一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細胞工程【技術領域】，具體為一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法。本發(fā)明通過在生理鹽水中加入少量的低分子肝素鈣，以此作為清洗液清洗人脂肪組織，可很好的去除人脂肪組織中殘留的紅細胞等雜質，從而可分離出純度更高的人脂肪干細胞，雜細胞含量顯著減少，有利于人脂肪干細胞的分化誘導，并且可減少Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶及無血清培養(yǎng)基的消耗量，降低工藝成本。此外，以150r/min的速度離心消化人脂肪組織1h，可得到活性明顯較好的人脂肪干細胞。
【專利說明】-種從人脂肋組織中分離人脂肋干細胞的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞工程【技術領域】，尤其涉及一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞 的方法。

【背景技術】
[0002] 2001年，細胞生物學家通過脂肪抽吸術，在吸出的人體脂肪息液中第一次分離 得到了多向分化的干細胞，并發(fā)現(xiàn)它能分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、血管內皮、肝、膜、神經 等細胞；該種從人脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的具有分化潛能的成體干細胞，被稱為人脂肪干細胞 (Human Adipose Derived Mesnchymal Stem Cells, MDSCs)。相比于其它干細胞，MDSCs 具有W下五方面的顯著優(yōu)勢：（一）來源豐富，取材容易。（二）易于擴增，不易衰老。實驗 證明，傳代后的hADSCs成纖維細胞樣生長，多次傳代后細胞生長速度也無減慢趨勢，即可 W繼續(xù)保持結構和功能上的穩(wěn)定性。（H)具有旁分泌功能，可分泌促進血管生成的相關 因子，促進血管再生。同時，MDSCs也可通過旁分泌作用于成纖維細胞，促進皮膚表皮細胞 的成熟，W利于創(chuàng)面愈合和瘤痕縮小。該些特性預期在美容方面具有十分可觀的應用前景。 (四）具有較低的免疫原性，在進行自體或者異體移植時，不會引起強烈的免疫反應和后期 的排斥反應。（五）經過多年的研究，科學家們發(fā)現(xiàn)MDSCs經血液系統(tǒng)進入人體W后，具有 很好的調理全身的作用，可W顯著地提高機體的靈活性及耐受性、調節(jié)機體的內分泌水平 并改善神經系統(tǒng)對機體的支配功能，從而起到增強機體活力、改變精神面貌、延緩衰老和保 持機體年輕狀態(tài)的功效。也就是說，hADSCs可W有效地推動抗衰老治療技術的發(fā)展，同時 在組織工程、器官修復、基因治療等多個醫(yī)學領域也有著廣闊的應用前景。
[0003] 通常，人脂肪干細胞的分離和培養(yǎng)工藝流程如圖1所示，經歷了人體脂肪組織、細 胞息液、原代細胞、Pl代細胞、P2代細胞W及可應用的人脂肪干細胞樣品等六個階段，涉及 人脂肪干細胞的分離技術、收獲技術、傳代技術、凍存技術、復蘇技術等關鍵工藝技術。其 中，人脂肪干細胞的分離技術是整個人脂肪干細胞應用工藝的基礎和關鍵步驟，很大程度 地決定了最終所得人脂肪干細胞產品的收率、純度和活性。特別地，如果經分離得到的人脂 肪干細胞的純度較低、含有組織微塊等雜質，將不利于其進行分化誘導，從而嚴重地降低其 抗衰老功效。
[0004] 因此，人脂肪干細胞的分離技術一直都是本領域的研究熱點。目前，從人脂肪組 織中分離人脂肪干細胞的基本方法是：首先，對所獲得的人脂肪組織樣品進行洗涂，除去血 細胞；然后，進行脂肪破碎、消化，去掉其它雜細胞；接著，除去未消化的組織，獲得含脂肪 干細胞的濾液；最后，離也得到脂肪干細胞群，可用于后續(xù)的培養(yǎng)、傳代W及凍存等。該基 本方法所面臨的技術難題包括；方法步驟復雜、制備過程難W進行質量控制、提取的干細胞 數(shù)量少、樣品純度不高W及繼代增殖緩慢等。多年W來，研究人員一直對現(xiàn)有技術進行改 進和優(yōu)化，W求開發(fā)出一種更加經濟有效的人脂肪干細胞分離技術，從而為人脂肪干細胞 的研究提供充足的高質量樣品。