一種提高豬細(xì)胞重編程能力的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高豬細(xì)胞重編程能力的方法及應(yīng)用，屬于細(xì)胞移植和胚胎發(fā)育【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明所提供的方法是在獲取并培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞和豬胎兒成纖維細(xì)胞后，進(jìn)行體細(xì)胞核移植，最后進(jìn)行iPS誘導(dǎo)并進(jìn)行堿性磷酸酶染色。方法中利用小分子藥物GSK126進(jìn)行了處理，其使用方式有以下三種：1)豬胎兒成纖維細(xì)胞在核移植前利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理；2)在豬胎兒成纖維細(xì)胞體細(xì)胞核移植后，利用小分子藥物GSK126處理融合胚胎；3)用于iPS誘導(dǎo)的豬胎兒成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng)成熟后接種前利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理。本發(fā)明所提供的方法可以顯著提高克隆胚胎的發(fā)育率和iPS誘導(dǎo)效率，提高幅度分別達(dá)到44.7％和111.3％。
【專利說明】一種提高豬細(xì)胞重編程能力的方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高豬細(xì)胞重編程能力的方法及應(yīng)用，屬于細(xì)胞移植和胚胎發(fā)育

【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 體細(xì)胞核移植技術(shù)是一種細(xì)胞重編程技術(shù)，自從克隆羊"Dolly"誕生以來，該技術(shù) 先后在多種哺乳動物上取得成功，但克隆效率普遍很低，平均在〇. 1% -2. 0%之間。為提高 核移植效率，研究人員在核移植技術(shù)程序、卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量、體外胚胎培養(yǎng)條件、供核細(xì) 胞的篩選和預(yù)處理等方面進(jìn)行了大量的研究，雖然取得了一定進(jìn)展，但克隆效率仍然有待 提高。目前認(rèn)為克隆效率低下的最主要原因是體細(xì)胞核重編程不完全。體細(xì)胞核重編程是 指供體細(xì)胞核移入卵母細(xì)胞后停止本身的基因表達(dá)程序，恢復(fù)為胚胎發(fā)育所必需的特定基 因表達(dá)程序。這個過程主要是卵母細(xì)胞對供體細(xì)胞表觀遺傳修飾進(jìn)行重新編寫，其中包括 染色體重塑、DNA甲基化重建、組蛋白修飾改變和印記基因表達(dá)調(diào)控等。如果體細(xì)胞核移植 過程中，供體細(xì)胞的組織特異的表觀遺傳修飾不能被有效地消除，將會影響胚胎的正常發(fā) 育。因此促進(jìn)體細(xì)胞核表觀遺傳重編程將有助于提高核移植效率。
[0003]目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些藥物處理供體細(xì)胞或克隆胚胎能夠在一定程度上提高克隆 效率，如甲基化或去乙?；种苿?-氮胞苷（542六-(1〇，曲古抑菌素4〇^六)）。542六-況 和TSA通過促進(jìn)甲基化和乙酰化水平的重編程來提高克隆效率。但這些藥物都沒有徹底解 決克隆效率低下的問題。
[0004] 采用甲基化或去乙?；种苿┨幚砉w細(xì)胞或克隆胚胎，通過調(diào)節(jié)甲基化和乙酰 化水平不能有效的提高克隆效率的原因是：導(dǎo)致克隆胚胎發(fā)育率低下的核移植重編程異常 是多方面的，不止包括甲基化和乙酰化水平異常，雖然甲基化或去乙?；种苿┑念A(yù)處理 能夠改善核移植重編程的某些方面，但要想讓克隆效率達(dá)到一個更高水平，人們必須從更 多角度進(jìn)行探索促進(jìn)核移植重編程的方法。
[0005]H3K27me3是一種重要的組蛋白修飾，對基因表達(dá)有抑制作用。在豬體外受精胚胎 (IVF)中，H3K27me3在Ι-cell位于雌原核中，在2-cell以后水平急劇下降，4-cell以后一 般檢測不到其存在，直到晚期囊胚才在滋養(yǎng)層細(xì)胞中又開始出現(xiàn)。人們一般認(rèn)為H3K27me3 在早期胚胎的迅速擦除有利于早期胚胎（特別是合子基因激活）時期的基因表達(dá)。但在豬 克隆胚胎中，H3K27me3的分布情況，即H3K27me3是否被有效的重編程還沒有被報道。
[0006] 誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（iPS)技術(shù)是體細(xì)胞核移植技術(shù)以外另一種細(xì)胞重編程技術(shù)。 它通過人為向細(xì)胞中導(dǎo)入幾個外源基因使細(xì)胞命運發(fā)生改變。但是目前iPS技術(shù)誘導(dǎo)效率 普遍偏低。雖然iPS技術(shù)和核移植技術(shù)的技術(shù)路徑和原理有著很大的不同，但是這兩種方 法的重編程過程卻有著很大的相似性，都需要克服源頭細(xì)胞的分化狀態(tài)的表觀修飾來達(dá)到 多能性狀態(tài)。所以提高克隆效率的方法也有可能能夠提高iPS誘導(dǎo)效率。
