一種檢測癌癥相關(guān)dna甲基化的試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種檢測癌癥相關(guān)DNA甲基化的試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA甲基化是一項重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，在人類癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的 作用。特定基因的啟動子區(qū)甲基化異常引起了人們的廣泛關(guān)注，被認(rèn)為是癌癥診斷的潛在 標(biāo)志物。在癌癥中只有極少數(shù)的單獨基因被證明是甲基化比例很高的。因此，檢測一組基 因的甲基化狀態(tài)，與檢測單獨基因的甲基化狀態(tài)相比，診斷靈敏度更高、特異性更好。至今 人們已研宄了多種癌癥的甲基化譜。對于一個理想的甲基化譜而言，準(zhǔn)確的檢測方法和邏 輯的數(shù)據(jù)分析都是必不可少的。2012年，已經(jīng)建立了一種統(tǒng)計多個基因的甲基化水平的方 法，根據(jù)候選基因的甲基化水平進(jìn)行癌癥樣本和正常樣本的逐步累積分析。與以前的統(tǒng)計 方法相比，這個方法充分考慮了不同基因的甲基化程度和影響，然而，這個方法需要對大量 樣本進(jìn)行統(tǒng)計分析，因此很難應(yīng)用于即時單個樣本或少量樣本的診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的一個目的是提供檢測待測樣本基因組中RASSF1A基因、OPCML基因和 HOXA9基因這三種基因的各自啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平SUM值的物質(zhì)的用途。
[0004] 本發(fā)明提供了檢測待測樣本基因組中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因這 三種基因的各自啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平SUM值的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定待測 樣本是否為卵巢癌樣本產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的是提供檢測待測樣本基因組中RASSF1A基因、OPCML基因和 H0XA9基因這三種基因的各自啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平SUM值的物質(zhì)的用途。
[0006] 本發(fā)明提供了檢測待測樣本基因組中RASSF1A基因、OPCML基因和H0XA9基因這 三種基因的各自啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平SUM值的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定待測 患者是否為卵巢癌患者產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0007] 上述應(yīng)用中，所述待測樣本基因組中RASSF1A基因、OPCML基因和H0XA9基因這三 種基因的各自啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平SUM值為所述待測樣本基因組中RASSF1A基 因、OPCML基因和H0XA9基因這三種基因的各自啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平值賦值之和。
[0008] 所述賦值標(biāo)準(zhǔn)如下：若RASSF1A基因、OPCML基因或H0XA9基因啟動子區(qū)CCGG位點 甲基化水平值小于0. 3,則對應(yīng)基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平值賦值為1 ;若RASSF1A 基因、OPCML基因或H0XA9基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平值大于等于0. 3且小于等于 0. 7，則對應(yīng)基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平值賦值為2 ;若RASSF1A基因、OPCML基因或 H0XA9基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平值大于0. 7，則對應(yīng)基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基 化水平值賦值為3。
[0009] 本發(fā)明第三個目的是提供檢測待測樣本基因組中RASSF1A基因啟動子區(qū)CCGG位 點甲基化水平、OPCML基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平和H0XA9基因的啟動子區(qū)CCGG位 點甲基化水平的物質(zhì)的用途。
[0010] 本發(fā)明提供了檢測待測樣本基因組中RASSF1A基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水 平、OPCML基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平和HOXA9基因的啟動子區(qū)CCGG位點甲基化 水平的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定待測樣本是否為卵巢癌樣本產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明第四個目的是提供檢測待測患者基因組中RASSF1A基因、OPCML基因和 HOXA9基因的啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平的物質(zhì)的用途。
