一種用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液收集方法和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液收集方法，受試者霧化吸入支氣管擴張劑，停留靜脈留置針，在所述的肺泡灌洗液收集的整個過程中鼻導管持續(xù)給氧，同時監(jiān)測經皮氧飽和度，根據(jù)所述的經皮氧飽和度判斷受試者生命體征；上鼻道和咽喉部予2％利多卡因進行表面麻醉，隨后靜脈注射咪達唑侖2～10mg和阿芬太尼125～500mg；步驟3：纖維支氣管鏡通過鼻道進到聲門區(qū)，予4％利多卡因麻醉聲門區(qū)。本發(fā)明旨在提供一種安全、簡便、污染少、重復性好的用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液收集方法及其檢測方法。
【專利說明】一種用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液收集方 法和檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，特別是一種用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗 液收集方法和檢測方法。

【背景技術】
[0002] 吸道微生物群系研宄是一個相對較新的領域，16S rRNA基因序列分析是目前常用 于鑒定細菌菌種的分子檢測技術，已被廣泛應用于環(huán)境以及臨床標本的研宄，呼吸道微生 物群系研宄是一個相對較新的領域。16S rRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA 序列，存在于所有細菌的染色體基因組中，該技術的基本原理是從微生物樣本中獲取16S rRNA的基因片段，通過克隆、測序或酶切、探針雜交獲得16S rRNA序列信息，再與16S rRNA 數(shù)據(jù)庫中的序列數(shù)據(jù)或其他數(shù)據(jù)進行比較，確定其在進化樹中位置，從而鑒定樣本中可能 存在的微生物種類。因此，相對于傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)技術，16S rRNA序列分析能夠準確鑒定出 細菌的種屬，并顯示該種細菌在某部位的相對豐度。
[0003] 支氣管肺泡灌洗液是通過纖維支氣管鏡對支氣管以下肺段或亞肺段水平，反復以 無菌生理鹽水灌洗、回收而獲得。如何針對獲得的肺泡灌洗液進行針對性的DNA分析是檢 測肺泡16SrRNA基因序列分析的前提。目前，國內還缺乏獲取16S rRNA基因序列分析的有 效肺泡灌洗液標本的收集方法。鑒于16S rRNA基因序列分析技術的重要性，而支氣管肺泡 灌洗液是檢測下呼吸道菌群最準確、受口腔污染最少的標本，以及我國目前尚沒有針對用 于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液收集方法，提供一種有效可靠的用于呼吸道細菌 16S rRNA基因序列檢測的肺泡灌洗液收集方法十分必要。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明旨在提供一種安全、簡便、污染少、重復性好的16S rRNA基因檢測的支氣 管肺泡灌洗液收集和檢測的方法，具體涉及一種獲取肺泡灌洗液及進行基因組DNA提取與 16S rRNA基因序列分析。本發(fā)明針對獲取肺泡灌洗液、進行基因組DNA提取與16S rRNA基 因序列分析的要求，提供一種用于16S rRNA基因序列分析的肺泡灌洗液的收集和檢測的方 法。
