一種來源于假單胞菌的汞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在培育耐汞擬南芥中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種來源于假單胞菌的汞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因merT基因轉(zhuǎn)入擬南芥中并使得這種轉(zhuǎn)基因植物能夠具備增加植物抗汞性的作用。所述merT基因序列如序列1所示，其編碼的蛋白質(zhì)序列如序列2所示，將該基因轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的轉(zhuǎn)基因植物在含有高濃度Hg的平板上，其抗氧化酶表達(dá)量2倍至數(shù)十倍不等，根長(zhǎng)比非轉(zhuǎn)基因植物提高45％倍以上。本發(fā)明的基因可促使植物參與Hg的降解，從而提高了轉(zhuǎn)基因植物的降解Hg的能力，為植物修復(fù)Hg污染提供有益的幫助。
【專利說明】-種來源于假單胞菌的汞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在培育耐汞擬南芥 中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種來源于假單胞菌的汞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因merT基因轉(zhuǎn)入植物擬南芥 中并使得這種轉(zhuǎn)基因植物具備增加植物抗汞性的作用，屬于植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域。所述汞轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白基因merT含357個(gè)堿基，編碼的氨基酸殘基118個(gè)；所述基因的核苷酸序列如序列1所 示，其編碼的氨基酸序列如序列2所示。本發(fā)明中來源于假單胞菌的汞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因merT 采用人工方法合成，轉(zhuǎn)基因植物擬南芥具備較高的抗汞性。

【背景技術(shù)】
[0002] 土壤重金屬污染是影響人類健康和環(huán)境質(zhì)量的主要問題之一，其中土壤汞污染所 帶來的問題已經(jīng)對(duì)水體和農(nóng)作物造成了嚴(yán)重威脅。汞在土壤中停留時(shí)間長(zhǎng)，微生物和植物 不能直接對(duì)其進(jìn)行降解，而且還會(huì)對(duì)作物、農(nóng)產(chǎn)品及地下水產(chǎn)生二次污染。進(jìn)入土壤中的無 機(jī)汞，在硫酸鹽還原菌作用下，轉(zhuǎn)化為甲基汞，通過食物鏈產(chǎn)生生物放大效應(yīng)而直接危害到 人類健康。在20世紀(jì)80年代，一種以植物忍耐、分解或超量積累某些化學(xué)元素的生理功能 為基礎(chǔ)，利用植物及而提高修復(fù)潛能的植物修復(fù)技術(shù)受到廣泛關(guān)注，為重金屬污染土壤的 治理提供了較大的發(fā)展空間。
[0003] 然而，許多植物具有生長(zhǎng)緩慢、生物量低的特點(diǎn)，嚴(yán)重限制了在污染場(chǎng)地實(shí)際修復(fù) 中的應(yīng)用。因此識(shí)別出對(duì)重金屬耐性強(qiáng)或富集性高的生物，通過分子生物學(xué)等方法鑒別出 控制這些性狀的基因，然后將這些基因按設(shè)計(jì)方案定向連接起來，并在特定的受體細(xì)胞中， 與載體一起得到復(fù)制與表達(dá)，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳特性，從而提高修復(fù)潛能具有重要 應(yīng)用價(jià)值。過表達(dá)與金屬螯合物的生物合成有關(guān)的基因，通過螯合物的不同和螯合物所處 部位的不同，可以提高或降低金屬的吸收，提高金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)和區(qū)室化。依靠基因在植物組織 (根、莖葉、維管束）和細(xì)胞內(nèi)（細(xì)胞膜、液泡膜）中過表達(dá)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體基因可能提高金屬的 吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)，或者區(qū)室化的效率。
[0004] 細(xì)菌抗汞特性是細(xì)菌在環(huán)境中汞的壓力下形成的一種抗性機(jī)制，Mer操縱子是細(xì) 菌因環(huán)境中的汞達(dá)到一定的量時(shí)，為適應(yīng)這種壓力而產(chǎn)生的一種機(jī)制。MerT是微生物中 Mer操縱子的一部分，它與MerP編碼的蛋白參與汞離子由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。MerP編 碼的蛋白為二聚體，位于細(xì)胞周質(zhì)，MerT編碼一個(gè)蛋白三聚體，位于細(xì)胞膜內(nèi)，共同構(gòu)成運(yùn) 輸汞離子由細(xì)胞周質(zhì)到細(xì)胞內(nèi)的通道。目前已有將其應(yīng)用于煙草等植物的報(bào)道，但將其應(yīng) 用于擬南芥以提高其對(duì)汞的耐受性的研究還未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了一種來源于假單胞菌的汞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因merT轉(zhuǎn)入擬南 芥中并使得這種轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠具備增加植物抗汞性的作用。
