一種枇杷自交親和品種快速鑒定分子標記、標記引物及鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子標記領域，提供一種枇杷自交親和Si分子標記，自交親和標記引物和自交親和品種快速鑒定方法。該Si分子標記序列如SEQ ID NO.1所示，大小為830bp，標記引物AS-PCR序列：正向引物如SEQ ID NO.2；反向引物如SEQ ID NO.3所示。鑒定方法以Si作為分子標記，以標記引物AS-PCR擴增不同枇杷品種DNA，篩選，可擴增出830bp片段的標志著Si分子標記的存在，說明該枇杷品種為自交親和品種。本方法能快速鑒定枇杷自交親和品種，不需要配置授粉樹或進行人工授粉，可大大節(jié)約成本；不易受外界因素影響，精確度大，打破了傳統(tǒng)方法的局限性，對提高枇杷的產(chǎn)量和品質(zhì)有很大意義。
【專利說明】一種枇杷自交親和品種快速鑒定分子標記、標記引物及鑒 定方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子標記領域，涉及一種枇杷品種（系）自交親和S-RNase基因型Si 分子標記，自交親和標記引物和枇杷自交親和品種快速鑒定方法。

【背景技術】
[0002] 枇杷（Eriobotrya Lindl.)屬配子體型自交不親和 (Gametophyticself-incompati bility，GSI)，遺傳上屬于受單一位點（S-locus，S 位點） 的復等位基因（S-allele or S-gene，S基因）調(diào)控，當花粉的S等位基因與花柱中S等位 基因之一相同時，花粉管在花柱中的生長就會受到抑制，從而無法順利完成受精作用而表 現(xiàn)出自交不親和現(xiàn)象，嚴重影響果實產(chǎn)量。因此在栽培中必需配植合理的授粉品種或進行 科學的花期人工輔助授粉，方能獲得穩(wěn)定的產(chǎn)量與品質(zhì)。這種方法雖然直觀有效，但是不僅 費時費力，而且盲目性比較大，從而影響提高枇杷的品質(zhì)。
[0003] 如果能找到自交親和品種的枇杷，并能有效而快速地鑒定出來，就不需要配置授 粉樹或進行人工授粉，可以大大地節(jié)約人工和生產(chǎn)成本，對提高枇杷的產(chǎn)量和品質(zhì)有很大 的意義。
[0004] 枇杷自交親和品種的鑒定是一項長期的應用基礎性研究工作，隨著新品種的不斷 育成和推廣，需要探索出一種可以快速鑒定出枇杷自交親和品種的方法，這不僅能夠為研 究枇杷自交不親和性機理提供有益的試材，而且能夠為生產(chǎn)提供切實的幫助。然而，從現(xiàn)有 的鑒定方法而言，主要是靠田間品種的套袋自交座果率高低來確定，雖然直觀有效，但是工 作量大，周期長。
[0005] 在分子生物學領域，早在1952年，Lewis在月見草中發(fā)現(xiàn)了與特定S等位基因相 關的蛋白質(zhì)，此后，有人從茄科等植物中發(fā)現(xiàn)含量豐富并與S位點遺傳連鎖的花柱糖蛋白。 近20年來，隨著分子生物學的迅速發(fā)展，現(xiàn)已從多種配子體型植物中分離了近百個S核酸 酶。根據(jù)DNA和氨基酸序列比較的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)它們與真菌RNaseRh和RNaseTZ同源，且含 有相同的活性部位，具有核酸酶活性，故而常稱為S-核酸酶（S-RNase)。S-RNase -般為 250個氨基酸左右。比較S-RNase的蛋白質(zhì)序列發(fā)現(xiàn)它們之間有數(shù)個保守區(qū)和兩個高變區(qū)， 高變區(qū)Hva和Hvb多數(shù)為S -蛋白的親水區(qū)域，可能與S-RNase的識別有關。保守區(qū)可能 與S-RNase的活性和結(jié)構(gòu)有關。作為一類分泌型糖蛋白，S-RNase在雌蕊中特異表達，主要 分布在花柱傳遞組織的細胞間隙中，在花柱1/3以上部位的濃度最高，該部位正是自交不 親和花粉生長受到抑制最強列的區(qū)域。在包圍胚珠的胎座表皮細胞中檢測到了低水平的 S-RNase的表達。由此可見，在花粉管進入胚珠必須通過的組織中均有S-RNase的表達，它 的分布位置與花粉管伸長的途徑相一致。只有S-RNase的濃度達到一定的閥值，自交不親 和才能發(fā)生，S-蛋白的表達量與花的發(fā)育過程顯著相關。一般來說，S-RNase與S-位點共 分離本身并不能證明它一定是S基因產(chǎn)物，因為可能是與S基因緊密連鎖基因的表達產(chǎn)物。 但是，目前已有有利證據(jù)證明S-RNase就是S位點在花柱中的產(chǎn)物。S-蛋白序列表現(xiàn)出高 度的差異性，這些序列的多態(tài)性為分子識別提供了可能。