[0005] 本發(fā)明提供的技術方案為：一種用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液收 集方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0006] 步驟1 :受試者霧化吸入支氣管擴張劑可必特（復方異丙托溴銨溶液）2. 5ml，停留 靜脈留置針，在所述的肺泡灌洗液收集的整個過程中鼻導管持續(xù)給氧，同時監(jiān)測經皮氧飽 和度心率等，了解機體缺氧狀況并作出及時正確的評估和處理；
[0007] 步驟2 :上鼻道和咽喉部予2%利多卡因5ml氧氣霧化進行表面麻醉，隨后靜脈注 射咪達挫侖2?IOmg和阿芬太尼125?500mg ;
[0008] 步驟3 :纖維支氣管鏡通過鼻道進到聲門區(qū)，予2%利多卡因2-5ml麻醉聲門區(qū)；
[0009] 步驟4 :將支氣管鏡送入主氣管，左右主支氣管各注入2%的利多卡因溶液2-3ml 后，將支氣管鏡楔入右肺中葉肺段M并固定；
[0010] 步驟5 :通過50ml注射器將室溫生理鹽水50ml緩慢注入右肺中葉完畢后立即以 2. 5?3. 5ml/S勻速抽吸進行第一次肺泡灌洗，并收集第一次灌洗液；
[0011] 步驟6 :取另一支50ml注射器將室溫生理鹽水50ml緩慢注入右肺中葉完畢后立 即以2. 5?3. 5ml/S勻速抽吸進行第二次肺泡灌洗，并收集第二次灌洗液。
[0012] 步驟7 :將第一次灌洗液和第二次灌洗液進行混合。
[0013] 在上述的用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液收集方法中，所述的步驟5 和步驟6中，注射器的規(guī)格均為50ml。
[0014] 本發(fā)明還提供一種用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液檢測方法，包括以 下步驟：
[0015] 步驟1 :將離體的肺泡灌洗液離心分離得到沉淀物，所述的沉淀物為離體的肺泡 灌洗液沉淀物標本；
[0016] 步驟2 :提取離體的肺泡灌洗液沉淀物標本中的DNA，得到DNA標本；
[0017] 步驟3 :對DNA標本進行電泳，判斷DNA的濃度和降解程度，獲得用于16S rRNA基 因序列分析的離體的肺泡灌洗液質量的評價指標；
[0018] 步驟4 :對經過步驟4檢測的DNA標本進行文庫構建；
[0019] 在上述的用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液檢測方法中，步驟2具體包 括以下子步驟：
[0020] 子步驟21 :離體的肺泡灌洗液沉淀物標本中分別先后加入430?434 μ I TE緩沖 液及17?19 μ 1含溶菌酶的工作液；
[0021] 子步驟 22 :37±1°C 水浴 50 ?70min ;
[0022] 子步驟23 :分別先后加入29?31 μ 1蛋白酶K及440?460 μ I AL緩沖液；
[0023] 子步驟 24 :56±1°C 水浴 25 ?35min 后 95±1°C 水浴 4 ?6min ;
[0024] 子步驟25 :加入濃度為99. 9%的無水酒精440?460 μ 1后靜置得到懸濁液；
[0025] 子步驟26 :將混懸液轉移到Qiagen分離管中；
[0026] 子步驟27 :離心，收集濾過的DNA ;
[0027] 子步驟28 :加入洗滌劑洗滌DNA ;
[0028] 子步驟29 :溶解洗滌后的DNA并在-20°C條件下保存。
[0029] 優(yōu)選地，上述步驟2的子步驟具體為：
[0030] 子步驟21 :離體的肺泡灌洗液沉淀物標本中分別先后加入432 μ I TE緩沖液及 18 μ 1含溶菌酶的工作液；
[0031] 子步驟 22 :37±1°C 水浴 60min ;
[0032] 子步驟23 :分別先后加入29?31 μ 1蛋白酶K及450 μ I AL緩沖液；
[0033] 子步驟 24 :56±1°C 水浴 30min 后 95±1°C 水浴 5min ;
