一種用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的痰液收集方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于呼吸道細菌16S rRNA基因序列檢測的痰液收集方法，包括以下步驟：步驟1：測基礎(chǔ)第一秒用力肺活量FEV1；步驟2：吸入200ug沙丁胺醇氣霧劑；步驟3：擤鼻和0.9％滅菌生理鹽水漱口；步驟4：3％滅菌鹽水霧化誘導10min后停止霧化，以0.9％滅菌生理鹽水漱口3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培養(yǎng)皿；步驟5：分別用4％及5％滅菌鹽水霧化重復上述步驟，收集深部痰；步驟6：分離出步驟4～5所收集的深部痰的痰栓并低溫保存。本發(fā)明旨在提供一種受口腔污染小、簡便的用于呼吸道細菌16S rRNA基因序列檢測的痰液收集方法。
【專利說明】-種用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的痰液收集方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域，特別是一種用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的 痰液收集方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 吸道微生物群系研究是一個相對較新的領(lǐng)域，16SrRNA基因序列分析是目前常用 于鑒定細菌菌種的分子檢測技術(shù)，已被廣泛應用于環(huán)境以及臨床標本的研究，呼吸道微生 物群系研究是一個相對較新的領(lǐng)域。16SrRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA 序列，存在于所有細菌的染色體基因組中，該技術(shù)的基本原理是從微生物樣本中獲取16S rRNA的基因片段，通過克隆、測序或酶切、探針雜交獲得16SrRNA序列信息，再與16SrRNA 數(shù)據(jù)庫中的序列數(shù)據(jù)或其他數(shù)據(jù)進行比較，確定其在進化樹中位置，從而鑒定樣本中可能 存在的微生物種類。因此，相對于傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)技術(shù)，16SrRNA序列分析能夠準確鑒定出 細菌的種屬，并顯示該種細菌在某部位的相對豐度。
[0003] 如何獲得高質(zhì)量下呼吸道痰液標本，是檢測呼吸道16SrRNA基因序列分析的前 提。目如，國內(nèi)還缺乏獲取16SrRNA基因序列分析的有效疲液標本的收集方法。漱口后直 接咳出痰液，放置于無菌培養(yǎng)瓶中，是目前臨床留取痰液、進行細菌培養(yǎng)的常用收集方法， 具有容易受到口腔唾液及口腔細菌污染、標本量少及痰液鱗狀上皮細胞較多等缺點。鑒于 誘導痰16SrRNA基因序列分析技術(shù)的重要性，以及現(xiàn)有獲取痰液的固有缺陷，提供一種有 效可靠的用于16SrRNA基因序列檢測的痰液收集方法十分必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供受口腔污染小、簡便的用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的痰液 收集方法。
[0005] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的痰液 收集方法，包括以下步驟：
[0006] 步驟1 :測基礎(chǔ)第一秒用力肺活量FEVl;
[0007] 步驟2 :吸入沙丁胺醇氣霧劑；
[0008] 步驟3 :擤鼻和0? 9%滅菌生理鹽水漱口 3次；
[0009] 步驟4 :3 %滅菌鹽水霧化誘導IOmin后停止霧化，咳出第一口痰及唾液丟棄，再次 以0. 9%滅菌生理鹽水漱口 3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培養(yǎng)皿；
[0010] 步驟：5 :4%滅菌鹽水霧化誘導IOmin后停止霧化，再次以0. 9 %滅菌生理鹽水漱 口 3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培養(yǎng)皿；
