用于檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度的核苷酸序列及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的DNA序列，及其利用該序列鑒定津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種 子純度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 種子純度鑒定是保證種子質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著育種進(jìn)程的加快，黃瓜新品種 數(shù)量不斷增加，需要進(jìn)行品種純度鑒定的材料量將會(huì)越來(lái)越大。以往常規(guī)的純度鑒定都是 在田間進(jìn)行，結(jié)瓜期由專(zhuān)家到田間觀察品種的特征特性及一致性，存在周期長(zhǎng)、工作量大、 易受環(huán)境因素的影響、表型特征會(huì)有一定程度偏差等問(wèn)題，可能影響品種純度鑒定的準(zhǔn)確 性，并直接影響到到良種的推廣；此外由于鑒定周期長(zhǎng)，當(dāng)年生產(chǎn)的種子往往要到次年才能 銷(xiāo)售，造成商機(jī)喪失。
[0003] 津優(yōu)401黃瓜雜交種子是由父本和母本經(jīng)過(guò)授粉獲得的雜交一代種子，具有雜交 品種高產(chǎn)，性狀優(yōu)良的特點(diǎn)，但同時(shí)存在母本自交獲得的自交種子摻雜在其中的風(fēng)險(xiǎn)，以往 進(jìn)行品種純度鑒定往往需要進(jìn)行田間栽培的方式，觀察植株以及商品瓜來(lái)確定是否為雜交 一代品種，主要缺點(diǎn)有二：第一是周期長(zhǎng)，一般收貨籽種的時(shí)間是每年7-10月，津優(yōu)401為 露地品種需要春季或夏初播種鑒定，因此往往需要等到來(lái)年才能進(jìn)行栽培鑒定，并且每次 從栽培到商品瓜出現(xiàn)需要至少50天，導(dǎo)致新采收的籽種不能及時(shí)上市；第二鑒定標(biāo)準(zhǔn)模 糊，田間鑒定的鑒定標(biāo)準(zhǔn)很主觀，完全通過(guò)目測(cè)與已確定是雜交一代籽種的植株和商品瓜 進(jìn)行對(duì)比，標(biāo)準(zhǔn)不明確。
[0004] 分子標(biāo)記技術(shù)的誕生，為種子純度的分子鑒定奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。分子標(biāo)記可以直 接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限 制，不存在表達(dá)與否等問(wèn)題。尤其是微衛(wèi)星（SSR)技術(shù)，微衛(wèi)星DNA數(shù)量多且均勻分布在基 因組中，具有豐富的多態(tài)性，并且微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)可以顯示純合子和雜合子，易檢測(cè)、重復(fù) 性好、省時(shí)，適合于大通量分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度的引物序 列。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能快速地檢測(cè)津優(yōu)401號(hào) 黃瓜雜交種子純度的方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠、低成本、不受環(huán) 境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，在黃瓜種子純度鑒定上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)內(nèi)容： 一種用于檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸 序列具有：SEQ ID N0:1-2所示的核苷酸序列，其序列如下： 上游引物 AATTAAAITTGCACGTCATCTTCA 下游引物 ITITGTGCTTAAAAITTGTAATTATGC。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了采用該核苷酸序列檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度的方 法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行： (1) 提取津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子基因組DNA ; (2) PCR擴(kuò)增：在PCR擴(kuò)增專(zhuān)用薄壁管中加入津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子基因組DNA 10~ 20ng，再加入上游引物15~30ng、下游引物15~30ng、l倍的含Mg2+的PCR緩沖液、dNTP 2mmol、Taq DNA聚合酶0. 5~1單位，加無(wú)菌重蒸餾水至10yl;將PCR擴(kuò)增專(zhuān)用薄壁管 放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 °C預(yù)變性180秒；94 °C變性30秒，50-55°C退火30 秒，72°C延伸60秒，30個(gè)循環(huán)；再72°C延伸7 min，擴(kuò)增完成； (3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析：將擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳 分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝 膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見(jiàn)光下觀 察、照相。所述的變性凝膠上樣緩沖液指的是TBE電泳緩沖液成分-Tris，硼酸和EDTA，用 量500mL，每1L TBE電泳緩沖液含有12. lgTris，5. 5g硼酸0. 744克EDTA用去離子水溶解， 比例關(guān)系為16. 3:7. 4:1。
[0009] (4)依據(jù)被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純 度。從照片上可以看到津優(yōu)401號(hào)雜交種子在145bp左右同時(shí)具有箭頭1和箭頭2所示的 條帶，在此位置只有1或者2,或者二者都沒(méi)有的，不是該品種。