[0034] 子步驟25 :加入濃度為99. 9%的無水酒精450 μ 1后靜置得到懸濁液；
[0035] 子步驟26 :將混懸液轉移到Qiagen分離管中；
[0036] 子步驟27 :離心，收集濾過的DNA ;
[0037] 子步驟28 :加入洗滌劑洗滌DNA ;
[0038] 子步驟29 :溶解洗滌后的DNA并在-20°C條件下保存。
[0039] 在上述的用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液檢測方法中，所述的離體的 肺泡灌洗液通過以下步驟獲取：
[0040] 步驟1 :受試者霧化吸入支氣管擴張劑，停留靜脈留置針，整個過程鼻導管持續(xù)給 氧，同時監(jiān)測經皮氧飽和度；
[0041] 步驟2 :上鼻道和咽喉部予2%利多卡因進行表面麻醉，隨后靜脈注射咪達唑侖 2?IOmg和阿芬太尼125?500mg ;
[0042] 步驟3 :纖維支氣管鏡通過鼻道進到聲門區(qū)，予4%利多卡因麻醉聲門區(qū)；
[0043] 步驟4:將支氣管鏡送入氣管，進一步注入2%的利多卡因溶液后，將支氣管鏡楔 入右肺中葉肺段并固定；
[0044] 步驟5 :通過注射器將溫生理鹽水50ml緩慢注入右肺中葉完畢后立即以中等力度 勻速抽吸進行第一次肺泡灌洗，并收集第一次灌洗液；
[0045] 步驟6 :取另一支注射器將溫生理鹽水50ml緩慢注入右肺中葉完畢后立即以中等 力度勻速抽吸進行第二次肺泡灌洗，并收集第二次灌洗液。
[0046] 步驟7 :將第一次灌洗液和第二次灌洗液進行混合。
[0047] 本發(fā)明提供一種16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液的檢測分析技術，其準確 性高，針對性強，并且干擾項少。
[0048] 更重要的是，本發(fā)明所提供的肺泡灌洗技術，采用纖維支氣管鏡下楔入右中葉肺 段用溫生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗并抽吸獲取灌洗液，提取灌洗液基因組DNA，進行電泳 判斷DNA質量及16S rRNA基因序列分析驗證灌洗液基因組DNA，并評價該種方法的可靠性。
[0049] 經實驗檢測、分析，結果顯示，基因組DNA濃度及完整性得到保證，未出現(xiàn)明顯的 降解（詳見附圖1)，對所得樣品進行焦磷酸測序并進行相應的生物信息分析。提示，使用該 種方法對收集的肺泡灌洗液能夠完全滿足16S rRNA基因序列分析技術的要求。
[0050] 本發(fā)明所采用的肺泡灌洗技術而獲得的肺泡灌洗液能夠完全滿足16S rRNA基因 序列分析技術上的要求，該方法在操作上具有安全、簡便、重復性好及可反應下呼吸道細菌 菌群組成的標本，對于肺泡灌洗液標本具有污染少、DNA濃度較高和基因組DNA無明顯降解 的特點。該方法可以用于需要16S rRNA基因序列分析的肺泡灌洗液的獲取。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0051] 圖1為本實施例1中1例DNA標本電泳結果。

【具體實施方式】
[0052] 下面結合【具體實施方式】，對本發(fā)明的技術方案作進一步的詳細說明，但不構成對 本發(fā)明的任何限制。
[0053] 實施例1
[0054] 1、病例收集
[0055] 研宄對象為受試者者1例。
[0056] 2、主要儀器與試劑：
[0057] 氯化鈉；生理鹽水（東莞普濟藥業(yè)有限公司）、HE染色液、痰液基因組DNA提取 試劑盒、超聲霧化器、低溫冰箱；TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）、電子天平（德國 Sartorius公司）；精密移液器（法國GILSON公司）；顯微鏡、肺功能儀、全自動細胞涂片儀、 QubilK 2. O熒光計、瓊脂糖、電泳儀、纖維支氣管鏡（Olympus BF 10)。