[0011] 步驟6 :5%滅菌鹽水霧化誘導IOmin后停止霧化，再次以0. 9%滅菌生理鹽水漱口 3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培養(yǎng)皿；
[0012] 步驟7 :分離出步驟4?6所收集的深部痰的痰栓并低溫保存。
[0013] 在此必須要說明的是：用力肺活量（forcedvitalcapacity,FVC)過去稱時間肺 活量，是指盡力最大吸氣后，盡力盡快呼氣所能呼出的最大氣量。略小于沒有時間限制條件 下測得的肺活量。該指標是指將測定肺活量的氣體用最快速呼出的能力。其中，開始呼氣 第一秒內(nèi)的呼出氣量為一秒鐘用力呼氣容積，又稱第一秒用力肺活量（forcedexpiratory volumeinonesecond,FEVL0)，其臨床應用較廣，常以FEVL0/FVC%表示。
[0014] 在上述的用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的痰液收集方法中，所述的步驟 2結(jié)束后，還包括：
[0015] 步驟8 :15min后檢測FEVl和用力肺活量FVC;
[0016]若FEV1/FVC蘭60 %，則進行步驟3;
[0017] 若 60 % >FEV1/FVC 芎 50 %，且 FEVl 芎 1L，則進行步驟 9 ;
[0018]若FEV1/FVC< 50%;或 60% >FEV1/FVC蘭 50%，且FEV1〈1L，則終止深部痰收集；
[0019] 所述的步驟9為：擤鼻和0. 9%滅菌生理鹽水漱口 3次；0. 9%滅菌鹽水霧化誘導 IOmin后停止霧化，再次以0. 9%滅菌生理鹽水漱口 3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于 無菌培養(yǎng)皿。
[0020] 在上述的用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的痰液收集方法中，所述的步驟 9結(jié)束后，還包括：
[0021] 步驟10 :判斷步驟9所收集的深部痰的重量是否達到了預設(shè)值；
[0022] 若是，則終止深部痰收集，分離出步驟9所收集的深部痰的痰栓并低溫保存；
[0023] 若否，則再次檢測FEV1，并判斷相比于步驟1中所測得的FEV1，所述的步驟10中 所測得的FEVl的降低范圍；
[0024] 若步驟10中測得的FEVl的降低范圍低于10%，則進行步驟3;
[0025] 若步驟10中測得的FEVl的降低范圍介于10%?20%，則重復步驟9;
[0026] 若步驟10中測得的FEVl的降低范圍高于20%，則終止深部痰收集。
[0027] 在上述的用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的痰液收集方法中，所述的步驟 4結(jié)束后，還包括：
[0028] 步驟11:判斷步驟4所收集的深部痰的重量是否達到了預設(shè)值；
[0029] 若是，則進行步驟7 ;
[0030] 若否，則再次檢測FEV1，并判斷相比于步驟8中所測得的FEV1，所述的步驟11中 所測得的FEVl的降低范圍；
[0031] 若步驟11中測得的FEVl的降低范圍低于10%，則進行步驟5 ;
[0032] 若步驟11中測得的FEVl的降低范圍介于10%?20%，則重復步驟4;
[0033] 若步驟11中測得的FEVl的降低范圍高于20%，則終止深部痰收集。
[0034] 在上述的用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的痰液收集方法中，所述的步驟 5結(jié)束后，還包括：
[0035] 步驟12 :所述的步驟5結(jié)束后，判斷步驟5所收集的深部痰的重量是否達到了預 設(shè)值；
[0036] 若是，則進行步驟7 ;
[0037] 若否，則再次檢測FEV1，并判斷相比于步驟1中所測得的FEV1，所述的步驟12中 所測得的FEVl的降低范圍；
[0038] 若步驟12中測得的FEVl的降低范圍低于10%，則進行步驟6;
[0039] 若步驟12中測得的FEVl的降低范圍介于10%?20%，則重復步驟5;
[0040] 若步驟12中測得的FEVl的降低范圍高于20%，則終止深部痰收集。
[0041] 在上述的用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的痰液收集方法中，所述的步驟 6結(jié)束后，還包括：
[0042] 步驟13:判斷步驟6所收集的深部痰的重量是否達到了預設(shè)值；
[0043] 若是，則進行步驟7 ;