[0006] 本發(fā)明方法所述的假單胞菌汞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因由357個(gè)堿基組成，為序列表中的1 號(hào)序列，將此基因命名為PamerT。
[0007] 用上述序列1及其開放閱讀框架的多核苷酸轉(zhuǎn)化的擬南芥植株，以及該基因在培 育耐汞擬南芥中的應(yīng)用方法均是本發(fā)明需要保護(hù)的內(nèi)容。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0008] 圖la為本發(fā)明以pYG8468質(zhì)粒構(gòu)建的DNA表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)示意圖，b為對(duì)擬南芥 轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行半定量PCR驗(yàn)證的電泳圖（WT為對(duì)照，M2、M5和M12分別為三組擬南芥轉(zhuǎn) 基因植株）。
[0009] 圖2為Hg處理不同時(shí)間后轉(zhuǎn)基因擬南芥和非轉(zhuǎn)基因擬南芥相關(guān)抗氧化酶表達(dá)量 的變化（CAT1 :過氧化氫酶1基因、CSD1 :Cu-Zn超氧化物歧化酶1基因、PER21 :過氧化物酶 21基因、PER27 :過氧化物酶27基因）。
[0010] 圖3為Hg處理不同時(shí)間后轉(zhuǎn)基因擬南芥和非轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)狀態(tài)和根系重量 的變化（其中a為經(jīng)Hg脅迫處理的擬南芥根系長(zhǎng)度變化，b為處理后擬南芥根系重量變化， c為處理后擬南芥植株生長(zhǎng)狀態(tài)的變化）。
[0011] 圖4為Hg處理不同時(shí)間后擬南芥不同抗氧化酶活性的變化。

【具體實(shí)施方式】：
[0012] 以下結(jié)合實(shí)施例并附圖，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步的詳述。
[0013] 實(shí)例ImerT基因在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化：
[0014] 1構(gòu)建雙向啟動(dòng)子CaMV 35S(D35S)，將細(xì)菌中獲得的merT基因與真核表達(dá)雙元載 體PYG8468相連轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。
[0015] 2用與擬南芥轉(zhuǎn)基因相同的花序浸染法將merT基因轉(zhuǎn)入擬南芥中：
[0016] a擬南芥的種植：將擬南芥種子于EP管中消毒后接種于1/2MS培養(yǎng)基上，4°C保濕 黑暗條件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lu X、18°C、RH為70% 條件下培養(yǎng)。一周后，選擇生長(zhǎng)健壯的幼苗移栽到培養(yǎng)土中。每周燒一次1/2 PNS培養(yǎng)液。 當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3-4cm時(shí)，去除花序，在去除頂端花序四天后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化前將已經(jīng)開花授粉 的花和種子去除干凈。
[0017] b農(nóng)桿菌菌液的制備：制備已轉(zhuǎn)化好相關(guān)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液，在轉(zhuǎn)化前一天搖瓶 過夜，在轉(zhuǎn)化前將農(nóng)桿菌菌液濃度在0D1. 2?1. 6之間。用配好的滲透培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌菌 液稀釋至0D在0.8左右。
[0018] c擬南芥轉(zhuǎn)化：將農(nóng)桿菌菌液噴灑擬南芥后立即套袋，隔一周再噴一次。
[0019] d轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選：將收獲的轉(zhuǎn)基因種子滅菌后用水將種子鋪在含20mg/L Hygromycin的MS培養(yǎng)基上，經(jīng)Hygromycin篩選后仍然長(zhǎng)勢(shì)良好，株高高者可初步確定為陽 性苗。
[0020] 3將篩選后得到的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR驗(yàn)證，再用同樣的方法將merT基因轉(zhuǎn)入得 到的轉(zhuǎn)基因植株中。
[0021] 4將經(jīng)過抗生素篩選得到的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行半定量PCR驗(yàn)證，設(shè)計(jì)引物P5 : 5，-TTGGTGGTACTTGGGTCGGTGC-3，和 P6 :
[0022] 5，-CCAGCCAAGGAACAGCCAGCAG-3，擴(kuò)增，Actin2 作為內(nèi)參，弓丨物 P3 : 5' -TCGCTGACCGTATGAGCAAAGAA-3'，篩選出包含merT (圖1)的擬南芥并進(jìn)行繁殖。
[0023] 實(shí)例2對(duì)篩選后得到的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行重金屬耐受性試驗(yàn)：
[0024] 1熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥在Hg脅迫下的抗氧化酶活性的變化
