專利名稱：耐高溫的阿魏菇突變株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三株耐高溫的食用菌菌株，具體地涉及通過離子束誘變技術(shù)獲得的三株具有耐高溫性能、遺傳穩(wěn)定的阿魏菇突變株。
背景技術(shù)：
阿魏菇(Pleurotus ferulae Lenzi)，又名阿魏側(cè)耳、白靈蘑，商品名為白靈菇，屬擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬，子實(shí)體單生，菌蓋直徑5-15厘米，初期扁半球形，后漸平展，最后靠近基部下呈凹扁形，表面有龜裂斑，始終為白色，較厚，菌褶延生，稍密，菌褶淡黃色，菌柄白色，長2-6厘米，向基部漸細(xì)。
野生阿魏菇主要分布于新疆準(zhǔn)葛爾盆地荒漠區(qū)的伊犁、塔城和阿勒泰地區(qū)，其中阿勒泰地區(qū)青河縣的阿魏菇以色澤純正、味道鮮美、營養(yǎng)價值高而享譽(yù)國內(nèi)外。阿魏菇每年春末夏初發(fā)生，腐生或兼寄生在傘形科藥用植物阿魏死根莖上。因此，有與中藥阿魏相同的調(diào)節(jié)人體生理平衡，增強(qiáng)人體免疫力的功效。阿魏菇可入藥具有消積殺蟲作用，對于腹部腫塊、肝脾腫大、脘腹冷痛等具有治療效果。阿魏菇以營養(yǎng)豐富，兼具有多種藥用功效，逐漸成為一種大眾公認(rèn)的保健食品，其鮮品、干制品及深加工產(chǎn)品深受國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。近年來，阿魏菇已成為我國商品性栽培食用菌的重要品種。
阿魏菇的人工栽培對溫度的要求非常嚴(yán)格，過高的溫度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸的變性失活，而過低的溫度會使酶活力受到抑制，細(xì)胞的新陳代謝活動減弱。阿魏菇是一種低溫型的食用菌，菌絲生長的最適溫度較低，僅為23℃～25℃，如果溫度過高，如35℃～36℃菌絲則停止生長；菇蕾發(fā)育最適溫度僅為0～13℃，子實(shí)體發(fā)育的溫度白天僅為10～15℃，夜晚為5～8℃。由于阿魏菇人工栽培對溫度要求嚴(yán)格，并且菇蕾形成期、出菇期的溫度如果過高會導(dǎo)致菇蕾形成困難和難以出菇，從而造成減產(chǎn)或絕收，從而給阿魏菇的周年生產(chǎn)帶來困難。
目前，阿魏菇反季節(jié)的生產(chǎn)由于受到種質(zhì)的限制，商品性好的阿魏菇都是通過冷房模式生產(chǎn)出的阿魏菇，因而成本非常高。因此，為了解決這一突出矛盾，誘變篩選獲得適用于反季節(jié)生產(chǎn)的耐高溫菌株就顯得尤為重要。
食用菌誘變育種是人為利用某些理化因子誘導(dǎo)食用菌的遺傳因子發(fā)生突變，再從多種突變體中選出適宜突變菌株的方法，誘變育種是獲得優(yōu)良食用菌菌株的常用手段。目前對食用菌誘變育種較為有效的理化因子包括60Co、紫外線、激光、X射線、超聲波、快中子、亞硝酸、亞硝酸胍、氮芥、硫酸二乙酯等，研究人員根據(jù)各自的實(shí)驗(yàn)條件及不同菌種的特點(diǎn)選擇不同的誘變劑，在食用菌新菌種的選育工作中已取得了不少成果。離子束誘變技術(shù)是由我國科技工作者于20世紀(jì)80年代中期開創(chuàng)的一種新的育種方法，離子束誘變法與傳統(tǒng)的輻射法及化學(xué)誘變劑誘變法相比，具有損傷輕、突變率高、突變譜寬、易于獲得理想菌株等特點(diǎn)，目前在微生物新品種的選育中取得了豐碩的成果。
本申請的發(fā)明人經(jīng)過多年的潛心研究，通過離子束誘變技術(shù)從青河野生阿魏菇中分離獲得了三株菌絲生長最適溫度、菇蕾形成期和出菇期的溫度均高于野生阿魏菇，并且遺傳穩(wěn)定的耐高溫突變株，從而實(shí)現(xiàn)了阿魏菇的周年生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面提供通過離子束誘變技術(shù)從青河野生阿魏菇中獲得的三種耐高溫的阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)，其分別為阿魏菇青格里1號CGMCC 1761、阿魏菇青格里2號CGMCC 1762和阿魏菇青格里3號CGMCC1763。
其中，阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)青格里1號CGMCC 1761是一種耐高溫的阿魏菇突變株，菌絲生長的最適溫度為28-32℃，菌絲生長和出菇各階段的溫度均高于野生阿魏菇，成熟后菇形為掌形。
阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)青格里2號CGMCC 1762是一種耐高溫的阿魏菇突變株，菌絲生長的最適溫度為28-31℃，菌絲生長和出菇各階段的溫度均高于野生阿魏菇，成熟后菇形為圓形。
阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)青格里3號CGMCC 1763是一種耐高溫的阿魏菇突變株，菌絲生長的最適溫度為27-31℃，菌絲生長和出菇各階段的溫度均高于野生阿魏菇，成熟后菇形為馬蹄形。
本發(fā)明的另一個方面提供利用這三種耐高溫突變株培育阿魏菇的方法，該方法包括菌株斜面培養(yǎng)、種瓶和/或發(fā)酵罐培養(yǎng)、菌袋培養(yǎng)以及出菇培養(yǎng)的步驟。優(yōu)選地，在出菇培養(yǎng)的步驟中還包括向菌袋中注入出菇水的步驟，其中出菇水的配方為α-奈乙酸0.0025％、赤霉素0.0025％、30烷醇0.025％，其余為無菌水。
三種阿魏菇突變株均具有耐高溫的性能，使反季節(jié)生產(chǎn)阿魏菇變得容易，并且大大降低了成本，從而實(shí)現(xiàn)了阿魏菇的周年生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、野生阿魏菇菌絲細(xì)胞的離子束誘變篩選用無菌接種鉤挑取一定量的青河野生阿魏菇新生菌絲，接入裝有玻璃珠及30ml無菌水的150ml錐形瓶中，將菌絲盡量打散，用雙層濾紙加單層脫脂棉過濾，制備菌絲單細(xì)胞懸液。在菌絲單細(xì)胞懸液中加入20％的脫脂奶作為保護(hù)劑，用移液器移取0.2ml菌絲單細(xì)胞懸液涂布于Φ90mm的無菌空白培養(yǎng)皿中，置于超凈臺風(fēng)干，制成菌膜。
用不同劑量的N+束對菌膜進(jìn)行輻照處理，處理后將菌膜用2ml無菌水洗脫，用移液器移取0.2ml菌絲單細(xì)胞懸液涂布于綜合平板培養(yǎng)基上，在青河野生阿魏菇菌絲生長的極限溫度條件下恒溫培養(yǎng)10-15天，觀察菌絲的長勢并記錄數(shù)據(jù)。接著用無菌牙簽挑取在綜合平板培養(yǎng)基上長出的單菌落菌絲，分別對應(yīng)接種于基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基和綜合平板培養(yǎng)基上，在突變株菌絲生長的最適溫度條件下恒溫培養(yǎng)，觀察菌絲的長勢并記錄數(shù)據(jù)。然后再將在基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基上不能生長，而在對應(yīng)的綜合平板培養(yǎng)基上能夠正常生長的單菌落接種到篩選平板培養(yǎng)基上，在突變株菌絲生長的最適溫度條件下恒溫培養(yǎng)，篩選耐高溫菌株。
其中，基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基的成分為(w/v)玉米淀粉1.0％、葡萄糖2.0％、KH2PO40.2％、MgSO40.15％、瓊脂2.0％，其余為無菌水；綜合平板培養(yǎng)基的成分為(w/v)小麥粉1.5％、酵母膏0.4％、KH2PO40.2％、MgSO40.2％、麩皮3.0％、瓊脂2.0％，其余為無菌水；篩選平板培養(yǎng)基在基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基中加入0.2ml 100ppm的18種氨基酸和維生素B1、B2、B6溶液。
經(jīng)過上述阿魏菇菌絲細(xì)胞的離子束篩選，獲得兩株耐高溫的阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)，命名為青格里1號和青格里2號，并且將這兩株突變株于2006年7月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號分別為CGMCC 1761和CGMCC 1762。
阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)CGMCC 1761是一種苯丙氨酸、絲氨酸、賴氨酸、維生素B6營養(yǎng)缺陷型耐高溫菌株，菌絲生長的最適溫度為28-32℃。在出菇階段中，催蕾期、米粒期的溫度為白天18℃、夜晚8℃；形成期的溫度為白天22℃、夜晚14℃；展開期、成熟期的溫度為白天20℃、夜晚12℃，成熟后菇形為掌形。該耐高溫菌株的菌絲生長和出菇階段的溫度均高于野生阿魏菇(青河野生阿魏菇菌絲生長的最適溫度為23℃～25℃，菇蕾發(fā)育最適溫度為0～13℃，子實(shí)體發(fā)育的溫度為白天10～15℃，夜晚5～8℃)，適于周年生產(chǎn)。
阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)CGMCC 1762是一種賴氨酸、維生素B6營養(yǎng)缺陷型耐高溫菌株，菌絲生長的最適溫度為28-31℃。在出菇階段中，催蕾期、米粒期的溫度為白天16℃、夜晚6℃；形成期的溫度為白天20℃、夜晚12℃；展開期、成熟期的溫度為白天18℃、夜晚12℃，成熟后菇形為圓形。菌絲生長和出菇階段的溫度均高于野生阿魏菇，適于周年生產(chǎn)。
實(shí)施例2、青河野生阿魏菇分生孢子的離子束誘變?nèi)∫黄磭姲l(fā)分生孢子的青河野生阿魏菇子實(shí)體，將其置于放有培養(yǎng)皿的干燥器中，讓其自然噴發(fā)，噴發(fā)后，將分生孢子收集起來，將收集的分生孢子用2ml無菌水洗脫、稀釋制成一定濃度的分生孢子懸液。在分生孢子懸液中加入20％的脫脂奶作為保護(hù)劑，取0.2ml分生孢子懸液涂于Φ90mm的無菌空白培養(yǎng)皿中，置于超凈臺風(fēng)干，制成菌膜。
用不同劑量的N+束對菌膜進(jìn)行輻照處理，處理后將菌膜用2ml無菌水洗脫，用移液器移取0.2ml分生孢子懸液涂布于綜合平板培養(yǎng)基上，在青河野生阿魏菇菌絲生長的極限溫度條件下恒溫培養(yǎng)10-15天，觀察孢子的萌發(fā)、菌絲的長勢并記錄數(shù)據(jù)。接著用無菌牙簽挑取在綜合平板培養(yǎng)基上長出的單菌落菌絲，分別對應(yīng)接種于基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基和綜合平板培養(yǎng)基上，在突變株菌絲生長的最適溫度條件下恒溫培養(yǎng)，觀察菌絲的長勢并記錄數(shù)據(jù)。然后再將在基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基上不能生長，而在對應(yīng)的綜合平板培養(yǎng)基上能夠正常生長的單菌落接種到篩選平板培養(yǎng)基上，在突變株菌絲生長的最適溫度條件下恒溫培養(yǎng)，篩選耐高溫菌株。
綜合平板培養(yǎng)基、基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基和篩選平板培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例1。
經(jīng)過上述分生孢子的離子束誘變篩選，獲得了一株耐高溫的阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)，命名為青格里3號，并且將該菌株于2006年7月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC 1763。
阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)CGMCC 1763是一種耐高溫的阿魏菇菌株，菌絲生長的最適溫度為27-31℃。在出菇階段中，催蕾期、米粒期的溫度為白天18℃、夜晚8℃；形成期的溫度為白天22℃、夜晚16℃；展開期、成熟期的溫度為白天20℃、夜晚14℃，成熟后菇形為馬蹄形。菌絲生長和出菇階段的溫度均高于野生阿魏菇，適于周年生產(chǎn)。
實(shí)施例3、阿魏菇青格里1號的培養(yǎng)阿魏菇的培養(yǎng)過程包括菌株斜面培養(yǎng)、種瓶和/或發(fā)酵罐培養(yǎng)、菌袋培養(yǎng)以及出菇培養(yǎng)幾個階段。經(jīng)過種瓶和/或發(fā)酵罐培養(yǎng)后，將發(fā)酵液接種于菌袋中，在菌絲的最適溫度條件下恒溫培養(yǎng)，待菌絲生理成熟后搔菌注入出菇水，進(jìn)行出菇培養(yǎng)。
(1)、斜面培養(yǎng)用無菌接種鉤刮取少量阿魏菇青格里1號(CGMCC 1761)，接種到PDA培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)5天；(2)、種瓶培養(yǎng)用無菌接種鉤挑取一定量的經(jīng)斜面培養(yǎng)的新生菌絲，接種到裝有100ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，以200轉(zhuǎn)/分，28℃恒溫培養(yǎng)144小時；其中種子培養(yǎng)基為按木屑粉78％、麩皮粉17％、白砂糖1％、石膏1％、石灰3％的比例配制，然后溶于無菌水中，使培養(yǎng)基的含水量為60％；(3)、發(fā)酵罐培養(yǎng)將經(jīng)過種瓶培養(yǎng)的菌絲按1∶10的接種量接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以200轉(zhuǎn)/分，30℃發(fā)酵120小時；經(jīng)過發(fā)酵，發(fā)酵液清澈，菌絲球大小均勻，顏色為褐色。