一種檢測Von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的樣品制備試劑盒。具體的涉及一種應(yīng)用大規(guī)模平行測序平臺技術(shù)檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因的產(chǎn)品，該試劑盒包括：A.獨特設(shè)計并制備捕獲探針，針對基因VHL全部外顯子片段；B.設(shè)計獨特帶有標簽序列的接頭；C.通用引物對探針序列進行PCR擴增；D.設(shè)計獨特的混合后目的片段的捕獲操作。這個方法和試劑盒制備的大規(guī)模平行測序平臺樣品通量大、效率高、操作簡便，極大地降低了測序檢驗成本。
【專利說明】-種檢測Von Hippe卜Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑 合 Sl

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)診斷和生物技術(shù)，涉及一種檢測Von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的體外診斷試劑盒，是一種應(yīng)用于新一代測序平臺技 術(shù)的一種Von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑盒。 技術(shù)背景
[0002] Von Hippel-Lindau(VHL)綜合征是由抑癌基因 VHL突變所致的一種遺傳性腫瘤 綜合征，表現(xiàn)為多種惡性或良性腫瘤，最常見的包括視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細胞瘤、 腎透明細胞癌、嗜鉻細胞瘤、胰腺腫瘤等。
[0003] VHL綜合征呈常染色體顯性遺傳，發(fā)病率為每年1/36000, VHL是目前已知的唯一 致病基因。該病發(fā)病年齡早，外顯率高，至60歲時外顯率達97 %，約80%的基因突變?yōu)榧?族遺傳性，20 %為新發(fā)突變。
[0004] VHL綜合征的臨床表現(xiàn)及疾病嚴重程度具有很大差異性，即使在攜帶同一突變的 患者也是如此。
[0005] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細胞瘤是VHL的典型病變，其中80 %為腦部病變，20 %為脊 髓病變，且通常伴有囊腫，患者臨床癥狀與腫瘤發(fā)生部位有關(guān)，如小腦幕下腫瘤可出現(xiàn)頭 痛、嘔吐、共濟失調(diào)等。視網(wǎng)膜血管母細胞瘤通常為VHL的首發(fā)病變，平均發(fā)現(xiàn)年齡為25歲， 患者可無癥狀或表現(xiàn)為視野缺損，或由于視網(wǎng)膜剝脫、出血而出現(xiàn)視力喪失。腎臟病變主要 包括腎囊腫和腎細胞癌（尤其是腎透明細胞癌），腎細胞癌是VHL綜合征患者死亡的主要原 因。嗜鉻細胞瘤可發(fā)生在單側(cè)或雙側(cè)腎上腺，表現(xiàn)為持續(xù)性、陣發(fā)性高血壓或完全無癥狀。 胰腺病變?yōu)閱渭冃阅夷[，很少導(dǎo)致內(nèi)分泌或外分泌不足，但發(fā)生在胰腺頭部的囊腫可能會 引起梗阻。內(nèi)淋巴囊腫瘤則可導(dǎo)致不同程度的耳聾。
[0006] 對于Von Hippel-Lindau綜合征綜合征的鑒別診斷傳統(tǒng)的方法主要依靠生化檢查 和影像學(xué)檢查。這些手段存在很大的缺點：
[0007] 1.檢查種類多；
[0008] 2.靈敏度和特異度低；
[0009] 3.易受藥物和精神狀況等因素的影響；
[0010] 4.檢測時間要求苛刻；
[0011] 對于疑似VHL、VHL相關(guān)腫瘤患者、根據(jù)嚴格臨床診斷標準無法確診的VHL癥狀者 均可通過基因檢測進行診斷，發(fā)現(xiàn)致病突變即可確診。對于存在致病突變的家族，應(yīng)進行基 因篩查以早期發(fā)現(xiàn)無癥狀攜帶者。
[0012] 另外，對于無癥狀的致病突變攜帶者，應(yīng)進行常規(guī)的隨訪以及時發(fā)現(xiàn)病變，早期進 行臨床干預(yù)，改善預(yù)后。
[0013] 基因診斷的優(yōu)勢在于： _4] 1.方便，安全，快捷：僅抽取2-4毫升血；
[0015] 2.任何時間都可以檢查；
[0016] 3.不限制飲食，服藥，任何身體狀況都可以檢測；
[0017] 4.相比反復(fù)，多項傳統(tǒng)檢查，更為經(jīng)濟；
[0018] 5.發(fā)病前，疾病極早期診斷的唯一方式；
[0019] 6.源頭確診，一次檢測，終身受益。
[0020] 這一切都揭示了基因診斷在臨床上有巨大的應(yīng)用前景。
[0021] 近年，大規(guī)模 DNA 平行測序平臺（massively parallel DNA sequencing platform)已經(jīng)發(fā)展為主流的測序技術(shù)，這項測序技術(shù)的出現(xiàn)不僅令DNA測序費用降到了 以前的百分之一，還讓基因組測序這項以前專屬于大型測序中心的"特權(quán)"能夠被眾多研究 人員分享。