[0012] 本發(fā)明提供了檢測待測患者基因組中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因的 啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定待測患者是否為卵巢癌患者 產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述待測樣本為單個樣本。
[0014] 上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為試劑盒。
[0015] 本發(fā)明的第五個目的是提供上述物質(zhì)。
[0016] 本發(fā)明提供的上述物質(zhì)，為如下1)或2):
[0017] 1)鑒定或輔助鑒定待測樣本是否為卵巢癌樣本的產(chǎn)品；
[0018] 2)鑒定或輔助鑒定待測患者是否為卵巢癌患者產(chǎn)品。
[0019] 上述物質(zhì)包括擴(kuò)增RASSF1A基因啟動子區(qū)CCGG位點的引物對、擴(kuò)增OPCML基因啟 動子區(qū)CCGG位點的引物對和擴(kuò)增H0XA9基因啟動子區(qū)CCGG位點的引物對。
[0020] 上述物質(zhì)中，所述擴(kuò)增RASSF1A基因啟動子區(qū)CCGG位點的引物對由序列表中序列 1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成；
[0021] 所述用于擴(kuò)增OPCML基因啟動子區(qū)CCGG位點的引物對由序列表中序列3所示的 單鏈DNA分子和序列表中序列4所不的單鏈DNA分子組成；
[0022] 所述用于擴(kuò)增H0XA9基因啟動子區(qū)CCGG位點的引物對由序列表中序列5所示的 單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的單鏈DNA分子組成。
[0023] 所述物質(zhì)還包括記載在可讀載體上的賦值標(biāo)準(zhǔn)和判斷標(biāo)準(zhǔn)：
[0024] 所述賦值標(biāo)準(zhǔn)如下：若RASSF1A基因、OPCML基因或H0XA9基因啟動子區(qū)CCGG位點 甲基化水平值小于0. 3,則對應(yīng)基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平值賦值為1;若RASSF1A 基因、OPCML基因或H0XA9基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平值大于等于0. 3且小于等于 0. 7，則對應(yīng)基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平值賦值為2 ;若RASSF1A基因、OPCML基因或 H0XA9基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基化水平值大于0. 7，則對應(yīng)基因啟動子區(qū)CCGG位點甲基 化水平值賦值為3。
[0025] 所述判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0026] (1)若SUM大于4,則待測樣本為或候選為卵巢癌樣本；待測患者為或候選為卵巢 癌患者；
[0027] (2)若SUM小于等于4,則待測樣本為或候選為非卵巢癌樣本；待測患者為或候選 為非卵巢癌患者。
[0028] Hpall酶是一種甲基化敏感限制性內(nèi)切酶，能特異性地切斷非甲基化的 -CCGG-3'序列，而不影響甲基化的5' -CCGG-3'序列。提取的基因組DNA被分為兩 部分：A部分進(jìn)行Hpall處理，非甲基化的DNA被切斷，只保留甲基化的DNA ;B部分不進(jìn)行 Hpall處理，甲基化和非甲基化的DNA都保持完整。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，A部分只有甲基化 的DNA被擴(kuò)增，B部分非甲基化和甲基化的DNA都被擴(kuò)增。
[0029] 所用的引物的設(shè)計原則為：設(shè)計的擴(kuò)增區(qū)域應(yīng)含有2或3個5' -CCGG-3'位點， 而且不能占據(jù)引物位置。PCR引物用DNAMAN軟件設(shè)計，通過調(diào)整引物長度，使溶解溫度Tm 值接近或高于60°C。
[0030] 熒光標(biāo)記采用PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增中的dNTP為熒光素標(biāo)記的dATP或dGTP或dCTP或 dUTP。
[0031] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明的方法及引物對可以鑒定待測樣本是否為癌癥樣本或 鑒定待測患者是否為癌癥患者，通過甲基化水平的聯(lián)合分析，設(shè)定了癌癥診斷的閾值，待測 樣本的SUM值超過閾值即為癌癥樣本，這一診斷結(jié)論是確定的。本發(fā)明可及時準(zhǔn)確鑒定單 個樣本，與檢測單獨基因的甲基化狀態(tài)相比，診斷靈敏度更高、特異性更好。而且用閾值代 替統(tǒng)計和累積分析，更有可能用于癌癥的即時診斷。
[0032] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
【附圖說明】
[0033] 圖1為低甲基化水平樣品的熒光光譜。
[0034] 圖2為中甲基化水平樣品的熒光光譜。
[0035] 圖3為高甲基化水平樣品的熒光光譜。
[0036] 圖4為35個癌癥樣本和11個正常樣本的RASSF1A基因的甲基化水平分布。
[0037] 圖5為35個癌癥樣本和11個正常樣本的OPCML基因的甲基化水平分布。
[0038] 圖6為35個癌癥樣本和11個正常樣本的HOXA9基因的甲基化水平分布。
【具體實施方式】
[0039] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。