[0007]GSK126是一種高效和特異性的EZH2的小分子抑制劑，能夠降低H3K27me3的整體 水平，GSKl26可以作為治療EZH2突變的淋巴瘤的藥物。但是，在重編程領(lǐng)域一直沒有應(yīng)用， 目前尚未發(fā)現(xiàn)GSK126可用于提高胚胎發(fā)育或iPS誘導(dǎo)效率的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種提高豬細(xì)胞重編程能力的方法，采取的技術(shù) 方案如下：
[0009] -種提高豬細(xì)胞重編程能力的方法，是在獲取并培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞和豬胎兒成纖維 細(xì)胞后，進(jìn)行體細(xì)胞核移植，最后進(jìn)行iPS誘導(dǎo)并進(jìn)行堿性磷酸酶染色，其特征在于，以下 列任意一種方式使用小分子藥物GSK126 :
[0010]1)豬胎兒成纖維細(xì)胞在核移植前利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理；
[0011] 2)在豬胎兒成纖維細(xì)胞體細(xì)胞核移植后，利用小分子藥物GSK126處理融合胚胎；
[0012] 3)用于iPS誘導(dǎo)的豬胎兒成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng)成熟后接種前利用小分子藥物 GSK126進(jìn)行處理。
[0013] 1)中所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是利用0. 5-3. 0μM的GSK126處理 40-50h。
[0014] 優(yōu)選地，1)中所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是利用0· 5μM的GSK126處 理 48h。
[0015] 2)中所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是利用0. 05-0. 15以11的651(126處理 18-30h。
[0016] 優(yōu)選地，2)中所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是利用0· 1μM的GSK126處 理 24h。
[0017] 所述方法用于提高克隆胚胎的發(fā)育率。
[0018] 3)中所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是利用0. 5-3. 0μM的GSK126處理 40-50h。
[0019] 優(yōu)選地，3)中所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是利用0. 75yi^^GSK126& 理 48h。
[0020] 所述方法用于提高誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。
[0021] 本發(fā)明有益效果：為解決現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞核移植效率低的問題，克服現(xiàn)有技術(shù)通 過甲基轉(zhuǎn)移酶或去乙?；敢种苿┨幚眢w細(xì)胞或核移植胚胎不能全面促進(jìn)核移植重編程 的局限性，本發(fā)明通過對豬卵裂期的受精胚胎和克隆胚胎的H3K27me3的分布模式進(jìn)行比 較，發(fā)現(xiàn)豬克隆胚胎中的H3K27me3不能被正常重編程，早期克隆胚胎的H3K27me3水平高 于IVF胚胎。小分子藥物GSK126是一種高效和特異性的EZH2的小分子抑制劑，能夠降低 H3K27me3的整體水平，GSK126常作為治療EZH2突變的淋巴瘤的藥物。發(fā)明人在研究過程 中意外發(fā)現(xiàn)，小分子藥物GSK126對提高克隆胚胎的發(fā)育率和iPS的誘導(dǎo)效率具有積極作 用。據(jù)此，本發(fā)明通過用小分子藥物GSK126處理供體細(xì)胞或克隆胚胎，促進(jìn)H3K27me3的 重編程，最終使得豬克隆胚胎的發(fā)育率提高了 44.7%。本發(fā)明在誘導(dǎo)豬多能性干細(xì)胞時用 GSK126進(jìn)行處理，使得豬多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)效率，提高幅度達(dá)到111. 3%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為豬胎兒成纖維細(xì)胞（PEF)經(jīng)不同濃度GSK126處理48后細(xì)胞數(shù)及H3K27me3 水平變化；
[0023] (a，GSK126濃度對PEF細(xì)胞數(shù)的影響；b，GSK126濃度對H3K27me3水平影響）。
[0024] 圖2為經(jīng)GSK126處理的PEF核移植后l-cell、2-cell克隆胚胎的H3K27me3水平。
[0025] 圖3為克隆胚胎經(jīng)GSK126處理24h后的H3K27me3水平。
[0026] 圖4為經(jīng)GSK126處理的PEF誘導(dǎo)iPS時的堿性磷酸酶（AP)陽性克隆數(shù)。

【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0028] 以下實施例中所用試劑、材料、儀器和方法，未經(jīng)特別說明，均為本領(lǐng)域中常用的 試劑、材料、儀器和方法。
[0029] 實施例1
