腫瘤循環(huán)dna kras突變檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤循環(huán)DNA KRAS突變檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 基于外周血循環(huán)DNA的高通量測(cè)序的突變檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高。通過(guò)外周血 循環(huán)DNA KRAS的突變檢測(cè)，可以避免過(guò)度治療及其帶來(lái)的潛在副作用的影響，而其他患者 可進(jìn)行更為積極的治療。進(jìn)一步可以構(gòu)建動(dòng)力進(jìn)化數(shù)學(xué)模型來(lái)確定個(gè)人化的癌癥最佳治療 方案。
[0003] K-ras是一種原癌基因，長(zhǎng)約35kb，位于12號(hào)染色體，是RAS基因家族成員之 一，編碼K-ras蛋白，與腫瘤的生成、增殖、迀移、擴(kuò)散以及血管生成均有關(guān)系。K-ras基因 (K-ras，p21)家族與人類腫瘤相關(guān)的基因有三種--H_ras、K_ras和N_ras，分別定位在 11、12和1號(hào)染色體上。K-ras基因因編碼21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因 中，KRAS對(duì)人類癌癥影響最大，它好像分子開關(guān)：當(dāng)正常時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的路徑；發(fā) 生異常時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，并阻止細(xì)胞自我毀滅。它參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，當(dāng)KRAS 基因突變時(shí)，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的ras蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增 殖失控而癌變。研宄表明約30%的人類惡性腫瘤與RAS基因突變有關(guān)，ras突變后的產(chǎn)物 可以一直處于活化狀態(tài)。在白血病、肺癌、直腸癌和胰腺癌中，KRAS突變均很常見，其中直 腸癌中30% -35%患者有突變。其與腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、迀移、擴(kuò)散和血管生成均有關(guān) 系。KRAS基因分為突變型和野生型，常見突變位點(diǎn)為KRAS基因2號(hào)外顯子的12號(hào)密碼子 和 13 號(hào)密碼子上，其中有 7 個(gè)突變熱點(diǎn)：G12C(GGT>TGT)、G12R(GGT>AGT)、G12S(GGT>CGT)、 G12V(GGT>GTT)、G12D(GGT>GAT)、G12A(GGT>GCT)、G13D(GGC>GAC)。這 7 種突變占到了 90% 以上。
[0004] 檢測(cè)KRAS基因突變是深入了解癌基因的情況、了解各種癌癥的發(fā)展預(yù)后、放化療 療效的重要指標(biāo)。2009年7月20日，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA)公布了對(duì)表皮生長(zhǎng) 因子受體（EGFR)靶向藥物使用說(shuō)明書的修改版本，其中明確闡述了用于相關(guān)癌癥治療的 EGFR受體抑制劑藥效與KRAS基因密切相關(guān)性，并要求使用該類藥物前進(jìn)行KRAS基因突變 檢測(cè)以幫助醫(yī)生判斷適用人群。FDA此次更新了 Amgen公司生產(chǎn)的維克替比（Vectibix，帕 尼單抗Panitumumab)和ImClone公司生產(chǎn)的愛必妥（Erbitux，西妥昔單抗Cetuximab)藥 品說(shuō)明書中"使用指南"和"臨床研宄"部分。注明如果患者腫瘤細(xì)胞中KRAS基因的12或 13密碼子發(fā)生突變，那么該患者就不會(huì)從EGFR抑制劑類藥物的治療中獲益，所以不推薦發(fā) 生KRAS基因突變的患者使用此類藥物。同時(shí)，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部于2010年10月14日 發(fā)表了《結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版）》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)（2010) 165號(hào)）。規(guī)范指出，在人群中 進(jìn)行早期疾病用藥基因篩查診療對(duì)于預(yù)防結(jié)直腸癌發(fā)生、防止向晚期發(fā)展、治療以及降低 結(jié)直腸癌死亡率有重要作用。該規(guī)范明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受愛 必妥、帕尼單抗時(shí)，必須檢測(cè)腫瘤組織的K-ras基因狀態(tài)?，F(xiàn)在在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，K-RAS 基因檢測(cè)已經(jīng)成為大腸癌患者治療前必做的常規(guī)檢查，是目前醫(yī)生了解大腸癌患者癌基因 狀況最直接、最有效的方法，并且成為能否報(bào)銷相關(guān)抗EGFR治療費(fèi)用的依據(jù)。
