利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產(chǎn)菌株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產(chǎn)菌株的方法，首先取赤霉菌菌株用無菌水制成108~109個/mL的原生質(zhì)體懸浮液；將原生質(zhì)體懸浮液涂布到培養(yǎng)皿中風(fēng)干；將氮離子束脈沖注入到風(fēng)干后的原生質(zhì)體內(nèi)，誘發(fā)菌體變異；將誘變后的原生質(zhì)體加入山梨醇溶液冰浴，懸浮后涂布于PDAS再生培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)；將生長良好的單菌株接種于盛裝液體發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中進行振蕩培養(yǎng)，即可獲得赤霉酸高產(chǎn)菌株。本發(fā)明的優(yōu)點在于利用氮離子束脈沖注入的方式對赤霉菌進行誘變，可選育出高產(chǎn)的赤霉菌突變株，采用本發(fā)明方法，突變株正突變率可達10%~40%，發(fā)酵效價比出發(fā)菌株提高30~90%。
【專利說明】利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產(chǎn)菌株的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物誘變技術(shù)，尤其是涉及一種利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉 酸高產(chǎn)菌株的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 赤霉酸（gibberellic acid)是一種屬于雙廠類化合物的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有促 進種子發(fā)芽和植物生長、提早開花結(jié)果等作用，對農(nóng)作物、蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)都有明顯的促 進作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和釀造業(yè)中有著廣泛應(yīng)用。隨著農(nóng)業(yè)技術(shù)的推廣和蔬菜水果種植業(yè)的 擴大，赤霉酸的需求量提高很快，生產(chǎn)量滿足不了市場實際需求量。
[0003] 赤霉酸主要依靠藤倉赤霉菌（Gibberella fujikuroi)發(fā)酵生產(chǎn)。赤霉酸的生產(chǎn) 至今已半個世紀(jì)的歷史，菌種的改良主要依靠 UV、X射線、同位素6tlCo照射和化學(xué)法誘變 等傳統(tǒng)的育種方法，一般的誘變劑效果并不明顯，未能取得較滿意的結(jié)果。另一方面，抗性 篩選菌株因具有代謝定向特性而受到重視，但是存在著目標(biāo)不明確，費時費力而且收效不 明顯的問題。如：李武軍等對菌體原生質(zhì)體進行誘變，原生質(zhì)體融合重組選育；構(gòu)建攜帶血 紅蛋白基因的藤倉赤霉菌工程株等；張金兒等應(yīng)用氯霉素抗性篩選法，獲得赤霉素產(chǎn)量高 于出發(fā)菌20%的陽性氯霉素抗性突變株；王衛(wèi)等采用制霉菌素抗性篩選獲得產(chǎn)赤霉素能力 提1? 16. 8%的菌株等。目如國內(nèi)外赤霉素的生廣效價呈現(xiàn)出徘徊不如的狀態(tài)，而且有的生 產(chǎn)菌種出現(xiàn)退化。國內(nèi)外大規(guī)模商業(yè)化的赤霉酸生產(chǎn)均通過赤霉菌經(jīng)液態(tài)深層發(fā)酵后對發(fā) 酵液的提取而獲得，赤霉酸的發(fā)酵水平也參差不齊，約在I. 2~2g/L之間。因此，提高赤霉酸 的發(fā)酵效價，從現(xiàn)有菌種出發(fā)，通過誘變篩選出更加高產(chǎn)的菌株，進一步提高赤霉酸的發(fā)酵 水平十分必要。
[0004] 近些年來，離子束作為一種新的誘變源，在微生物誘變育種方面因其獨特的誘變 機理和生物學(xué)效應(yīng)而發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)誘變源相比，低能離子束注入是一種集物理與化學(xué) 誘變特性為一體的綜合誘變技術(shù)，它能夠在低劑量注入的情況下，引起染色體的畸變，導(dǎo)致 DNA鏈堿基的損傷、斷裂，從而使遺傳物質(zhì)在基因或分子水平上發(fā)生改變或缺失，明顯提高 變異的頻率，獲得對生物體生理損傷小、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定的誘變效果。