其中，發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基為小麥粉1.0％，蔗糖0.5％，酵母膏0.2％，KH2PO40.2％，MgSO40.15％，麩皮1.5％，其余為無菌水；(4)、菌袋培養(yǎng)將發(fā)酵液按1∶10的接種量接種于裝有菌袋培養(yǎng)基的菌袋中，在29℃培養(yǎng)80天，待長滿菌絲后在0℃冷刺激20天。其中菌袋培養(yǎng)基為按棉籽殼74.8％，麩皮15％，玉米粉6.0％，KH2PO40.2％，石膏1.0％，石灰3.0％的比例配制，然后溶于無菌水中，使培養(yǎng)基的含水量為60％；(5)、出菇培養(yǎng)向菌袋中注入出菇水，每個菌袋(1.1-1.2kg)中注入0.2ml出菇水。出菇水的配方為α-奈乙酸0.0025％，赤霉素0.0025％，30烷醇0.025％，其余為無菌水。青格里1號出菇階段的培養(yǎng)條件為催蕾期、米粒期的溫度為白天18℃、夜晚8℃，濕度80％，光照300lx，CO2濃度＜0.03％-0.04％；形成期的溫度為白天22℃、夜晚14℃，濕度90％，光照600lx，CO2濃度＜0.03％-0.04％；展開期、成熟期的溫度為白天20℃、夜晚12℃，濕度85％，光照800lx，CO2濃度＜0.03％-0.04％，成熟后菇形為掌形。
實(shí)施例4、阿魏菇青格里2號的培養(yǎng)阿魏菇的培養(yǎng)過程包括菌株斜面培養(yǎng)、種瓶和/或發(fā)酵罐培養(yǎng)、菌袋培養(yǎng)以及出菇培養(yǎng)幾個階段。經(jīng)過種瓶和/或發(fā)酵罐培養(yǎng)后，將發(fā)酵液接種于菌袋中，在菌絲的最適溫度條件下恒溫培養(yǎng)，待菌絲生理成熟后搔菌注入出菇水，進(jìn)行出菇培養(yǎng)。
(1)、斜面培養(yǎng)用無菌接種鉤刮取少量阿魏菇青格里2號(CGMCC1762)，接種到PDA培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)5天；(2)、種瓶培養(yǎng)用無菌接種鉤挑取一定量的經(jīng)斜面培養(yǎng)的新生菌絲，接種到裝有100ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，以200轉(zhuǎn)/分，28℃恒溫培養(yǎng)168小時；種子培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3；(3)、發(fā)酵罐培養(yǎng)將經(jīng)過種瓶培養(yǎng)的菌絲按1∶10的接種量接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以200轉(zhuǎn)/分，28℃發(fā)酵144小時；經(jīng)過發(fā)酵，發(fā)酵液清澈，菌絲球大小均勻，顏色為橙色。發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3；(4)、菌袋培養(yǎng)將發(fā)酵液按1∶10的接種量接種于裝有菌袋培養(yǎng)基的菌袋中，在28℃培養(yǎng)90天，待長滿菌絲后在0℃冷刺激30天；菌袋培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3；(5)、出菇培養(yǎng)向菌袋中注入出菇水，每個菌袋(1.1-1.2kg)中注入0.2ml出菇水。出菇水的配方同實(shí)施例3。青格里2號出菇階段的培養(yǎng)條件為催蕾期、米粒期的溫度為白天16℃、夜晚6℃，濕度80％，光照300lx，CO2濃度＜0.03％-0.04％；形成期的溫度為白天20℃、夜晚12℃，濕度90％，光照600lx，CO2濃度＜0.03％-0.04％；展開期、成熟期的溫度為白天18℃、夜晚12℃，濕度85％，光照800lx，CO2濃度＜0.03％-0.04％，成熟后菇形為圓形。
實(shí)施例5、阿魏菇青格里3號的培養(yǎng)阿魏菇的培養(yǎng)過程包括菌株斜面培養(yǎng)、種瓶和/或發(fā)酵罐培養(yǎng)、菌袋培養(yǎng)以及出菇培養(yǎng)幾個階段。經(jīng)過種瓶和/或發(fā)酵罐培養(yǎng)后，將發(fā)酵液接種于菌袋中，在菌絲的最適溫度條件下恒溫培養(yǎng)，待菌絲生理成熟后搔菌注入出菇水，進(jìn)行出菇培養(yǎng)。
