一種基于環(huán)介導等溫擴增技術原理的組織胞漿菌感染分子診斷試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子檢測技術領域，具體地說，是一種基于環(huán)介導等溫擴增技術原理 的組織胞漿菌感染分子診斷試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 組織胞漿菌屬是一個常見于鳥類和蝙蝠糞便的雙相型真菌屬，其在自然狀態(tài)下為 菌絲相，而在動物或人體內轉化為酵母相。組織胞漿菌屬包含三個物種，包括莢膜組織胞 楽菌（Histoplasma capsulatum)、組織胞衆(zhòng)菌杜氏變種（Histoplasma capsulatum var. duboisii)、馬皮疽莢膜組織胞衆(zhòng)菌（Histoplasma capsulatum var.farciminosum)，其中 馬皮疽莢膜組織胞漿菌在馬中造成淋巴管炎家畜流行病。組織胞漿菌?。℉istoplasmosis， HP)是由雙相型組織胞漿菌所引起的廣泛分布于全球的真菌病，組織胞漿菌病分由莢膜組 織胞漿菌所引起的美洲型HP、由組織胞漿菌杜氏變種和馬皮疽莢膜組織胞漿菌引起的非洲 型組織胞漿菌病。
[0003] 人類常因吸入被鳥類或蝙蝠糞便污染的泥土或塵埃中的真菌孢子而感染，臨床誤 診率、死亡率高達80%。1906年美國軍事病理學家塞繆爾?泰勒?達林報道了首例，當時 研宄表明最普遍的是俄亥俄州和密西西比河谷。近百年來的研宄大多認為該病是一種地方 性流行病，臨床表現多樣，總體分為無癥狀型、急性肺型、播散型以及慢性肺型，主要流行于 美洲、非洲、亞洲等地區(qū)，歐洲相對少見，故既往該病在我國未引起足夠重視，然而近20年 來相關報道近期呈上升趨勢，例如桂希恩等流行病學調查顯示我國存在組織胞漿菌感染的 人群，并且有地域差異，東南部地區(qū)感染率高于西北部；肺部疾病患者感染率高于正常人， 尤以肺結核患者為尚。
[0004] HP感染的預后與能否早期明確診斷密切相關，如何推動HP診斷的研宄，盡早開發(fā) 出快速、特異且易于操作的診斷技術方法，是目前臨床HP感染早期檢測技術研宄迫切需要 解決的問題。
[0005] 目前，國內外臨床真菌實驗室血清學試驗曾使用乳膠凝集、免疫擴散、補體結合、 免疫螢光及放射免疫檢驗抗體，但發(fā)病的早期診斷率低。組織胞漿菌素皮試可能有助于慢 性患者的診斷，但免疫缺陷者常不出現反應，因此皮膚試驗僅主要用于流行病調查。近來國 外亦常檢測患者尿液、血清、胸水或腦脊液的組織胞漿菌多糖抗原，其中尿液陽性率最高， 并提示活動性感染，可作為早期的診斷依據。以培養(yǎng)、病理檢查為代表的病原真菌形態(tài)學診 斷方法雖有耗時長等局限，但仍是臨床上侵襲性真菌病診斷的金標準，組織胞漿菌病亦不 例外，但由于其菌體大小及形態(tài)與利什曼原蟲無鞭毛體相似，二者常被混淆，后者存在細小 桿狀著色深的動基體，而前者無動基體，這是形態(tài)上區(qū)別兩種病原體的關鍵，但是卻對病理 鏡檢人員要求頗高。最可靠的病原診斷是真菌培養(yǎng)或動物接種，骨髓、病變組織穿刺物、血、 痰均可作培養(yǎng)，但存在假陰性率較高、耗時長（培養(yǎng)時間至少2周）等缺陷。
[0006] 近年來，非培養(yǎng)診斷技術逐漸成為國內外侵襲性真菌病早期診斷技術研宄的熱 點，其技術路線主要是基于免疫學原理的血清學方法和以核酸檢測技術為代表的分子生物 學方法。總體而言，這兩大類技術方法各有優(yōu)勢，雖然部分血清學技術方法經過改進相對成 熟，敏感性及特異性尚可，但基于免疫學原理的固有屬性也導致無法規(guī)避假陽性、假陰性等 問題；而以核酸檢測技術為代表的分子生物學技術方法雖尚未完全成熟，但具有很好地彌 補目前血清學方法的弊端的技術優(yōu)勢，具有較高的發(fā)展?jié)摿εc臨床應用價值。
[0007] 基于核酸檢測原理的HP早期診斷技術主要包括DNA條形碼圖譜技術和DNA序列 分析等。理論上講，DNA序列分析是鑒定組織胞漿菌的金標準。但PCR技術需要PCR儀器， 對基礎設施和人員要求較高，常因國內實驗室不能嚴格分區(qū)、實驗人員經驗不足加上高靈 敏度易污染使結果呈現陰性、假陽性等。LMAP技術是2000年由日本學者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開了一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術，短短幾年，該技術 已成功地應用于SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測中，在2009年甲型H1N1流感事件中，日本 榮研化學株式會社（以下簡稱"榮研公司"）接受WHO的邀請完成了 H1N1環(huán)介導等溫擴增 法檢測試劑盒的研制，通過早期快速診斷對防止該病癥的快速蔓延發(fā)揮了積極作用。LMAP 技術的優(yōu)點為：靈敏度高（比傳統的PCR方法高2~5個數量級）；反應時間短（30~60分 鐘就能完成反應）；臨床使用對樣本純度要求低（能直接擴增從臨床標本中提取的DNA樣 本）；不需要特殊的儀器（推薦用實時濁度儀，不需要將反應后的反應管打開，避免污染）； 操作簡單（不論是DNA還是RNA，檢測步驟都是需將反應液、酶和模板混合于反應管中，置于 水浴鍋或恒溫箱中63°C左右保溫30~60分鐘，肉眼觀察結果）。其存在的缺點是引物設 計要求比較高，這正是研宄突破的重點。