[0006] 但是，目前對于通過鑒定品種的S基因型認識不同，并且檢測設備、技術條件要求 高，使枇杷品種的自交親和品種鑒定進展一直十分緩慢，因此，枇杷的自交親和品種鑒定是 一個極其薄弱而又急待加強的研究領域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術中枇杷的自交親和品種的鑒定時間長、技術薄弱等問題，本發(fā)明通 過提供一種枇杷品種（系）自交親和S-RNase基因型Si分子標記、標記引物及枇杷自交親 和品種快速鑒定方法，適用于枇杷自交親和性（S基因型）品種（系）的鑒定、指導育種親 本的選擇。
[0008] 本發(fā)明的目的通過以下技術手段獲得：
[0009] 1、本發(fā)明提供一種枇杷自交親和品種快速鑒定分子標記，該分子標記為枇杷 S-RNase基因型Si,序列如SEQ ID NO. 1所示，大小為830bp。
[0010] 2、本發(fā)明還提供一種枇杷自交親和品種快速鑒定分子標記引物，該標記引物 AS-PCR序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO. 2;反向引物序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 3、本發(fā)明還提供一種枇杷自交親和品種快速鑒定方法，該鑒定方法以枇杷 S-RNase基因型Si作為分子標記，其序列如SEQ ID NO. 1所示；WSi分子標記引物：正向引 物序列如SEQ ID NO. 2;反向引物序列如SEQ ID NO. 3所示，進行篩選，AS-PCR擴增不同枇 杷品種DNA，可擴增出830bp的擴增片段，標志著枇杷S-RNase基因型S i的存在，說明該枇 把品種為自受未和品種。
[0012] 4、根據(jù)上述3提供的枇杷自交親和品種快速鑒定方法，其中，25 μ L AS-PCR擴增 反應體系中含有10\卩〇?1311打6『2.5±0.25 4 1^2.5臟〇1*1^-1的(1階138 2.0±0.2 4 1^ 2. 5mmol .L-I 的MgCl22. 0±0· 2μ L，IU Tap DNA聚合酶 1±0· 1 μ L，5pmol · μ L-I 的AS-PCR 上、下游引物1±〇. 1 μ L。
[0013] 5、根據(jù)上述3提供的枇杷品種自交親和Si基因型AS-PCR分子標記鑒定方法， 其中，擴增熱循環(huán)參數(shù)為：94°C預變性2min，然后94°C變性15s，55°C退火30s，70°C延伸 2min，共30個循環(huán)，最后70°C延伸7min。
[0014] 6、根據(jù)上述3提供的枇杷品種自交親和Si基因型的AS-PCR分子標記鑒定方法， 其中，標記引物擴增產(chǎn)物經(jīng)2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0015] 有益效果：
[0016] 本發(fā)明通過試驗研究獲得了枇杷品種（系）自交親和Si分子標記，以此分子標記 為基礎，設計分子標記引物，快速鑒定枇杷自交親和品種，不需要配置授粉樹或進行人工授 粉，可以大大地節(jié)約人工和生產(chǎn)成本；同時，不易受外界環(huán)境和生育期等因素影響，鑒定精 確度大，誤差小，打破了傳統(tǒng)方法的局限性，對提高枇杷的產(chǎn)量和品質(zhì)有很大的意義。對于 自交品種很少的枇杷來說，如果能快速鑒定出枇杷自交親和，不僅可以減少選種時的盲目 性，獲得高產(chǎn)量和優(yōu)質(zhì)品種，還能豐富枇杷的種質(zhì)資源，為有效的分子鑒定方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1親和品種和不親和品種自交授粉72小時后花粉管的萌發(fā)狀況熒光圖