(1)、斜面培養(yǎng)用無菌接種鉤刮取少量阿魏菇青格里3號(CGMCC1763)，接種到PDA培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)5天；(2)、種瓶培養(yǎng)用無菌接種鉤挑取一定量的經(jīng)斜面培養(yǎng)的新生菌絲，接種到裝有100ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，以200轉(zhuǎn)/分，28℃恒溫培養(yǎng)156小時；種子培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3；(3)、發(fā)酵罐培養(yǎng)將經(jīng)過種瓶培養(yǎng)的菌絲按1∶10的接種量接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以200轉(zhuǎn)/分，30℃發(fā)酵144小時；經(jīng)過發(fā)酵，發(fā)酵液清澈，菌絲球大小均勻，顏色為米白色。發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3；(4)、菌袋培養(yǎng)將發(fā)酵液按1∶10的接種量接種于裝有菌袋培養(yǎng)基的菌袋中，在28℃培養(yǎng)85天，待長滿菌絲后在0℃冷刺激25天；菌袋培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3；(5)、出菇培養(yǎng)向菌袋中注入出菇水，每個菌袋(1.1-1.2kg)中注入0.2ml出菇水。出菇水的配方同實(shí)施例3。青格里3號出菇階段的培養(yǎng)條件為催蕾期、米粒期的溫度為白天18℃、夜晚8℃，濕度80％，光照300lx，CO2濃度＜0.03％-0.04％；形成期的溫度為白天22℃、夜晚16℃，濕度90％，光照600lx，CO2濃度＜0.03％-0.04％；展開期、成熟期的溫度為白天20℃、夜晚14℃，濕度85％，光照800lx，CO2濃度＜0.03％-0.04％，成熟后菇形為馬蹄形。
通過上述具體的實(shí)施例，更容易理解本發(fā)明。上述實(shí)施例只是舉例性的描述，而不應(yīng)當(dāng)被理解為用來限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種耐高溫的阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)青格里1號CGMCC 1761。
2.一種耐高溫的阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)青格里2號CGMCC 1762。
3.一種耐高溫的阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)青格里3號CGMCC 1763。
4.一種利用權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的突變株培育阿魏菇的方法，其特征在于包括菌株斜面培養(yǎng)、種瓶和/或發(fā)酵罐培養(yǎng)、菌袋培養(yǎng)以及出菇培養(yǎng)的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于在出菇培養(yǎng)的步驟中還包括向菌袋中注入出菇水。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中出菇水的配方為α-奈乙酸0.0025％、赤霉素0.0025％、30烷醇0.025％，其余為無菌水。
全文摘要
本發(fā)明提供通過離子束誘變方法從青河野生阿魏菇中獲得的三種耐高溫的阿魏菇突變株(Pleurotus ferulae)，其分別為阿魏菇青格里1號CGMCC 1761、阿魏菇青格里2號CGMCC 1762和阿魏菇青格里3號CGMCC 1763。本發(fā)明還提供利用這三種耐高溫突變菌株培育阿魏菇的方法，該方法包括菌株斜面培養(yǎng)、種瓶和/或發(fā)酵罐培養(yǎng)、菌袋培養(yǎng)以及出菇培養(yǎng)的步驟。優(yōu)選地，在出菇培養(yǎng)的步驟中還包括向菌袋中注入出菇水的步驟，其中出菇水的配方為α－奈乙酸0.0025％、赤霉素0.0025％、30烷醇0.025％，其余為無菌水。三株耐高溫阿魏菇突變株的菌絲生長最適溫度、菇蕾形成期和出菇期的溫度均高于野生阿魏菇，而且遺傳穩(wěn)定，從而使反季節(jié)生產(chǎn)阿魏菇變得容易，并且大大降低了成本，實(shí)現(xiàn)了阿魏菇的周年生產(chǎn)。
文檔編號A01G1/04GK1888049SQ20061010345
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月24日
發(fā)明者曾憲賢, 呂杰, 陳恒雷, 呂長武, 付永前 申請人:曾憲賢, 呂杰, 陳恒雷