其中，中國專利CN201210018269. 3公開了一種脂肪干細 胞的獲取方法，該方法采用混合膠原酶（即I型膠原酶、II型膠原酶與IV型膠原酶的混 合物）對脂肪組織進行消化，從而克服了傳統(tǒng)的細胞分離方法中存在的膠原酶消化細胞不 夠徹底、所得細胞純度不夠高的問題。中國專利CN201210181162. O公開了一種人體脂肪 干細胞快速提取方法，該方法使用了專用的人脂肪組織消化劑，其成分包含膠原酶IV型、 膜蛋白酶-EDT復合體、抗膜蛋白酶和二甲基亞諷，從而可W使脂肪間充質干細胞充分游離 出來同時保護細胞不受傷害，最終獲得充分游離且存活率高的人脂肪干細胞。中國專利 CN201110154507. 9公開了一種脂肪干細胞的分離方法，該方法主要包括四個步驟；（1)用 洗涂液行洗涂；(2)用膠原酶進行消化；（3)進行過濾，獲得含脂肪干細胞的濾液；(4)進行 離也，所得沉淀即為脂肪干細胞群。上述前兩種方法，因應用了混合膠原酶或者?？诘南?齊U，將不可避免地增加了人脂肪干細胞分離工藝的技術難度和經濟成本。而第H種方法，其 洗涂脂肪組織的步驟過于簡單，樣品中的血細胞等雜質難W完全清除干凈，不利于人脂肪 干細胞的分化誘導，影響人脂肪干細胞產品的收率、純度和活性。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有的人脂肪干細胞分離技術存在分離不干凈、純度低從而影響人脂 肪干細胞的分化誘導，導致人脂肪干細胞產品的收率、純度和活性低的問題，通過優(yōu)化清洗 人脂肪組織步驟和膠原酶硝化步驟而提供一種從人脂肪組織中有效分離人脂肪干細胞方 法，使傳代細胞生長狀態(tài)好，人脂肪干細胞得率高，工藝成本低。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術方案，一種從人脂肪組織中分離人脂肪干 細胞的方法，包括清洗人脂肪組織步驟、膠原酶消化步驟和收集人脂肪干細胞步驟；所述清 洗人脂肪組織步驟為；用清洗液反復沖洗人脂肪組織兩遍W上，W除去人脂肪組織中的血 液；所述清洗液為含低分子肝素巧的生理鹽水，所述清洗液中低分子肝素巧的質量百分比 為 0. 4-0. 6%。
[0007] 優(yōu)選的，所述清洗液中低分子肝素巧的質量百分比為0. 5%。
[0008] 所述膠原酶消化步驟為；將清洗后的人脂肪組織和I型膠原酶溶液置于離也管 中，然后將離也管置于36. 5-37. 5°C下，W 100-150r/min的離也速率消化0. 5-比。
[0009] 優(yōu)選的，將清洗后的人脂肪組織和I型膠原酶溶液置于離也管中，然后將離也管 置于37C下，W 15化/min的離也速率消化比。
[0010] 所述膠原酶消化步驟中，！型膠原酶溶液中I型膠原酶的濃度為1. 5g% (m/v); 離也管內人脂肪組織與I型膠原酶溶液的體積比為1:1。
[0011] 所述收集人脂肪干細胞步驟為；取離也管底層含單個核細胞的液體并經網孔孔徑 為IOOym的濾網過濾，得過濾液；然后向過濾液中加入生理鹽水并離也分離，除去上層清 液后得人脂肪干細胞。
[0012] 所述收集人脂肪干細胞步驟中，W 150化/min的速率離也lOmin。
[0013] W上所述的從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，在收集人脂肪干細胞步驟 后，還包括依次進行的細胞原代培養(yǎng)步驟和細胞傳代培養(yǎng)步驟，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪 干細胞。
[0014] 所述的細胞原代培養(yǎng)步驟為：將人脂肪干細胞接種于培養(yǎng)瓶中并加入無血清培養(yǎng) 基，然后將培養(yǎng)瓶置于37C，0)2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)2化后進行第一次全量換 液，再培養(yǎng)4她后進行第二次全量換液，再培養(yǎng)5天后進行第H次全量換液，繼續(xù)培養(yǎng)至細 胞生長融合度為88-92% ;然后向培養(yǎng)瓶中加入質量百分濃度為0. 25 %的膜蛋白酶-EDTA 進行消化，終止消化后離也收集原代人脂肪干細胞。