[0030] 1.豬卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)
[0031] 由屠宰場收集卵巢并用37°C的生理鹽水運送回實驗室，抽取3_5mm直徑的有腔卵 泡收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，實體顯微鏡下挑選具有完整的三層以上卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞 用于成熟培養(yǎng)；成熟培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為38. 5 °C，5 %二氧化碳、95 %空氣的氣體環(huán)境，飽和 濕度；成熟培養(yǎng)42小時后采用0. 5%透明質(zhì)酸酶去除卵丘細(xì)胞，獲的MII期卵母細(xì)胞，作為 核移植受體。
[0032] 2.豬胎兒成纖維細(xì)胞的獲得和培養(yǎng)
[0033] 無菌操作取35天豬胎兒組織，采用常規(guī)0. 25%胰蛋白酶（Gibco)消化法分離組織 細(xì)胞，DMEM(Gibco)添加20%胎牛血清原代培養(yǎng)，DMEM添加10%胎牛血清傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條 件為38. 5°C，5%二氧化碳、95%空氣的氣體環(huán)境，飽和適度；采用3-5代的接觸抑制的胎兒 成纖維細(xì)胞消化為單個懸浮細(xì)胞進(jìn)行核移植。
[0034] 3.體細(xì)胞核移植
[0035] 豬體細(xì)胞核移植采用融合法進(jìn)行，過程如下：盲吸法去除MII卵的紡錘體及第一 極體，體細(xì)胞注于透明帶下，并使之與卵母細(xì)胞質(zhì)膜緊密接觸，直流電擊（I. 2kv/cm、30μs、 2次脈沖）誘導(dǎo)體細(xì)胞與去核卵胞質(zhì)融合形成重構(gòu)胚并使之被激活，培養(yǎng)于ΡΖΜ-3培養(yǎng)液 中，培養(yǎng)條件為：38. 5 °C，5 %C02，飽和濕度。培養(yǎng)至48h計算卵裂率，146h計算囊胚率。5mg/ LHoechst33342對囊胚進(jìn)行染色5min，熒光鏡下觀察記囊胚細(xì)胞數(shù)；所用工具、液體、儀 器如下：固定管內(nèi)徑為30μm，注射管內(nèi)徑25μm;卵母細(xì)胞操作液為含5mg/mlBSA的改進(jìn) 型TCM199 (Gibco)，卵母細(xì)胞顯微操作液為添加7. 5μg/ml細(xì)胞松弛素B(CB)的操作液，融 合液為含I.OmM鈣離子和0.ImM鎂離子的3%甘露醇溶液；顯微操作系統(tǒng)為日本Narishige 公司NT-88NE系統(tǒng)；融合儀為美國BTX公司BTX2001型電細(xì)胞融合儀。
[0036] 4.iPS誘導(dǎo)及堿性磷酸酶染色
[0037] 采用鼠源6因子方法誘導(dǎo)1卩5(聽1叩，了.，611，〇.，他〇，丄，了1&，￥.，父脫，8.，"11，!1· ,Ma, J. , Wei, R. , Hai, T. , Kong, Q. , Bou, G. , Xia, P. , Zhou, Q. , Wang, L. , and Liu, Z. (2013). Tbx3and Nr5alpha2play important roles in pig pluripotent stem cells. Stem Cell Rev.9,700 - 708.)。按照之前方法制備逆轉(zhuǎn)錄病毒和飼養(yǎng)層細(xì)胞。P3或P4代的PEF用于 誘導(dǎo)iPSCs。Day-I :接種I X IO5PEF到每個6孔板的孔中；DayO :按MOI為5的病毒量把6 個因子的病毒同時加到事先接種好的PEF里，同時加8ug/mL polybrene ;Dayl :換液，從今 天開始可以加青霉素鏈霉素的培養(yǎng)液；Day3:換液，觀察細(xì)胞，并準(zhǔn)備飼養(yǎng)層；Day4:感染細(xì) 胞長至90%以上的匯合度時，將PEF傳到飼養(yǎng)層上，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；Day5: 棄去10 %FBS的DMEM培養(yǎng)液，用X培養(yǎng)液培養(yǎng)，以后每天換液；X培養(yǎng)液配方為（50mL): 19mLK0-DMEM、12.25mLDMEM/F12、12.25mLNeurabasal、5mLK0SR、250uLB27、125uLN2、 250uL谷氨酰胺（2mM)、25uLβ-巰基乙醇、500uL雙抗、250uL非必需氨基酸、4uLbFGF、5uL hLif、31.25uL2%BSA。Day9:做堿性磷酸酶染色。先用PBS洗三遍，再用4%多聚甲醛室 溫固定90s，PBS洗三次，每次5分鐘（或放置室溫15分鐘），用lOOmmol/LTris-HCl(pH 9. 5)，lOOmmol/LNaCl，50mmol/LMgC12混合緩沖液洗5分鐘，在ImlPBS中加入四氮唑藍(lán) (NBT) 4. 5μ1和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽（BCIP) 3. 5μ1，避光顯色20分鐘?1小時，隨 時觀察染色情況。用PBS洗滌3遍，直接在倒置顯微鏡下即可觀察，照相。
[0038] 實施例2
[0039] 1.豬卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)（同實施例1)