[0058] 3、肺泡灌洗液收集、保存和檢測
[0059] 對上述研宄對象按以下步驟進行肺泡灌洗液收集。
[0060] 步驟1 :收集支氣管肺泡灌洗液；
[0061] 子步驟11 :受試者霧化吸入支氣管擴張劑，停留靜脈留置針，整個過程鼻導管持 續(xù)給氧，同時監(jiān)測經皮氧飽和度，如果經皮氧飽和度在預設范圍外，則為受視者安全考慮 暫停測試；
[0062] 子步驟12 :上鼻道和咽喉部予2%利多卡因 5ml氧氣霧化進行表面麻醉，隨后靜脈 注射咪達挫侖2?IOmg和阿芬太尼125?500mg ;
[0063] 子步驟13 :纖維支氣管鏡通過鼻道進到聲門區(qū)，予2%利多卡因 2-5ml麻醉聲門 區(qū)；
[0064] 子步驟14:將支氣管鏡送入主氣管，左右主支氣管各注入2%的利多卡因溶液 2-3ml后，將支氣管鏡楔入右肺中葉肺段M并固定；
[0065] 子步驟15 :通過50ml注射器將室溫生理鹽水50ml緩慢注入右肺中葉完畢后立即 以2. 5?3. 5ml/S勻速抽吸進行第一次肺泡灌洗，并收集第一次灌洗液；
[0066] 子步驟16 :取另一支50ml注射器將室溫生理鹽水50ml緩慢注入右肺中葉完畢后 立即以2. 5?3. 5ml/S勻速抽吸進行第二次肺泡灌洗，并收集第二次灌洗液。
[0067] 子步驟17 :將第一次灌洗液和第二次灌洗液進行混合。
[0068] 步驟2 :將步驟1得到的肺泡灌洗液離心分離得到沉淀物，所述的沉淀物為肺泡灌 洗液沉淀物標本；
[0069] 步驟3 :提取肺泡灌洗液沉淀物標本中的DNA，得到DNA標本；
[0070] 其具體為：
[0071 ] 離體的肺泡灌洗液沉淀物標本中分別先后加入432 μ I TE緩沖液及18 μ 1含溶菌 酶的工作液；37±1°C水浴60min ;分別先后加入29?31 μ 1蛋白酶K及450 μ I AL緩沖 液；56± 1°C水浴30min后95± 1°C水浴5min ;加入濃度為99. 9%的無水酒精450 μ 1后靜 置得到懸濁液；：將混懸液轉移到Qiagen分離管中；離心，收集濾過的DNA ;加入洗滌劑洗 滌DNA ;溶解洗滌后的DNA并在-20°C條件下保存。
[0072] 步驟4 :對DNA標本進行電泳，判斷DNA的濃度和降解程度，獲得用于16S rRNA基 因序列分析的肺泡灌洗液質量的評價指標；
[0073] 如圖1的分析結果顯示：該肺泡灌洗液標本能成功提取基因組DNA，經過DNA濃度 分析及瓊脂糖電泳判定后質量均為A級。在本實施例中所述的A類指的是質量滿足建庫測 序要求，且總量可以滿足2次或者2次以上建庫需要的樣品。
[0074] 步驟5 :對經過步驟4檢測的DNA標本進行文庫構建；
[0075] 首先使用融合引物進行PCR擴增，然后使用磁珠篩選片段，最后，用合格的文庫進 行EmPCR擴增和通過Roche 454FLX+平臺對全部樣品進行焦磷酸測序。待數(shù)據(jù)下機后進行 相應的生物信息分析。
[0076] 如表1所示，
[0077] 表 I
[0078]

【權利要求】
1. 一種用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液收集方法，其特征在于，包括以下 步驟： 步驟1 :受試者霧化吸入支氣管擴張劑可必特復方異丙托溴銨溶液2. 5ml，停留靜脈留 置針，在所述的肺泡灌洗液收集的整個過程中鼻導管持續(xù)給氧，同時監(jiān)測經皮氧飽和度心 率，根據(jù)機體缺氧狀況做出相應處理； 步驟2 :上鼻道和咽喉部予2%利多卡因5ml氧氣霧化進行表面麻醉，隨后靜脈注射咪 達挫侖2?10mg和阿芬太尼125?500mg ; 步驟3 :纖維支氣管鏡通過鼻道進到聲門區(qū)，予2%利多卡因2?5ml麻醉聲門區(qū)； 步驟4 :將支氣管鏡送入主氣管，左右主支氣管各注入2%的利多卡因溶液2-3ml后，將 支氣管鏡楔入右肺中葉肺段B4并固定； 步驟5 :通過50ml注射器將室溫生理鹽水50ml緩慢注入右肺中葉完畢后立即以2. 5? 3. 5ml/S勻速抽吸進行第一次肺泡灌洗，并收集第一次灌洗液； 步驟6 :取另一支50ml注射器將室溫生理鹽水50ml緩慢注入右肺中葉完畢后立即以 2. 5?3. 5ml/S勻速抽吸進行第二次肺泡灌洗，并收集第二次灌洗液。 步驟7 :將第一次灌洗液和第二次灌洗液進行混合。