[0015] 所述的細胞傳代培養(yǎng)步驟為：將原代人脂肪干細胞接種到培養(yǎng)瓶中并加入無血清 培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)瓶置于37°C，0)2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合度為88-92% ; 然后向培養(yǎng)瓶中加入質量百分濃度為0. 25%的膜蛋白酶-邸TA進行消化，終止消化后離也 收集Pl代人脂肪干細胞。重復上述步驟進行P2代人脂肪干細胞培養(yǎng)，獲得P2代人脂肪干 細胞。
[0016] 凍存P2代人脂肪干細胞。
[0017] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是；本發(fā)明通過在生理鹽水中加入少量的低 分子肝素巧，W此作為清洗液清洗人脂肪組織，可很好的去除人脂肪組織中殘留的紅細胞 等雜質，從而可分離出純度更高的人脂肪干細胞，雜細胞含量顯著減少，有利于人脂肪干細 胞的分化誘導，并且可減少I型膠原酶、膜蛋白酶及無血清培養(yǎng)基的消耗量，降低工藝成 本。此外，W 15化/min的速度離也消化人脂肪組織比，可得到活性明顯較好的人脂肪干細 胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為人脂肪干細胞的分離和培養(yǎng)工藝流程；
[0019] 圖2為實施例7中PO代人脂肪干細胞（培養(yǎng)4天）的顯微鏡觀察結果；
[0020] 圖3為實施例7中Pl代人脂肪干細胞（培養(yǎng)3天）的顯微鏡觀察結果；
[0021] 圖4為實施例7中P2代人脂肪干細胞（消化收獲前）的顯微鏡觀察結果；
[0022] 圖5為實施例7中P2代人脂肪干細胞的流式細胞分析儀的檢測結果（CD29);
[0023] 圖6為實施例7中P2代人脂肪干細胞的流式細胞分析儀的檢測結果（CD73);
[0024] 圖7為實施例7中P2代人脂肪干細胞的流式細胞分析儀的檢測結果（CD49d);
[0025] 圖8為實施例7中P2代人脂肪干細胞的流式細胞分析儀的檢測結果（CD90);
[002引圖9為實施例7中P2代人脂肪干細胞的流式細胞分析儀的檢測結果仰14); [0027] 圖10為實施例7中P2代人脂肪干細胞的流式細胞分析儀的檢測結果仰4? ;
[002引圖11為實施例7中P2代人脂肪干細胞的流式細胞分析儀的檢測結果仰34);
[0029] 圖12為實施例7中P2代人脂肪干細胞的流式細胞分析儀的檢測結果（Act in);
[0030] 圖13為實施例7中P2代人脂肪干細胞的流式細胞分析儀的檢測結果（HLA-DR)。

【具體實施方式】
[0031] 為了更充分理解本發(fā)明的技術內容，下面結合具體實施例對本發(fā)明的技術方案作 進一步介紹和說明。
[003引 W下實施例中使用的I型膠原酶來自美國GIBCO公司，使用時在IOOmL的無血清 培養(yǎng)基中加入1. 5g的I型膠原酶，配制成I型膠原酶濃度為1. 5g% (m/v)的I型膠原酶溶 液。
[0033] 實施例1
[0034] 本實施例提供一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，并且對分離得到的 人脂肪干細胞進行培養(yǎng)。具體如下：
[00巧](I)從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞
[0036] 清洗；取15mL人脂肪組織，用生理鹽水反復沖洗人脂肪組織H遍，W除去人脂肪 組中的血液。
[0037] 膠原酶消化；將清洗后的人脂肪組織放入50mL的離也管中，然后向離也管中加入 等體積量的I型膠原酶溶液，混勻。放入恒溫振蕩器中，在37C下，W 15化/min的離也速率 消化比。離也管內的液體分為H層，上層為黃色油狀脂肪細胞層，中層為脂肪組織層，下層 為含單個核細胞的液體。
[003引收集；吸出離也管中的下層液體，下層液體用網孔孔徑為IOOum的濾網過濾，得 過濾液。向過濾液中加入生理鹽水（30血)，W 1500r/min的速率離也lOmin，除去上層清液 后，得到人脂肪干細胞。
[00測 似細胞原代培養(yǎng)（PO代）