[0022] 但是直接使用大規(guī)模DNA平行測序平臺檢測的成本目前仍然令個人難以承受。本 發(fā)明可以同時把多個甚至幾十病人的Von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因精確的選擇性捕 獲，然后用于大規(guī)模測序平臺，可以極大地降低基因診斷的成本，使之廣泛應(yīng)用于臨床成為 可能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 本發(fā)明的目的是，提供一種檢測Von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的目標 捕獲再測序的試劑盒。該試劑盒提高了基因捕獲的通量和基因平行測序的通量，操作簡便、 成本低。
[0024] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用捕獲目的VHL部外顯子片段以及鄰近50bp的非編 碼區(qū)的探針；用于擴增待測片段的通用引物；測序接頭序列；緩沖液；dNTP ;高保真聚合酶； 鏈霉素磁珠。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種新的目標捕獲再測序方法，包括以下步驟：
[0025] A.設(shè)計并制備用于捕獲Von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的探針。并將這 些探針結(jié)合在磁珠、薄膜或者玻片上。探針序列見序列表。
[0026] B.將待測基因 DNA樣品分別片段化至200-400bp，然后將末端補平，加入的ATP使 片段兩端引入粘性末端。
[0027] C.分別加入 Illumina 公司 Nextera? DNA Sample Prep Kit 中設(shè)計好的一端 帶有標簽序列的接頭序列片段，加入連接酶，使每個片段都與的一對接頭連接，形成新的片 段。
[0028] D.調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度激活DNA聚合酶，用一對Illumina公司Nextera? Index Kit-PCR primers通用引物，對步驟c所得不同基因組完成連接的片段序列混合后進行PCR 擴增反應(yīng)；
[0029] E.將步驟d所得全部樣品的PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物與步驟a所設(shè)計的捕獲探針雜交， 然后經(jīng)過多次洗脫純化反應(yīng)，得到待測片段。
[0030] F.將待測片段通過illumina公司Miseq測序儀的標準方案進行大規(guī)模平行測序。
[0031] G.將得到的測序結(jié)果同標準數(shù)據(jù)庫進行比較，得到診斷結(jié)果。
[0032] 為實現(xiàn)上述技術(shù)方案，步驟A所述的捕獲探針是脫氧核糖核酸（DNA)，或是核糖核 酸（RNA)組成，但不僅限于DNA和RNA。探針為120bp的與目標互補的片段組成。探針可以 是結(jié)合在磁珠上的，也可以結(jié)合在載玻片上，但不僅限于這些介質(zhì)。鏈霉素磁珠材質(zhì)是鋁鎳 鈷系永磁合金或是鋇鐵氧體、釹鐵硼永磁材料、釹鐵硼永磁材料、橡膠磁，但不僅限于這些 材質(zhì)。
[0033] 其中，步驟A所述的捕獲探針，包括覆蓋基因 VHL碼外顯子片段和兩端50bp范 圍內(nèi)的序列。這些探針以疊瓦式設(shè)計，片段長度為50bp-180bp，最優(yōu)為75bp ;片段長度為 60bp-200bp，最優(yōu)為80bp ;片段長度為65bp-220bp，最優(yōu)為85bp ;片段長度為70bp-240bp， 最優(yōu)為90bp ;探針之間重疊部分為5-20bp,最優(yōu)為8bp ;目標區(qū)堿基的探針覆蓋度為I X至 10X，最優(yōu)為3X。
[0034] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0035] 1.本發(fā)明可以在一次測序反應(yīng)中同時進行多個不同來源樣本全部Von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因的檢測；全部序列直接測出，準確率可以達到99. 99%。
[0036] 2.本發(fā)明的試劑盒可以一次完成1-48個樣品的平行捕獲，提高了捕獲效率，極大 地降低了樣品準備的成本。
[0037] 3.本發(fā)明的試劑盒可以一次完成1-1152個樣品的全部Von Hippel-Lindau綜合 征相關(guān)基因，近4000條序列的平行檢測，充分利用設(shè)備的高通量特性，極大降低了每個樣 品的測序成本。
[0038] 4.本發(fā)明的試劑盒可以一次反應(yīng)同時分辨錯義、插入和缺失突變。大大增加了臨 床檢出率和準確性。
[0039] 5.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，減少重復(fù)操作的環(huán)節(jié)，因而避免了復(fù)雜操作過程 中存在的諸多不確定引物，提高了檢測準確率和穩(wěn)定性。
[0040] 6.本發(fā)明所提供的檢測方法所需時間大大少于sanger法的測序技術(shù).