[0018] Α·上海種（親和）自交授粉72h;B.白玉（不親和）自交授粉72h
[0019] 圖2利用AS-PCR引物對枇杷的Si基因型進行檢測的電泳圖
[0020] M為DNA Marker ;泳道1?13依次為枇杷品種：1紅燈籠（S6Si)、2千禧佩玉（S6S i)、 3 解放鐘（S11S31)、4 常綠 12 (S2S31)、5 東山雞蛋白（S2S31)、6 串腦（S7S11)、7 白玉（S2S31)、8 霸 紅（S31S31)、9 西山雞蛋白（S31S11)、10 冰糖種（S7S11)、11 冠玉（S2S8)、12 豐玉（S2S2)、13 上海 種（S7Si)

【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照本領域的公知手段。
[0022] 實施例1
[0023] 1.品種鑒定
[0024] 選取紅燈籠、千禧佩玉、解放鐘、常綠12、東山雞蛋白、串腦、白玉、霸紅、西山雞蛋 白、冰糖種、冠玉、豐玉、上海種13個枇杷品種（江蘇省太湖常綠果樹技術推廣中心提供，以 上品種面向社會開放）。
[0025] 用熒光顯微鏡法觀察13個品種自交授粉72小時后花粉管的發(fā)狀況來統(tǒng)計座果 率，以此判斷品種是否為自交品種，如表1，通過自交授粉座果率可以看出紅燈籠、千禧佩 玉、上海種為自交親和品種，解放鐘、常綠12、東山雞蛋白、串腦、白玉、霸紅、西山雞蛋白、冰 糖種、冠玉、豐玉為自交不親和品種。
[0026] 表1自交授粉座果率統(tǒng)計
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種枇杷自交親和品種快速鑒定分子標記，其特征在于：該分子標記為枇杷 S-RNase基因型Sp序列如SEQ ID NO. 1所示，大小為830bp。
2. -種枇杷自交親和品種快速鑒定分子標記引物，其特征在于：該標記引物AS-PCR序 列如下：正向引物序列如SEQ ID NO. 2 ;反向引物序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. -種枇杷自交親和品種快速鑒定方法，其特征在于：該鑒定方法以枇杷S-RNase基 因型Si作為分子標記，其序列如SEQ ID NO. 1所示；分子標記引物：正向引物序列如 SEQ ID NO. 2;反向引物序列如SEQ ID NO. 3所示，進行篩選，AS-PCR擴增不同枇杷品種DNA， 可擴增出830bp的擴增片段，標志著枇杷S-RNase基因型Si的存在，說明該枇杷品種為自 受未和品種。
4. 權(quán)利要求3所述的枇杷自交親和品種快速鑒定方法，其特征在于：25iiL AS-PCR擴 增反應體系中含有 10XPCR buffer 2. 5±0. 25ii L，2. 5mmol ? L-1 的 dNTPs2. 0±0. L， 2. 5mmol .L-l 的MgCl22. 0±0. L，1U Tap DNA聚合酶 1±0. 1 ii L，5pmol ? ii L-l 的AS-PCR 上、下游引物l±〇. 1 y L。
5. 權(quán)利要求3所述的枇杷自交親和品種快速鑒定方法，其特征是：擴增熱循環(huán)參數(shù)為： 94°C預變性2min，然后94°C變性15s，55°C退火30s，70°C延伸2min，共30個循環(huán)，最后70°C 延伸7min。
6. 權(quán)利要求3所述的枇杷自交親和品種快速鑒定方法，其特征是：標記引物擴增產(chǎn)物 經(jīng)2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
【文檔編號】C12N15/11GK104404156SQ201410742192
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】王三紅, 汪茜 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學