[0040] 接種；向裝有上述人脂肪干細胞的離也管中加入5mL的無血清培養(yǎng)基，用移液管 輕輕吹打離也管內的無血清培養(yǎng)基10-20次，制成細胞息液；然后將細胞接種至75cm 2的培 養(yǎng)瓶中，再向培養(yǎng)瓶中加入IOmL無血清培養(yǎng)基，輕搖培養(yǎng)瓶W混勻瓶內液體。將培養(yǎng)瓶放 入37°C，0)2含量為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0041] 第一次全量換液；細胞原代培養(yǎng)24小時后，將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，進行全量 換液。即將舊的無血清培養(yǎng)基吸出，加入12mL新的無血清培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng) 箱中繼續(xù)進行培養(yǎng)。
[0042] 第二次全量換液；繼續(xù)培養(yǎng)第48小時后，將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，進行全量換 液。即將舊無血清培養(yǎng)基吸出，加入12mL新的無血清培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱中 繼續(xù)進行培養(yǎng)。
[0043] 第H次全量換液；繼續(xù)培養(yǎng)第5天后，將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，無血清培養(yǎng)基的 顏色改變，呈淺黃色，進行全量換液。即將舊的無血清培養(yǎng)基吸出，加入12血新的無血清培 養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)至細胞生長融合度達到88-92%。
[0044] 消化收獲；輕輕晃動培養(yǎng)瓶，將舊的無血清培養(yǎng)基轉移至50mL離也管中，用4-5mL 氯化軸注射液輕輕沖洗培養(yǎng)瓶1-2遍，洗涂后的氯化軸注射液棄去。按照每75cm2加 入2血濃度為0. 25 %的膜蛋白酶-EDTA的比例向培養(yǎng)瓶中加入濃度為0. 25 %的膜蛋白 酶-EDTA (膜蛋白酶使用前放置在20-25C下），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使膜蛋白酶-EDTA流遍所 有細胞表面，消化時間為2-2. 5min(同時用倒置顯微鏡觀察，觀察到大部分細胞的形狀由 梭形變?yōu)閳A形并脫落時完成消化）。然后向離也管中加入舊的無血清培養(yǎng)基W終止消化。用 移液管反復吹打培養(yǎng)瓶的瓶底至大部分細胞從瓶壁脫落，然后將無血清培養(yǎng)基轉移到50mL 的離也管中，并向原培養(yǎng)瓶中加入4-5血氯化軸注射液沖洗瓶壁，洗涂液并入離也管中。用 移液管吹打息浮細胞后，用網孔孔徑為100 y m的無菌濾網過濾，將過濾液收集到50mL的離 也管中，離也洗涂（離也力設為210g，離也時間設為lOmin)。棄去離也管內的上層清液，然 后再加入適量的氯化軸注射液，用移液管輕輕吹打重息浮細胞，然后用氯化軸注射液定容 至30mU再用移液管吹打混勻并進行二次離也（離也力設為210g，離也時間設為IOmin)。 上層清液送檢，檢測上層清液是否有菌；下層為細胞沉淀。
[004引 做傳代培養(yǎng)
[0046] 在上述裝有細胞沉淀（PO代人脂肪干細胞）的離也管中加入適量的無血清培養(yǎng)基 (IOmL)，用移液管輕輕吹打重息浮細胞，然后用無血清培養(yǎng)基定容至30mL并接種到新的培 養(yǎng)瓶中，細胞密度為5000-6000/cm2。將培養(yǎng)瓶放入37C，C〇2含量為5%的培養(yǎng)箱中進行培 養(yǎng)。培養(yǎng)至細胞生長融合度達到88-92%。
[0047] 如上述步驟（2)中的消化收獲操作，收獲Pl代人脂肪干細胞。
[0048] 在上述裝有細胞沉淀（Pl代人脂肪干細胞）的離也管中加入適量的無血清培養(yǎng)基 (IOmL)，用移液管輕輕吹打重息浮細胞，然后用無血清培養(yǎng)基定容至30mL并接種到新的培 養(yǎng)瓶中，細胞密度為5000-6000/cm 2。將培養(yǎng)瓶放入37C，C〇2含量為5%的培養(yǎng)箱中進行培 養(yǎng)。培養(yǎng)至細胞生長融合度達到88-92%。
[0049] 再如上述步驟（2)中的消化收獲操作，收獲P2代人脂肪干細胞，并且在進行二次 離也（210g，IOmin)前，對已經過第一次離也并定容至30血的細胞溶液進行過濾處理，用 100 U m的細胞過濾器將細胞和溶液濾至另一支50mL的離也管中，再用移液管輕輕吹打離 也管內的液體。至此，得到傳代后的人脂肪干細胞。