[0044] 若否，則終止深部痰收集。
[0045] 在上述的用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的痰液收集方法中，所述的步驟 2中所述的沙丁胺醇氣霧劑的用量為200ug。
[0046] 在上述的用于呼吸道細菌16SrRNA基因序列檢測的痰液收集方法中，所述的預設(shè) 值為不少于〇.lg。
[0047] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，在步驟3、4、5、6以及步驟9中都采用生理滅菌鹽水嗽口和擤鼻， 降低口腔中的雜質(zhì)對樣品的影響，對于痰液標本鱗狀上皮細胞和雜質(zhì)明顯減少、減少口腔 雜菌污染、所測試的結(jié)果能夠充分體現(xiàn)下呼吸道菌群。并且相比于傳統(tǒng)的痰液收集方法，本 方案采用階梯濃度霧化鹽水提高了實用安全性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0048] 圖1為實施例中重癥哮喘組痰液中細菌DNA電泳結(jié)果；
[0049] 圖2為實施例中輕癥哮喘組痰液中細菌DNA電泳結(jié)果；
[0050] 圖3為實施例中健康對照組痰液中細菌DNA電泳結(jié)果；
[0051] 圖4為實施例中重癥哮喘組、輕癥哮喘組和健康對照組的痰液中細菌DNA測序結(jié) 果。

【具體實施方式】
[0052] 下面結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對 本發(fā)明的任何限制。
[0053] 實施例1
[0054] 1、病例收集
[0055] 研究對象共有37例，其中重癥哮喘組14例，輕癥哮喘組14例，健康對照組9例。 重癥哮喘的診斷必須符合ATS上的標準：反復存在的癥狀與急性發(fā)作，高劑量的吸入性類 固醇不能緩解，需要經(jīng)?？诜に?。主要排除標準是：①：4周內(nèi)有感染存在，6周內(nèi)口服使 用過抗生素；②存在吸煙史；③合并存在有意義的肺部疾?。ù嬖诘幌抻诼宰枞苑?疾病、支氣管擴張、肺結(jié)核、囊性纖維化等）。
[0056] 2、主要儀器與試劑：
[0057] 氯化鈉（廣州化學試劑廠）；生理鹽水（東莞普濟藥業(yè)有限公司）；痰液基因組 DNA提取試劑盒（QIAampDNABloodMiniKit);瓊脂糖（西班牙Biowest公司）；超聲霧 化器（廣州粵華醫(yī)療器械公司）；TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）；電子天平（德 國Sartorius公司）；精密移液器（法國GILSON公司）；肺功能儀（德國Jaeger公司）； Qubit? 2.O突光計（美國Invitrogen公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）。
[0058] 3、深部疲收集和保存
[0059] 對上述37例研究對象按以下步驟進行深部痰收集。
[0060] 步驟1:測基礎(chǔ)第一秒用力肺活量FEVl;
[0061] 步驟2:吸入沙丁胺醇氣霧劑；
[0062] 在本實施例中，所述的步驟2結(jié)束后，還包括：
[0063] 步驟8 :15min后檢測FEVl和用力肺活量FVC，并判斷FEV1/FVC的比值，會出現(xiàn)以 下三種情況：
[0064]情況1:若FEV1/FVC蘭60 %，則進行步驟3;
[0065]情況2:若60% >FEV1/FVC蘭50%，且FEVl蘭1L，則進行步驟9;所述的步驟9為： 擤鼻和0. 9%滅菌生理鹽水漱口 3次；0. 9%滅菌鹽水霧化誘導IOmin后停止霧化，再次以 0. 9%滅菌生理鹽水漱口 3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培養(yǎng)皿。
[0066] 步驟10:判斷步驟9所收集的深部痰的重量是否達到了預設(shè)值；
[0067] 若是，則終止深部痰收集，分離出步驟9所收集的深部痰的痰栓并低溫保存；
[0068] 若否，則再次檢測FEV1，并判斷相比于步驟1中所測得的FEV1，所述的步驟10中 所測得的FEVl的降低范圍；
[0069] 若步驟10中測得的FEVl的降低范圍低于10%，則進行步驟3;
[0070] 若步驟10中測得的FEVl的降低范圍介于10%?20%，則重復步驟9;
[0071] 若步驟10中測得的FEVl的降低范圍高于20%，則終止深部痰收集。