[0041] 實例：在完成同樣的檢測量（100人份的檢測量），sanger法需要2個人工同時工 作一周。我們的方法只需要一個人在一天內(nèi)完成全部的檢測量。
[0042] 7.檢測的準確度大大優(yōu)于基因芯片技術(shù)，更符合臨床檢測要求?；蛐酒荒軝z 測堿基錯義突變，而插入和缺失突變無法同時檢測。我們的方法可以同時檢測錯義、插入、 缺失和可變剪切的基因突變。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖1為目標區(qū)域序列和探針。A為腺嘌呤；T為胸腺嘧啶；C為胞嘧啶；G為鳥嘌呤
[0044] 圖2為目標區(qū)域序列。
[0045] 圖3為探針。

【具體實施方式】
[0046] 下面用實施例僅是對本發(fā)明實際應(yīng)用的舉例描述，本發(fā)明的實際應(yīng)用不僅限于以 下實施例：
[0047] 實施例一、
[0048] 一、探針設(shè)計：
[0049] 按表合成鏈霉素標記的探針。探針溶液采用agilent公司的SureSelect緩沖系 統(tǒng)體系。
[0050] 二、基因組提?。?br> [0051] 采用 Qiagen FlexiGene DNA Kit (Code No :51204)進行提取待測 96 份樣本的基 因組， 〇〇26〇/280 值達到1. 8-2. 0,各取1-3 μ g做為起始模板。
[0052] 三、測序前樣品制備
[0053] 1.目的基因片段化：
[0054] 取定量過的270份基因組DNA，稀釋至20-35ng/ μ L。取130 μ L，用超聲破碎儀分 別進行片段化。
[0055] 2. AMpure XP 片段化選擇
[0056] 1.取96孔板，加入80-100 μ L磁珠后，再加入樣品DNA，移液器反復(fù)吹打混勻；
[0057] 2.混合液 26°C 放置 5min ;
[0058] 3.將96孔板靜置在磁板上3min ;
[0059] 4.小心移取全部上清至新的孔中，小心不要碰到磁環(huán)；
[0060] 5.再在移至新孔的上清中加入100-150 μ L磁珠，移液器反復(fù)吹打，充分混勻；
[0061] 6.混合液 26°C 放置 5min ;
[0062] 7.將96孔板靜置在磁板上3min，小心移去上清；
[0063] 8.加入70%乙醇200 μ L，靜置30s，小心移去上清；
[0064] 9.重復(fù)步驟8操作一次；
[0065] 10.將96孔板從磁板上取下，敞口放置，使乙醇充分揮發(fā)；
[0066] 11.加入40 μ LlOmM pH = 8. OTris-HCl，移液器反復(fù)吹打混勻；
[0067] 12.將96孔板靜置在磁板上Imin，至溶液變清；
[0068] 13.小心移取上清至新的PCR管內(nèi)，得到純化后的基因組DNA。
[0069] 3.末端平齊和純化
[0070] 1.取96孔板，按下表所示，在冰盒上加入各種試劑，保持冰浴狀態(tài)。

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑盒，其包括：捕獲目的VHL 基因全部外顯子片段以及鄰近50bp的非編碼區(qū)的探針；用于擴增待測片段的通用引物；測 序接頭序列；緩沖液；dNTP ;高保真聚合酶；鏈霉素磁珠。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述"一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑 盒"，全部探針在3'采用生物素修飾。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述"一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑盒" 這種探針是寡聚核糖核酸（RNA)，或寡聚脫氧核糖核酸（DNA)，但是不僅限于RNA和DNA，可 以包括生物素、熒光或者同位素等修飾后的DNA或者RNA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述"一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑盒" 的探針是結(jié)合在磁珠上的，或結(jié)合在載玻片上，但不僅限于這些介質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述"一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑盒" 的探針針對目標區(qū)域以高密度疊瓦式設(shè)計，探針序列與VHL為互補序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述"一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑盒" 探針長度在50-180bp，最優(yōu)為75bp。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述"一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑盒" 探針長度在60-200bp，最優(yōu)為80bp。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述"一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑盒" 探針長度在65-2200bp，最優(yōu)為85bp。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述"一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑盒" 探針長度在70-240bp，最優(yōu)為90bp。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述"一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑 盒"探針重疊部分適宜范圍為5bp_20bp,最優(yōu)為8bp。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述"一種檢測von Hippel-Lindau綜合征相關(guān)基因突變的試劑 盒"鏈霉素磁珠材質(zhì)是鋁鎳鈷系永磁合金或是鋇鐵氧體、釹鐵硼永磁材料、釹鐵硼永磁材 料、橡膠磁，但不僅限于這些材質(zhì)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388551SQ201410613208
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】劉哲 申請人:百世諾（北京）醫(yī)療科技有限公司