[0050] 在上述的培養(yǎng)過程中，對P0、P1、P2代的人脂肪干細胞進行連續(xù)性的觀察。
[0051] PO代人脂肪干細胞培養(yǎng)4她后，在倒置顯微鏡下觀察，可見有少量的細胞開始貼 壁生長，無血清培養(yǎng)基中息浮有雜細胞。經過一系列的換液、消化傳代后，Pl代的無血清培 養(yǎng)基中息浮的雜細胞數(shù)量明顯減少；傳代至P2代，人脂肪干細胞呈梭形，細胞生長狀態(tài)十 分好，雜細胞基本不存在。
[00閲 實施例2
[0053] 本實施例提供一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，并且對分離得到的 人脂肪干細胞進行培養(yǎng)。具體操作與實施例1的基本相同，不同之處在于；將步驟（1)中的 膠原酶消化時的離也速率（15化/min)改為10化/min。其它的操作及參數(shù)與實施例1的完 全一致。
[0054] 在上述的培養(yǎng)過程中，對P0、P1、P2代的人脂肪干細胞進行連續(xù)性的觀察。
[00巧]PO代人脂肪干細胞培養(yǎng)4她后，在倒置顯微鏡下觀察，無細胞貼壁生長，7化后方 有極少量的細胞貼壁生長，同時無血清培養(yǎng)基中息浮有大量的雜細胞。經過一系列的換液、 消化傳代后，Pl代的無血清培養(yǎng)基中息浮的雜細胞數(shù)量有所減少；傳代至P2代，雜細胞進 一步減少，細胞生長狀態(tài)較好。
[005引 實施例3
[0057] 本實施例提供一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，并且對分離得到的 人脂肪干細胞進行培養(yǎng)。具體操作與實施例1的基本相同，不同之處在于；將步驟（1)中的 膠原酶消化時的離也消化時間（比）改為0. 5h。其它的操作及參數(shù)與實施例1的完全一致。
[0058] 在上述的培養(yǎng)過程中，對P0、P1、P2代的人脂肪干細胞進行連續(xù)性的觀察。
[005引 PO代人脂肪干細胞培養(yǎng)4她后，在倒置顯微鏡下觀察，無細胞貼壁生長，9化后方 有極少量的細胞貼壁生長，同時無血清培養(yǎng)基中息浮有大量的雜細胞。經過一系列的換液、 消化傳代后，Pl代的無血清培養(yǎng)基中息浮的雜細胞數(shù)量有所減少；傳代至P2代，雜細胞進 一步減少，細胞生長狀態(tài)較好。
[0060] 實施例4
[0061] 本實施例提供一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，并且對分離得到的 人脂肪干細胞進行培養(yǎng)。具體操作與實施例1的基本相同，不同之處在于；將步驟（1)中的 膠原酶消化時的離也速率（15化/min)改為l(K)r/min，離也消化時間（比）改為0.化。其它 的操作及參數(shù)與實施例1的完全一致。
[0062] 在上述的培養(yǎng)過程中，對P0、P1、P2代的人脂肪干細胞進行連續(xù)性的觀察。
[006引 PO代人脂肪干細胞培養(yǎng)4她后，在倒置顯微鏡下觀察，無細胞貼壁生長，14化后方 有極少量的細胞貼壁生長，同時無血清培養(yǎng)基中息浮有大量的雜細胞。經過一系列的換液、 消化傳代后，Pl代的無血清培養(yǎng)基中息浮的雜細胞數(shù)量有所減少，細胞生長狀況一般；傳 代至P2代，雜細胞進一步減少，細胞生長狀態(tài)一般。
[0064] 根據(jù)W上實施例1-4的實驗結果可知，步驟（1)中的膠原酶消化時的離也速率和 離也消化時間對最終所得的人脂肪干細胞的純度與活性有重要的影響，而最佳的離也速率 是15化/min,離也消化時間是比。
[0065] 實施例5
[0066] 本實施例提供一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，并且對分離得到的 人脂肪干細胞進行培養(yǎng)。具體操作與實施例1的基本相同，不同之處在于；1、步驟（1)中清 洗的人脂肪組織樣品不同，本實施例所清洗的人脂肪組織樣品帶有較多的血液成分（肉眼 可直接觀察到血液）；2、用于清洗人脂肪組織的清洗液為含低分子肝素巧的生理鹽水，并 且清洗液中低分子肝素巧的質量百分比為0. 5%。
[0067] 其它操作及參數(shù)與實施例1的完全一致。