[0072] 情況 3 :若FEV1/FVC< 50%;或 60% >FEV1/FVC芎 50%，且FEV1〈1L，則終止深部 痰收集；
[0073] 上述37例實驗研究對象，根據(jù)上述三種情況分別進行測試，在測試過程中，沒有 出現(xiàn)終止深部痰收集的情況。
[0074] 步驟3 :擤鼻和0? 9%滅菌生理鹽水漱口3次；
[0075] 步驟4 :3%滅菌鹽水霧化誘導IOmin后停止霧化，咳出第一口痰及唾液丟棄，再次 以0. 9%滅菌生理鹽水漱口 3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培養(yǎng)皿；
[0076] 在本實施例中，所述的步驟4結(jié)束后，還包括：
[0077] 步驟11:判斷步驟4所收集的深部痰的重量是否達到了預設(shè)值；
[0078] 若是，則進行步驟7 ;
[0079] 若否，則再次檢測FEV1，并判斷相比于步驟8中所測得的FEV1，所述的步驟11中 所測得的FEVl的降低范圍；
[0080] 若步驟11中測得的FEVl的降低范圍低于10%，則進行步驟5;
[0081] 若步驟11中測得的FEVl的降低范圍介于10%?20%，則重復步驟4;
[0082] 若步驟11中測得的FEVl的降低范圍高于20%，則終止深部痰收集。
[0083] 步驟：5 :4%滅菌鹽水霧化誘導IOmin后停止霧化，再次以0. 9 %滅菌生理鹽水漱 口 3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培養(yǎng)皿；
[0084] 在本實施例中，所述的步驟5結(jié)束后，還包括：
[0085] 步驟12 :所述的步驟5結(jié)束后，判斷步驟5所收集的深部痰的重量是否達到了預 設(shè)值；
[0086] 若是，則進行步驟7;
[0087]若否，則再次檢測FEV1，并判斷相比于步驟1中所測得的FEV1，所述的步驟12中 所測得的FEVl的降低范圍；
[0088] 若步驟12中測得的FEVl的降低范圍低于10%，則進行步驟6;
[0089] 若步驟12中測得的FEVl的降低范圍介于10%?20%，則重復步驟5;
[0090] 若步驟12中測得的FEVl的降低范圍高于20%，則終止深部痰收集。
[0091] 步驟6 :5%滅菌鹽水霧化誘導IOmin后停止霧化，再次以0. 9%滅菌生理鹽水漱口 3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培養(yǎng)皿；
[0092] 在本實施例中，所述的步驟6結(jié)束后，還包括：
[0093] 步驟13:判斷步驟6所收集的深部痰的重量是否達到了預設(shè)值；
[0094] 若是，則進行步驟7 ;
[0095] 若否，則終止深部痰收集。
[0096]步驟7 :分離出步驟4?6所收集的深部痰的痰栓并低溫保存。
[0097] 在本實施例中，所述的步驟7和步驟10中所述的分離深部痰的痰栓并低溫保存的 具體步驟為：于生物安全柜內(nèi)用滅菌尖頭鑷子挑取上述無菌培養(yǎng)皿痰液中的黏稠部分，并 對痰栓部分在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)進行拖拽以減少唾液污染，最后取〇. 1-0. 3g黏稠痰液，放入滅 菌EP管后稱重，立即置于-80°C保存，獲得37份痰液標本。
[0098] 通過上述操作，收集到的37例研究對象的痰液重量數(shù)據(jù)如下：
[0099]表一
[0100]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于呼吸道細菌16S rRNA基因序列檢測的痰液收集方法，其特征在于，包括以 下步驟： 步驟1 :測基礎(chǔ)第一秒用力肺活量FEVl ; 步驟2 :吸入沙丁胺醇氣霧劑； 步驟3 :擤鼻和0. 9%滅菌生理鹽水漱口 3次； 步驟4 :3%滅菌鹽水霧化誘導IOmin后停止霧化，再次以0.9 %滅菌生理鹽水漱口 3 次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培養(yǎng)皿； 步驟：5 :4%滅菌鹽水霧化誘導IOmin后停止霧化，再次以0. 