[0005] 針對(duì)患者組織標(biāo)本進(jìn)行一代測(cè)序，基于該結(jié)果進(jìn)行用藥指導(dǎo)是目前通用方案。但 是在實(shí)際臨床治療過(guò)程中，觀察到對(duì)KRAS基因野生型的患者采用西妥昔單抗治療一段時(shí) 間后出現(xiàn)耐藥性。這種耐藥性是如何產(chǎn)生的呢？現(xiàn)有研宄表明癌癥可能源于體細(xì)胞突變， 癌癥基因在突變體細(xì)胞內(nèi)不斷累積，后者也逐漸完成了自身的進(jìn)化。有研宄者認(rèn)為單一細(xì) 胞的基因組學(xué)研宄是癌癥進(jìn)化研宄的重點(diǎn)，其可以破解癌癥突變的順序及時(shí)間，為人們理 解癌癥突變、耐藥的機(jī)制提供很好的思路。但我們認(rèn)為單細(xì)胞測(cè)序不能幫助我們了解和解 析個(gè)體患者的獨(dú)特特征所構(gòu)成的復(fù)雜體系。常規(guī)測(cè)序分型的鑒定方式無(wú)法達(dá)到高靈敏度檢 測(cè)到混雜樣品中突變位點(diǎn)發(fā)生的低比例突變，更加無(wú)法達(dá)到精確定量，而在放化療的"自然 壓力"下，這種"適應(yīng)性情況"中，某些極低突變隨著腫瘤進(jìn)展而暫時(shí)增加，而正是這種"趨 同進(jìn)化"導(dǎo)致了耐藥性的產(chǎn)生。有研宄者認(rèn)為應(yīng)該通過(guò)動(dòng)力進(jìn)化數(shù)學(xué)模型來(lái)確定個(gè)人化的 癌癥最佳治療方案。醫(yī)生不可能針對(duì)同一患者多次取得組織樣本，因此通過(guò)外周血進(jìn)行無(wú) 創(chuàng)或微創(chuàng)成為必然的選擇。而本發(fā)明將為此提供有效指導(dǎo)方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明公開了一種通過(guò)針對(duì)腫瘤循環(huán)DNA的二代高通量測(cè)序檢測(cè)KRAS第二外顯 子基因突變的檢測(cè)方法，以克服傳統(tǒng)測(cè)序方法靈敏度不足的缺點(diǎn)。
[0007] 具體而言，本發(fā)明使用SEQIDNO:3和/或4所示的引物實(shí)施所述檢測(cè)方法。
[0008] 因此，本發(fā)明提供SEQ ID NO:3和4所示的引物序列。
[0009] 本發(fā)明還提供一種序列組合，該組合包括SEQ ID NO:3和4。
[0010] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)外周血循環(huán)DNA中KRAS基因突變的方法，該方法包括使用 SEQ ID NO: 3和/或4進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，從而檢測(cè)該KRAS基因的12和/ 或13密碼子是否存在突變。
[0011] 本發(fā)明還提供一種判斷腫瘤患者，尤其是大腸癌（例如結(jié)直腸癌）患者能否從 EGFR抑制劑類藥物的治療中獲益的方法，該方法包括使用SEQ ID NO: 3和/或4擴(kuò)增患者 外周血循環(huán)DNA中的KRAS基因，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，從而檢測(cè)該KRAS基因的12和/ 或13密碼子是否存在突變；其中，如果患者腫瘤細(xì)胞中KRAS基因的12和/或13密碼子存 在突變，那么該患者不會(huì)從EGFR抑制劑類藥物的治療中獲益。
[0012] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述突變選自：
[0013] (1)G12C(GGT>TGT)；
[0014] (2)G12R(GGT>AGT)；
[0015] (3)G12S(GGT>CGT)；
[0016] (4)G12V(GGT>GTT)；
[0017] (5)G12D(GGT>GAT)；
[0018] (6)G12A(GGT>GCT);和
[0019] (7)G13D(GGC>GAC) 〇
[0020] 本發(fā)明還提供一種試劑盒，該試劑盒含有SEQ ID N0:3和/或4所示的引物序列。
[0021] 本發(fā)明的試劑盒可用于實(shí)施上述方法。
[0022] 試劑盒中還可含有適合進(jìn)行PCR的試劑，以及指導(dǎo)技術(shù)人員使用所述引物實(shí)施上 述方法的說(shuō)明書。
[0023] 本發(fā)明還提供SEQ ID NO:3和/或4在制備試劑盒中的用途。所述試劑盒可用 于：
[0024] (1)檢測(cè)外周血循環(huán)DNA中KRAS基因的12和/或13密碼子是否存在突變；
[0025] (2)判斷腫瘤患者，尤其是直腸癌患者能否從EGFR抑制劑類藥物的治療中獲益；
[0026] (3)避免對(duì)腫瘤患者的過(guò)度治療及其帶來(lái)的潛在副作用的影響；
[0027] (4)用于輔助診斷白血病、肺癌、大腸癌（例如結(jié)直腸癌）和胰腺癌；和
[0028] (5)用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、迀移、擴(kuò)散和血管生成。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明基于外周血循環(huán)DNA中KRAS基因突變的檢測(cè)，可判斷腫瘤患者，尤其是大 腸癌患者（如結(jié)直腸癌患者）能否從EGFR抑制劑類藥物的治療中獲益。
[0030] 本發(fā)明使用SEQ ID NO:3和/或4所示的引物進(jìn)行所述外周血循環(huán)DNA中KRAS 基因突變的檢測(cè)。優(yōu)選的，本發(fā)明使用SEQ ID NO:3和4所示的引物進(jìn)行所述檢測(cè)。
[0031] 檢測(cè)通常包括使用SEQ ID NO:3和/或4進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，從而 檢測(cè)該KRAS基因的12和/或13密碼子是否存在突變。
[0032] 檢測(cè)結(jié)