[0068] 在上述的培養(yǎng)過程中，對P0、P1、P2代的人脂肪干細胞進行連續(xù)性的觀察。
[0069] PO代人脂肪干細胞培養(yǎng)4她后，在倒置顯微鏡下觀察，可見有少量的細胞開始貼 壁生長，無血清培養(yǎng)基中息浮的雜細胞量極少。經過一系列的換液、消化傳代后，傳代至P2 代，人脂肪干細胞呈梭形，細胞生長狀態(tài)十分好，雜細胞基本不存在。本實施例的細胞培養(yǎng) 情況與實施例1的細胞培養(yǎng)情況基本一致。
[0070] 在其它實施方案中，用于清洗人脂肪組織的清洗液還可W是含有0.4-0. 6% (質 量百分比）低分子肝素巧的生理鹽水。
[00川 實施例6
[0072] 本實施例提供一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，并且對分離得到的 人脂肪干細胞進行培養(yǎng)。具體操作與實施例5的基本相同，不同之處在于；步驟（1)中用于 清洗的人脂肪組織樣品的清洗液不同，本實施例所用的清洗液為生理鹽水，即清洗液中不 含低分子肝素巧。
[0073] 其它操作及參數(shù)與實施例1的完全一致。
[0074] 在上述的培養(yǎng)過程中，對P0、P1、P2代的人脂肪干細胞進行連續(xù)性的觀察。
[00巧]PO代人脂肪干細胞培養(yǎng)4她后，在倒置顯微鏡下觀察，無血清培養(yǎng)基中息浮有較 多的雜細胞。經過一系列的換液、消化傳代后，傳代至P2代，細胞生長狀態(tài)一般。
[0076] 根據(jù)W上實施例5-6的實驗結果可知，對于含有較多的血液成分的人脂肪組織樣 品，使用含有少量低分子肝素巧的生理鹽水進行清洗，可顯著地提高清洗效果，有利于后續(xù) 的細胞培養(yǎng)傳代，保證最終所得的人脂肪干細胞具有良好的純度與活性。
[0077] 實施例7
[0078] 本實施例提供一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，并且對分離得到的 人脂肪干細胞進行培養(yǎng)和凍存。具體如下：
[0079] (I)從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞
[0080] 該步驟的處理方法與實施例1的分離方法完全相同。
[008。 似細胞原代培養(yǎng)（PO代）
[0082] 將分離得到的人脂肪干細胞接種到培養(yǎng)瓶中，W及培養(yǎng)過程中的第一次全量換 液、第二次全量換液和第H次全量換液的操作與實施例1的完全相同。PO代人脂肪干細胞 培養(yǎng)四天后，用顯微鏡觀察的結果如圖2所示，所得PO代人脂肪干細胞貼壁生長，呈長條形 或紡鍵形，符合人脂肪干細胞的外形特征。
[0083] 經第H次全量換液并培養(yǎng)5天后，進行半量換液。目P，吸出一半舊的無血清培養(yǎng) 基，再向培養(yǎng)瓶中補充等量的新的無血清培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)進行培 養(yǎng)。抬養(yǎng)至細胞生長融合度達到88-92%。
[0084] 然后，如實施例1的消化收獲步驟所述方法進行消化，收獲得到PO代人脂肪干細 胞。
[00財 做傳代培養(yǎng)（Pl代、P2代）
[0086] 該步驟的處理方法與實施例1的傳代培養(yǎng)方法完全相同。得到傳代后的人脂肪干 細胞。其中，Pl代人脂肪干細胞培養(yǎng)7化后，用倒置顯微鏡觀察的結果如圖3所示，細胞的 生長融合度達到90% ;消化收獲P2代人脂肪干細胞前，用倒置顯微鏡觀察的結果如圖4所 示，細胞的生長融合度達到90%。
[0087] 并且取經100 U m的細胞過濾器過濾后的P2代人脂肪干細胞，用流式細胞分析儀 檢測，檢測結果如下表1和圖5-13所示。
[0088] (4)用細胞計數(shù)儀測量P2代人脂肪干細胞的數(shù)量，并根據(jù)P2代人脂肪干細胞的數(shù) 量加入適量的無血清培養(yǎng)基，使P2代人脂肪干細胞的密度為凍存密度的2倍。然后再加入 與無血清培養(yǎng)基等體積的細胞凍存液，用移液管輕輕吹打液體使液體混合均勻，使細胞密 度與指定要求一致。將細胞息液分裝于凍存管內，每管ImU在凍存管上做好標記，粘貼細胞 標簽等信息。