9 %滅菌生理鹽水漱口 3 次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培養(yǎng)皿； 步驟6 :5%滅菌鹽水霧化誘導IOmin后停止霧化，再次以0.9 %滅菌生理鹽水漱口 3 次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培養(yǎng)皿； 步驟7 :分離出步驟4?6所收集的深部痰的痰栓并低溫保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于呼吸道細菌16S rRNA基因序列檢測的痰液收集方法，其 特征在于，所述的步驟2結(jié)束后，還包括： 步驟8 :檢測FEVl和用力肺活量FVC ; 若FEV1/FVC蘭60 %，則進行步驟3 ; 若60 % >FEV1/FVC蘭50 %，且FEVl蘭1L，則進行步驟9 ; 若 FEV1/FVC < 50% ;或 60% >FEV1/FVC 蘭 50%，且 FEV1〈1L，則終止深部痰收集； 所述的步驟9為：擤鼻和0. 9 %滅菌生理鹽水漱口 3次；0. 9 %滅菌鹽水霧化誘導IOmin 后停止霧化，再次以〇. 9%滅菌生理鹽水漱口 3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于無菌培 養(yǎng)皿。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于呼吸道細菌16S rRNA基因序列檢測的痰液收集方法，其 特征在于，所述的步驟9結(jié)束后，還包括： 步驟10 :判斷步驟9所收集的深部痰的重量是否達到了預設(shè)值； 若是，則終止深部痰收集，分離出步驟9所收集的深部痰的痰栓并低溫保存； 若否，則再次檢測FEV1，并判斷相比于步驟1中所測得的FEV1，所述的步驟10中所測 得的FEVl的降低范圍； 若步驟10中測得的FEVl的降低范圍低于10%，則進行步驟3 ; 若步驟10中測得的FEVl的降低范圍介于10%?20%，則重復步驟9 ; 若步驟10中測得的FEVl的降低范圍高于20%，則終止深部痰收集。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于呼吸道細菌16S rRNA基因序列檢測的痰液收集方法，其 特征在于，所述的步驟4結(jié)束后，還包括： 步驟11 :判斷步驟4所收集的深部痰的重量是否達到了預設(shè)值； 若是，則進行步驟7; 若否，則再次檢測FEV1，并判斷相比于步驟8中所測得的FEV1，所述的步驟11中所測 得的FEVl的降低范圍； 若步驟11中測得的FEVl的降低范圍低于10%，則進行步驟5 ; 若步驟11中測得的FEVl的降低范圍介于10%?20%，則重復步驟4; 若步驟11中測得的FEVl的降低范圍高于20%，則終止深部痰收集。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于呼吸道細菌16S rRNA基因序列檢測的痰液收集方法，其 特征在于，所述的步驟5結(jié)束后，還包括： 步驟12 :判斷步驟5所收集的深部痰的重量是否達到了預設(shè)值； 若是，則進行步驟7; 若否，則再次檢測FEV1，并判斷相比于步驟1中所測得的FEV1，所述的步驟12中所測 得的FEVl的降低范圍； 若步驟12中測得的FEVl的降低范圍低于10%，則進行步驟6 ; 若步驟12中測得的FEVl的降低范圍介于10%?20%，則重復步驟5 ; 若步驟12中測得的FEVl的降低范圍高于20%，則終止深部痰收集。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于呼吸道細菌16S rRNA基因序列檢測的痰液收集方法，其 特征在于，所述的步驟6結(jié)束后，還包括： 步驟13 :判斷步驟6所收集的深部痰的重量是否達到了預設(shè)值； 若是，則進行步驟7; 若否，則終止深部痰收集。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于呼吸道細菌16S rRNA基因序列檢測的痰液收集方法，其 特征在于，所述的步驟2中所述的沙丁胺醇氣霧劑的用量為200ug。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3至7任一所述的用于呼吸道細菌16S rRNA基因序列檢測的痰液收 集方法，其特征在于，所述的預設(shè)值為不少于〇. lg。
【文檔編號】A61B10/00GK104306028SQ201410505689
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】張清玲, 李乃健, 何夢璋, 李靖, 郭娥, 邱日皇 申請人:張清玲, 李乃健, 何夢璋, 李靖, 郭娥, 邱日皇