[0005] 離子注入技術(shù)被應(yīng)用于微生物優(yōu)良菌株的選育和改良研究中，已選育出一些在工 業(yè)上具有較大應(yīng)用前景的生物新品種，并取得了顯著的經(jīng)濟和社會效益。而把低能離子束 注入法用于赤霉酸生產(chǎn)菌株的選育，則還未見有相關(guān)專利和文獻報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產(chǎn)菌株的方 法，該方法可有效提高赤霉酸的產(chǎn)量。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案： 本發(fā)明所述的利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產(chǎn)菌株的方法，包括下述步驟： 第一步，原生質(zhì)體的制備： 取赤霉菌菌株用無菌水制成108~109個/mL的原生質(zhì)體懸浮液； 第二步，氮離子注入誘變： 將第一步得到的原生質(zhì)體懸浮液涂布到培養(yǎng)皿中，無菌狀態(tài)下風(fēng)干；將能量IOlOkeV 的氮離子束脈沖注入到風(fēng)干后的原生質(zhì)體內(nèi)，誘發(fā)菌體變異； 第二步，1?廣菌株的篩選和獲得： 將第二步誘變后的原生質(zhì)體加入濃度lmol/L的山梨醇溶液冰浴，懸浮后涂布于PDAS 再生培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)；將培養(yǎng)出的生長良好、直徑2~4_的單菌株接種于盛裝液體發(fā)酵 培養(yǎng)基的搖瓶中進行振蕩培養(yǎng)，即可獲得發(fā)酵效價I. 8~2. lg/L的赤霉酸高產(chǎn)菌株。
[0008] 第三步中所用的山梨醇溶液中含有10mmol/L的Tris-Cl, pH7. 5 ;50mmol/L的 CaCl2。所用的PDAS固體再生培養(yǎng)基中含有土豆汁20%，葡萄糖2%，NaCl 3. 59Γ4. 1%，瓊脂 1. 5%?2%，ρΗ6· 0?6· 5。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點在于利用氮離子束脈沖注入的方式對赤霉菌進行誘變，可選育出高 產(chǎn)的赤霉菌突變株，采用本發(fā)明方法，突變株正突變率可達1〇%~40%，發(fā)酵效價比出發(fā)菌株 提高3(Γ90%。與其他傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點體現(xiàn)在如下幾點： 1、 由于離子束注入誘變是一種集物理和化學(xué)誘變特征于一體的綜合誘變，具有對生物 細(xì)胞損傷小的特點，因此采用該方法誘變的菌株正突變率高，誘變效果好； 2、 采用本發(fā)明方法選育出的高產(chǎn)赤霉酸菌株，具有高產(chǎn)性狀穩(wěn)定，不易丟失的優(yōu)點，經(jīng) 過10代以上轉(zhuǎn)接，效價仍能保持篩選后的水平，產(chǎn)赤霉酸量在I. 9~2. 3g/L之間。
[0010] 3、采用本發(fā)明誘變篩選的高產(chǎn)赤霉酸菌株，經(jīng)過3m3發(fā)酵罐試驗，效價仍能保持較 高水平，產(chǎn)赤霉酸量在1.8~2. lg/L。見下表1。證明本發(fā)明方法篩選出的菌株有利于大規(guī) 模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0011] 表1本發(fā)明選育的高產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株的產(chǎn)量比較

【權(quán)利要求】
1. 一種利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于：包括下述 步驟： 第一步，原生質(zhì)體的制備： 取赤霉菌菌株用無菌水制成108~109個/mL的原生質(zhì)體懸浮液； 第二步，氮離子注入誘變： 將第一步得到的原生質(zhì)體懸浮液涂布到培養(yǎng)皿中，無菌狀態(tài)下風(fēng)干；將能量KT20keV 的氮離子束脈沖注入到風(fēng)干后的原生質(zhì)體內(nèi)，誘發(fā)菌體變異； 第二步，1?廣菌株的篩選和獲得： 將第二步誘變后的原生質(zhì)體加入濃度lmol/L的山梨醇溶液冰浴，懸浮后涂布于PDAS 再生培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)；將培養(yǎng)出的生長良好、直徑2~4mm的單菌株接種于盛裝液體發(fā)酵 培養(yǎng)基的搖瓶中進行振蕩培養(yǎng)，即可獲得發(fā)酵效價1. 8~2. lg/L的赤霉酸高產(chǎn)菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產(chǎn)菌株的方法，其 特征在于：第三步中所用的山梨醇溶液中含有10mm〇l/L的Tris-Cl, pH7. 5 ;50mmol/L的 CaCl2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用低能離子誘變赤霉菌選育赤霉酸高產(chǎn)菌株的方法， 其特征在于：第三步中所用的PDAS固體再生培養(yǎng)基中含有土豆汁20%，葡萄糖2%，NaCl 3. 5%?4. 1%，瓊脂 1. 5%?2%，pH6. 0?6. 5。
【文檔編號】C12N15/01GK104388418SQ201410671197
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】張一折, 張書杰, 朱朝印, 馬軒, 劉建華, 方業(yè)忠 申請人:鄭州大學(xué), 孟州農(nóng)達生化制品有限公司