[0040] 2.豬胎兒成纖維細(xì)胞的獲得和培養(yǎng)
[0041]PEF在核移植前分別用0. 5μΜ、0. 75μM和3μMGSK126處理48h。其余同實施例 1〇
[0042] 3.體細(xì)胞核移植（同實施例1)
[0043] 實施例3
[0044] 1.豬卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)（同實施例1)
[0045] 2.豬胎兒成纖維細(xì)胞的獲得和培養(yǎng)（同實施例1)
[0046] 3.體細(xì)胞核移植
[0047] 融合后的胚胎用0. 05μM、0. 1μM和0. 15μMGSK126處理24h。之后將胚胎置于 正常PZM-3中繼續(xù)培養(yǎng)。其余同實施例1。
[0048] 實施例4
[0049] 1.豬胎兒成纖維細(xì)胞的獲得和培養(yǎng)（同實施例1)
[0050] 2.iPS誘導(dǎo)及堿性磷酸酶染色
[0051] 用于iPS誘導(dǎo)的PEF在往6孔板接種前用0. 5μM、0. 75μM和3μMGSK126處理 48h。其余同實施例1。
[0052] 實施例5
[0053] 1.不同濃度GSK126對細(xì)胞數(shù)和H3K27me3水平變化的影響
[0054] 為了降低供體細(xì)胞的H3K27me3水平，我們用不同濃度的GSK126處理PEF48h。圖 1為PEF經(jīng)不同濃度GSK126處理48后細(xì)胞數(shù)（A)及H3K27me3水平⑶變化。從圖1中可 以發(fā)現(xiàn)0-3μM時各組的細(xì)胞狀態(tài)良好，并且各組的細(xì)胞數(shù)也沒有差異（A)。對各組細(xì)胞的 H3K27me3水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)GSK126能夠降低PEF的H3K27me3水平，特別是濃度XX5μM 時效果較為顯著（Ρ〈〇. 05) (B)。
[0055] 2. GSK126處理PEF對克隆胚胎發(fā)育的影響
[0056] 表1經(jīng)GSK126處理的PEF的克隆胚胎發(fā)育率
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種提高豬細(xì)胞重編程能力的方法，是在獲取并培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞和豬胎兒成纖維細(xì) 胞后，進(jìn)行體細(xì)胞核移植，最后進(jìn)行iPS誘導(dǎo)并進(jìn)行堿性磷酸酶染色，其特征在于，以下列 任意一種方式使用小分子藥物GSK126 : 1) 豬胎兒成纖維細(xì)胞在核移植前利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理； 2) 在豬胎兒成纖維細(xì)胞體細(xì)胞核移植后，利用小分子藥物GSK126處理融合胚胎； 3) 用于iPS誘導(dǎo)的豬胎兒成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng)成熟后接種前利用小分子藥物GSK126進(jìn) 行處理。
2. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，1)中所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是 利用 0? 5-3. 0 ii M 的 GSK126 處理 40-50h。
3. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是利用 0? 5iiM 的 GSK126 處理 48h。
4. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，2)中所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是 利用 〇? 05-0. 15 ii M 的 GSK126 處理 18-30h。
5. 權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是利用 0. liiM 的 GSK126 處理 24h。
6. 權(quán)利要求1-5所述方法，其特征在于，用于提高克隆胚胎的發(fā)育率。
7. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，3)中所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是 利用 0? 5-3. 0 ii M 的 GSK126 處理 40-50h。
8. 權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述利用小分子藥物GSK126進(jìn)行處理，是利用 0. 75 ii M 的 GSK126 處理 48h。
9. 權(quán)利要求1，7和8所述方法，其特征在于，用于提高誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。
【文檔編號】C12N15/877GK104357483SQ201410613163
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】孔慶然, 解炳騰, 劉忠華 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)