具有裝置小、便攜 性強(qiáng)、檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為實(shí)施例1提供的生物反應(yīng)巧片的結(jié)構(gòu)示意圖（單位：毫米）；
[002引圖2為實(shí)施例2的方法流程示意圖；
[0029] 圖3為對(duì)比例的結(jié)果對(duì)比分析圖；該圖中的CHIP表示本發(fā)明巧片的校正前結(jié)果 C，CHIP C0R表示本發(fā)明巧片的校正后結(jié)果Cud，兩者相差Rs倍。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 本發(fā)明的主體板的材質(zhì)為可W用于生物反應(yīng)的材質(zhì)，例如 PDMS(?olydimet的Isiloxane)。可選的，PDMS材質(zhì)的巧片制成后，采用臭氧等離子進(jìn)行表 面處理，使之表面具有親水性，有利于樣本和PCR反應(yīng)液進(jìn)入反應(yīng)孔。
[0031] 可選的，本發(fā)明的主體板為圓形板、S角形板、方形板或楠圓形板W及中屯、對(duì)稱的 板型。
[0032] 可選的，本發(fā)明的單體反應(yīng)槽為圓形反應(yīng)槽或方形反應(yīng)槽。
[0033] 進(jìn)一步可選的，本發(fā)明的主體板為圓形板，所述單體反應(yīng)槽為圓形反應(yīng)槽。
[0034] 本發(fā)明的主體板上開設(shè)有至少兩級(jí)反應(yīng)槽。
[0035] 本發(fā)明提供的上述生物反應(yīng)巧片在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用包括；
[0036] 將生物反應(yīng)試劑裝載于生物反應(yīng)巧片的各級(jí)反應(yīng)槽中，且各級(jí)反應(yīng)槽的裝載量為 飽和狀態(tài)（裝滿）；
[0037] 在設(shè)有反應(yīng)槽的主體板面上加蓋反應(yīng)蓋；
[003引將裝載有生物反應(yīng)試劑和加蓋有反應(yīng)蓋的巧片置于合適的溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增 反應(yīng)。
[0039] 可選的，將生物反應(yīng)巧片置于離屯、鍛膜機(jī)上，將足夠量生物反應(yīng)試劑置于主體板 上，通過(guò)離屯、鍛膜機(jī)的離屯、作用將生物反應(yīng)試劑裝載于各級(jí)反應(yīng)槽中?？蛇x的，所述主體板 的底面貼有封閉薄膜?？蛇x的，所述反應(yīng)蓋為表面涂覆有PDMS的載玻片。可選的，所述封 閉薄膜為PC防水材料。
[0040] 本發(fā)明的生物反應(yīng)巧片適用于其他任何PCR衍生流程，包括巧光PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增技術(shù)（LAMP)、指數(shù)后線性擴(kuò)增PCR技術(shù)（LATE-PCR)等。
[0041] 本發(fā)明所述的最小檢出限Rs取決于擴(kuò)增方法（PCR衍生流程）有關(guān)系，氏的取值 范圍一般是是大于等于1小于等于10。具體如使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP) Rs為1到 5,指數(shù)后線性擴(kuò)增PCR技術(shù)（LATE-PCR)Rs為5左右，巧光PCR技術(shù)Rs為10左右。例如； 采用已定量的己肝核酸標(biāo)準(zhǔn)品（lOOOcopies/mL)梯度稀釋，使用擬采用的擴(kuò)增方法（LAMP) 和試劑體系進(jìn)行等體積批量擴(kuò)增（lOuL)(濃度較小、稀釋可能有誤差，每一種濃度都擴(kuò)增2 個(gè)8連管，共16管），取觀察能夠到的最小濃度為Rs。
[0042] 本發(fā)明（式1)推導(dǎo)過(guò)程如下；
[0043] 設(shè)生物反應(yīng)巧片中由內(nèi)到外分為多級(jí)反應(yīng)槽（反應(yīng)槽的級(jí)數(shù)大于等于2, 一般其 取值越大，精度越大），每級(jí)有若干個(gè)反應(yīng)體積相同的單體反應(yīng)槽，巧片上所有單體反應(yīng)槽 體積之和為V。
[0044] 在檢測(cè)靈敏度Rs范圍內(nèi)，溶液體積V(V表示所有孔中溶液的總體積）中只有一個(gè) 核酸分子，且不在一個(gè)孔內(nèi)（第i級(jí)第j孔）的概率為：