[0008] 綜上所述，基于針對HP菌株基因組各DNA片段的序列分析，篩選出適當的靶基因， 研發(fā)一種基于LAMP技術原理的組織胞漿菌感染早期快速診斷的技術方法，對于解決臨床 上組織胞漿菌感染確診時間周期長、對檢測人員技術和實驗室平臺條件要求高等問題具有 十分重要的意義，將為臨床上早期診斷和及時治療提供便利。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種可早期診斷組織胞漿菌感染的 引物組。
[0010] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的引物組的用途。
[0011] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種可早期診斷組織胞漿菌感染的試劑盒。
[0012] 為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0013]一種可早期診斷組織胞漿菌感染的引物組，所述的引物組由核苷酸序列分別為 SEQ NO. 28、SEQ NO. 29、SEQ NO. 30、SEQ NO. 31、SEQ NO. 32 和 SEQ NO. 33 的六條核苷酸序列 組成。
[0014] 為實現上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0015] 如上所述的引物組在制備早期診斷組織胞漿菌感染的試劑中的用途。
[0016] 如上所述的引物組在制備檢測樣品中組織胞漿菌存在的試劑中的用途。
[0017] 如上所述的引物組在制備試劑中的用途，所述的試劑用于從粗球孢子菌、申克孢 子絲菌、馬爾尼菲青霉菌、莢膜青霉菌、曲霉菌屬、鱗質霉屬、孢子菌屬、金孢子菌屬、尖孢鐮 刀菌、前病鐮刀菌、裸子囊菌屬、犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌、毛霉菌屬、嗜熱 毀絲霉屬、毛孢子菌屬、念珠菌屬、新型隱球菌、格特隱球菌以及組織胞漿菌中鑒別出組織 胞漿菌。
[0018] 為實現上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0019] -種可早期診斷組織胞漿菌感染的試劑盒，所述的試劑盒包含由核苷酸序列分別 為 SEQ NO. 28、SEQ NO. 29、SEQ NO. 30、SEQ NO. 31、SEQ NO. 32 和 SEQ NO. 33 的六條核苷酸 序列組成的引物組。
[0020] 優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括dNTPs、鏈置換DNA聚合酶和PCR反應液。
[0021] 本發(fā)明優(yōu)點在于：本發(fā)明選擇了合適的靶序列，針對ITS片段及M抗原基因設計得 到合適的LAMP引物組，該引物組特異性十分優(yōu)異，且靈敏度高，顯著優(yōu)于其他引物，因此適 用于組織胞漿菌的早期感染診斷，以及樣品中組織胞漿菌的檢測和鑒定。使用該引物組診 斷組織胞漿菌，具有快速、簡便、操作性強、結果判讀方便的優(yōu)勢，解決了臨床上組織胞漿菌 感染確診時間周期長、對檢測人員技術和實驗室平臺條件要求高等問題。
【附圖說明】
[0022] 圖1.第六套引物與靶序列結合并成環(huán)的結構位點圖。
[0023] 圖2.六套引物和陽性對照、陰性對照樣本擴增曲線。
[0024] 圖3.第六套引物的菌株凝膠電泳結果。從左至右1~7為組織胞漿菌屬： CBS114. 388、CBS215. 53、CBS136. 72、CBS633. 91、CBS205. 35、CBS537. 84 ;7 ~26 為相近屬 種：CBS144. 34、ATCC10268、ATCC201013、CBS134186、CBS113. 61、ATCC64704、CBS113838、 CBS130793、CBS221. 64、CBS204. 48、ATCC38033、ATCC36031、ATCC10215、ATCC200787、 CBS117. 65、ATCC20735、CBS1878、CBS1920、B3501、WM178。
[0025] 圖4.針對第六套引物，LAMP反應后各管濁度表現結果。從左至右1~7為組織 胞漿菌屬：CBS114. 388、CBS215. 53、CBS136. 72、CBS633. 91、CBS205. 35、CBS537. 84 ;7 ~ 16 為相近屬種：CBS144. 34、ATCC10268、ATCC201013、CBS134186、CBS113. 61、ATCC64704、 CBS113838、CBS130793、CBS221. 64、CBS204. 48, LAMP 反應體系下，65°C，90min 后，表現為陽 性樣本顯示熒光綠。
[0026] 圖5.針對第六套引物，不同濃度梯度的DNA與引物反應后的擴增曲線。對應數值 為：53ng :1860,0. 187 ;5.3ng :2160,0. 171 ;530pg :2460,0. 148 ;53pg :2600,0. 14 ;5.3pg : 2700,0. 13〇
[0027] 圖6.針對第六套引物，不同濃度梯度的組織胞漿菌DNA可見性實驗反應結果。從 左至右 1 ~7 樣本里 DNA 含量依次為 53ng、5. 3ng、530pg、53pg、5. 3pg、530fg、53fg，第 8 個 樣本為ddH20, LAMP反應體系下，65°C，90min后，表現為陽性樣本顯不焚光綠，從左至右1~ 5樣本均顯示熒光綠。
[0028] 圖7.針對第三套引物，不同濃度DNA LAMP擴增