[0025] 選取經(jīng)半定量驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因擬南芥及野生型擬南芥植株（對(duì)照）同時(shí)接種到 取強(qiáng)化培養(yǎng)基上，每隔0，12,24,36， &11(14811采樣用于提取1?隱，設(shè)計(jì)引物？￡1?21(?15: 5'-TGCGAGAGACGGTATTGTCA-3' , P16 ：
[0026] 5'-TCTCCCAAGTAGCTCCCTC-3')擴(kuò)增過氧化物酶 21 基因，PER27(P17 :
[0027] 5，-CGCAATGGTTGCACTTGA-3，，P18 :5，-TGAGCGAAAATCGCTGATAA-3，）擴(kuò)增過氧 化物酶 27 基因，CSD1 (PI 1 :5 ' -TGATGGAACTGCCACCTTCACA-3'，P12 :
[0028] 5' -ATGGCCTCCCTTTCCGAGGT-3')擴(kuò)增 Cu-Zn 超氧化物歧化酶 1 基因，CAT1 (P7 :
[0029] 5，-CGCCATGCCGAAAAATACCC-3，，P8 :5，-CTTGCCTGTCTGAATCCCAGGAC-3，）擴(kuò)增 過氧化氫酶1基因，由圖2可以看出，轉(zhuǎn)基因擬南芥在處理24小時(shí)和48小時(shí)后上述抗氧化 酶活性都有顯著的提高。
[0030] 2Hg脅迫下擬南芥轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)狀態(tài)的變化
[0031] 將轉(zhuǎn)基因擬南芥及野生型擬南芥植株（對(duì)照）同時(shí)接種到含有10 U mol PHgCh 的培養(yǎng)基中，處理5天后觀察擬南芥根系生長(zhǎng)狀態(tài)的變化以及擬南芥植株鮮重的變化，由 圖3可以看出，轉(zhuǎn)基因擬南芥在Hg脅迫下的生長(zhǎng)狀態(tài)及根系長(zhǎng)度、重量等明顯優(yōu)于對(duì)照組。
[0032] 3Hg脅迫下擬南芥轉(zhuǎn)基因植株抗氧化酶活性的變化
[0033] 將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥將冷凍后的擬南芥植株（對(duì)照）同時(shí)接種到含有 1011111〇117 1取(：12的培養(yǎng)基中，處理0，12,36,48,6011后收集擬南芥植株置于11111501111磷酸 鉀緩沖液中（其中包含ImM EDTA and 1% PVP)植株粉碎研磨后用分光光度計(jì)測(cè)定其過氧 化物酶（P0D)，超氧化物歧化酶（S0D)以及過氧化氫酶（CAT)活性。由圖4可以看出，隨著 處理時(shí)間的加長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗氧化酶活性的變化明顯優(yōu)于對(duì)照組。
[0034] 序列表
[0035] 序列 1 :

【權(quán)利要求】
1. 一種來源于假單胞菌的汞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因在培育抗汞擬南芥中的應(yīng)用，即符合 序列表中序列1的核苷酸序列的基因或編碼序列表中序列2蛋白氨基酸序列的蛋白在培育 耐汞擬南芥中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PamerT基因在培育耐汞擬南芥中的應(yīng)用，其特征在于構(gòu)建了 雙向啟動(dòng)子CaMV 35S(D35S)，將所述的PamerT基因與真核表達(dá)雙元載體pYG8468相連，轉(zhuǎn) 入農(nóng)桿菌GV3101中，再采用花序浸染法轉(zhuǎn)入擬南芥中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PamerT基因在培育耐汞擬南芥中的應(yīng)用，其特征在于將所述 的PamerT基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥和未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥進(jìn)行汞脅迫處 理，采用熒光定量PCR檢測(cè)其抗氧化酶表達(dá)量的變化以測(cè)定其耐汞能力的提高。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PamerT基因在培育耐汞擬南芥中的應(yīng)用，其特征在于對(duì)轉(zhuǎn)基 因擬南芥和未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥進(jìn)行汞脅迫處理，分析轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)狀態(tài)和根系 變化以檢測(cè)其耐萊能力的提1?。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PamerT基因在培育耐汞擬南芥中的應(yīng)用，其特征在于對(duì)轉(zhuǎn) 基因擬南芥和未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥進(jìn)行汞脅迫處理，分析轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗氧化酶 (CAT、SOD、POD)活性變化以檢測(cè)其耐汞能力的提高。
【文檔編號(hào)】C12R1/38GK104450780SQ201410782036
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】汪仁, 徐晟 , 賀佳, 夏冰, 江玉梅, 田開洋, 談金忠, 徐成華, 嚴(yán)剛, 薛仁忠 申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所