[0045] Psi = 1 -脊;i二1，2,…，ffl: j二1，2，…，n: V。表示第i級(jí)第j孔的體積。
[0046] 假設(shè)有k個(gè)核酸分子在V體積的溶液內(nèi)，因此，樣品溶液的絕對(duì)濃度為： /c
[0047] C 二一
[0048] 一個(gè)孔內(nèi)（第i級(jí)第j孔）不含有任何核酸分子的概率為：
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種生物反應(yīng)芯片，包括主體板，其特征在于，所述主體板上開設(shè)有多級(jí)反應(yīng)槽，每 級(jí)反應(yīng)槽中可容納生物反應(yīng)試劑的量不同。
2. 如權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)芯片，其特征在于，將多級(jí)反應(yīng)槽按可容納生物反應(yīng) 試劑的量從大到小排序，相鄰級(jí)的反應(yīng)槽可容納生物反應(yīng)試劑的體積量比為定值。
3. 如權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)芯片，其特征在于，相鄰級(jí)的反應(yīng)槽可容納生物反應(yīng) 試劑的體積量比大于等于5。
4. 如權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)芯片，其特征在于，相鄰級(jí)的反應(yīng)槽可容納生物反應(yīng) 試劑的體積量比為5-20。
5. 如權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)芯片，其特征在于，每級(jí)反應(yīng)槽包括若干個(gè)單體反應(yīng) 槽，且每級(jí)反應(yīng)槽包括的單體反應(yīng)槽個(gè)數(shù)相同或不同，同一級(jí)反應(yīng)槽的若干個(gè)單體反應(yīng)槽 之間相互獨(dú)立且彼此可容納的生物反應(yīng)試劑的量相同。
6. 如權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)芯片，其特征在于，每級(jí)反應(yīng)槽中單體反應(yīng)槽的個(gè)數(shù) 為 5-20。
7. 權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述生物反應(yīng)芯片在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述生物反應(yīng)芯片在PCR反應(yīng)絕對(duì)定量檢測(cè)中的應(yīng) 用，包括： 將待測(cè)樣品和PCR反應(yīng)試劑裝載于權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的生物反應(yīng)芯片 中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，讀取數(shù)據(jù)和計(jì)算待測(cè)樣品中被測(cè)物質(zhì)的含量； 所述讀取數(shù)據(jù)為讀取每級(jí)反應(yīng)槽中呈陽(yáng)性的單體反應(yīng)槽的個(gè)數(shù)，其中第i級(jí)反應(yīng)槽中 呈陽(yáng)性的單體反應(yīng)槽的個(gè)數(shù)為i = 1，2, 3,…，I ;1彡2, ai> 1 ; 剎用（式I) i+筧待測(cè)樣品中被測(cè)物質(zhì)的含量C :
其中： Vi為第i級(jí)反應(yīng)槽的單體反應(yīng)槽的體積，V i取值范圍：InL-IOOuL ; Iii為第i級(jí)反應(yīng)槽的單體反應(yīng)槽的個(gè)數(shù)，n 2。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，待測(cè)樣品中被測(cè)物質(zhì)含量的校準(zhǔn)值C Mal為： CMal= C · Rs，其中RsSPCR反應(yīng)的最小檢出限。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104513786SQ201410828349
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月26日
【發(fā)明者】閆永平, 高潔, 王波, 肖丹, 張磊, 王安輝 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)