2. 根據(jù)權利要求1所述的用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液收集方法，其特 征在于，所述的步驟5和步驟6中，注射器的規(guī)格均為50ml。
3. -種用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液檢測方法，其特征在于，包括以下 步驟： 步驟1 :將離體的肺泡灌洗液離心分離得到沉淀物，所述的沉淀物為離體的肺泡灌洗 液沉淀物標本； 步驟2 :提取離體的肺泡灌洗液沉淀物標本中的DNA，得到DNA標本； 步驟3 :對DNA標本進行電泳，判斷DNA的濃度和降解程度，獲得用于16S rRNA基因序 列分析的離體的肺泡灌洗液質量的評價指標； 步驟4 :對經過步驟4檢測的DNA標本進行文庫構建。
4. 根據(jù)權利要求3所述的用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液檢測方法，其特 征在于，步驟2具體包括以下子步驟： 子步驟21 :離體的肺泡灌洗液沉淀物標本中分別先后加入430?434 y 1 TE緩沖液及 17?19 y 1含溶菌酶的工作液； 子步驟22 :37±1°C水浴50?70min ; 子步驟23 :分別先后加入29?31 y 1蛋白酶K及440?460 y 1 AL緩沖液； 子步驟24 :56 ± 1 °C水浴25?35min后95 ± 1 °C水浴4?6min ; 子步驟25 :加入濃度為99. 9 %的無水酒精440?460 y 1后靜置得到懸濁液； 子步驟26 :將混懸液轉移到Qiagen分離管中； 子步驟27 :離心，收集濾過的DNA ; 子步驟28 :加入洗滌劑洗滌DNA ; 子步驟29 :溶解洗滌后的DNA并在-20°C條件下保存。
5. 根據(jù)權利要求3所述的用于16S rRNA基因檢測的支氣管肺泡灌洗液檢測方法，其特 征在于，所述的離體的肺泡灌洗液通過以下步驟獲取： 步驟1 :受試者霧化吸入支氣管擴張劑可必特復方異丙托溴銨溶液2. 5ml，停留靜脈留 置針，在所述的肺泡灌洗液收集的整個過程中鼻導管持續(xù)給氧，同時監(jiān)測經皮氧飽和度心 率，根據(jù)機體缺氧狀況做出相應處理； 步驟2 :上鼻道和咽喉部予2%利多卡因5ml氧氣霧化進行表面麻醉，隨后靜脈注射咪 達挫侖2?10mg和阿芬太尼125?500mg ; 步驟3 :纖維支氣管鏡通過鼻道進到聲門區(qū)，予2%利多卡因2-5ml麻醉聲門區(qū)； 步驟4 :將支氣管鏡送入主氣管，左右主支氣管各注入2%的利多卡因溶液2-3ml后，將 支氣管鏡楔入右肺中葉肺段B4并固定； 步驟5 :通過50ml注射器將室溫生理鹽水50ml緩慢注入右肺中葉完畢后立即以2. 5? 3. 5ml/S勻速抽吸進行第一次肺泡灌洗，并收集第一次灌洗液； 步驟6 :取另一支50ml注射器將室溫生理鹽水50ml緩慢注入右肺中葉完畢后立即以 2. 5?3. 5ml/S勻速抽吸進行第二次肺泡灌洗，并收集第二次灌洗液。 步驟7 :將第一次灌洗液和第二次灌洗液進行混合。
【文檔編號】C12Q1/24GK104480209SQ201410795346
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月18日 優(yōu)先權日:2014年12月18日
【發(fā)明者】張清玲, 李乃健, 邱日皇, 李時悅 申請人:張清玲, 李乃健, 邱日皇, 李時悅