[0089] 將需凍存的P2代人脂肪干細胞置于裝有異丙醇的程序降溫盒中（每次使用前應 注意異丙醇的量W及異丙醇的使用次數(shù)，按規(guī)定及時添加與更換異丙醇），并將降溫盒置 于-8(TC的冰箱內過夜，次日移入液氮罐中。
[0090] 表1 P2代人脂肪干細胞的流式細胞分析儀檢測結果
[0091] 細胞表 ^ CD29 CD73 CD49d CD90 CD14 CD45 畑34 Acti'n HLA-DR 面標記 表達率目9.8% 99.3?|| 99. 3% 99. 2% 1.2% 0. 1% 1.3〇/〇 0. 5% 0.1%
[0092] 表1中，〔029、〔073、〔049(1、〔090均為人脂肪干細胞的陽性指標，〔014、〔045、〔034、 Actin、HLA-DR均為陰性指標。
[0093] W上所述僅W實施例來進一步說明本發(fā)明的技術內容，W便于讀者更容易理解， 但不代表本發(fā)明的實施方式僅限于此，任何依本發(fā)明所做的技術延伸或再創(chuàng)造，均受本發(fā) 明的保護。
【權利要求】
1. 一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，包括清洗人脂肪組織步驟、膠原酶 消化步驟和收集人脂肪干細胞步驟，其特征在于，所述清洗人脂肪組織步驟為：用清洗液反 復沖洗人脂肪組織兩遍以上，以除去人脂肪組織中的血液；所述清洗液為含低分子肝素鈣 的生理鹽水，所述清洗液中低分子肝素鈣的質量百分比為0. 4-0. 6%。
2. 根據(jù)權利要求1所述一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，其特征在于， 所述清洗液中低分子肝素鈣的質量百分比為〇. 5%。
3. 根據(jù)權利要求1所述一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，其特征在于， 所述膠原酶消化步驟為：將清洗后的人脂肪組織和I型膠原酶溶液置于離心管中，然后將 離心管置于36. 5-37. 5°C下，以100_150r/min的離心速率消化0. 5-lh。
4. 根據(jù)權利要求3所述一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，其特征在于， 所述膠原酶消化步驟為：將清洗后的人脂肪組織和I型膠原酶溶液置于離心管中，然后將 離心管置于37°C下，以150r/min的離心速率消化lh。
5. 根據(jù)權利要求3所述一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，其特征在于， 所述I型膠原酶溶液中I型膠原酶的濃度為1. 5g% (m/v)。
6. 根據(jù)權利要求5所述一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，其特征在于， 所述膠原酶消化步驟中，離心管內人脂肪組織與I型膠原酶溶液的體積比為1:1。
7. 根據(jù)權利要求3所述一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，其特征在于， 所述收集人脂肪干細胞步驟為：取離心管底層含單個核細胞的液體并經孔徑為lOOum的 濾網過濾，得過濾液；然后向過濾液中加入生理鹽水并離心分離，除去上層清液后得人脂肪 干細胞。
8. 根據(jù)權利要求7所述一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，其特征在于， 所述收集人脂肪干細胞步驟中，以1500r/min的速率離心lOmin。
9. 根據(jù)權利要求1-8任一項所述一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，其特 征在于，收集人脂肪干細胞步驟后，還包括細胞原代培養(yǎng)步驟。
10. 據(jù)權利要求9所述一種從人脂肪組織中分離人脂肪干細胞的方法，其特征在于，細 胞原代培養(yǎng)步驟后，還包括細胞傳代培養(yǎng)步驟，獲得傳代培養(yǎng)后的人脂肪干細胞。
【文檔編號】C12N5/0775GK104357387SQ201410742169
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年12月8日 優(yōu)先權日:2014年12月8日
【發(fā)明者】胡士庶, 張滌平, 崔興日, 陳賢光 申請人:深圳市賽歐細胞生物科技有限公司