[0010] 本發(fā)明公開(kāi)的用于檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度的核苷酸序列及檢測(cè)方法 與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下的積極效果： 本發(fā)明具有快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠、低成本、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)津優(yōu)401號(hào) 黃瓜雜交種子純度進(jìn)行鑒定只需要5-6小時(shí)就可以完成一個(gè)批次的鑒定。節(jié)省了大量人 力、地力，鑒定結(jié)果快速準(zhǔn)確。在黃瓜種子純度鑒定上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
[0011]
【附圖說(shuō)明】： 圖1為津優(yōu)401號(hào)雜交種檢測(cè)電泳圖； 圖2為津優(yōu)401號(hào)marker電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，實(shí)施例僅為解釋性的，決不意味著它 以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益的效果。本發(fā)明 用到的津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子由天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司對(duì)外銷(xiāo)售。其他用到的 試劑均由市售。
[0013] 實(shí)施例1 檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度的方法，包括如下步驟： 提取津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子發(fā)芽36小時(shí)后根尖的基因組DNA ;采用CTAB法提取DNA 詳細(xì)步驟： 在1. 5mL尚七、官中加入l_2cm長(zhǎng)根尖；用攝子將根尖置于尚;L、官底部，再加2粒鋼珠 于每個(gè)離心管中；加400 yL CTAB緩沖液，蓋上離心管蓋，將離心管放在研磨機(jī)專(zhuān)用45孔 板上；將45孔板在研磨機(jī)上夾好，研磨30s ;將離心管從45孔板取出，放在24孔式支架上， 65°C水浴加熱lh，每隔lOmin上下翻轉(zhuǎn)離心管3-5下，以保證CTAB緩沖液能夠充分提取組 織中的DNA ;加400 y L 24:1氯仿/異戊醇，上下翻轉(zhuǎn)混勻20min，以保證樣品與氯仿充分 混合；12000r/min離心10min ;吸取上清液360 y L，加入上清液的2/3量約240ul異戊醇 (_20°C冰箱中取出)的1.5mL離心管中，輕輕上下顛倒混勻；靜置lOmin后，10000r/min離 心5min，倒去液體，留下管壁的沉淀；加200 y L TE，再加入4 y L 2mg/mL的RNase (RNA水 解酶)溶解DNA ;37°C水浴加熱lh去除RNA ;加400 y L 95%乙醇，混合均勻，放入-20°C冰箱 中沉淀30min ;8000r/min離心，lOmin ;倒掉上清，置于超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行烘干；加200 y L TE溶 解DNA，置于4°C冰箱，保存。
[0014] (2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：在PCR擴(kuò)增專(zhuān)用薄壁管中加入津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子基因組 DNA 10ng，再加入上游引物15ng、下游引物15ng、l倍的含Mg2+的PCR緩沖液、dNTP 2mmol、 Taq DNA聚合酶0. 5單位，加無(wú)菌重蒸餾水至10 y 1 ;將PCR擴(kuò)增專(zhuān)用薄壁管放入PCR儀中 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 °C預(yù)變性180秒；94 °C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸60秒 ，30個(gè)循環(huán)；再72°C延伸7 min，擴(kuò)增完成； (3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析：將擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳 分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液（TBE電泳緩沖液-成分-Tris-Hcl，硼酸和 EDTA-用量500mL)，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚 蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見(jiàn)光下觀察、照相； (4) 依據(jù)被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度。
[0015] (5)結(jié)果：同時(shí)具有箭頭1和箭頭2所示的條帶，在此位置只有1或者2,或者二者 都沒(méi)有的，不是該品種。
[0016] 實(shí)施例2 檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行： (1) 提取津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子基因組DNA ; (2) PCR擴(kuò)增：在PCR擴(kuò)增專(zhuān)用薄壁管中加入津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子基因組DNA 20ng，再加入上游引物25ng、下游引物25ng、l倍的含Mg 2+的PCR緩沖液、dNTP 2mmol、Taq DNA聚合酶1單位，加無(wú)菌重蒸餾水至10 y 1 ;將PCR擴(kuò)增專(zhuān)用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增， 擴(kuò)增條件為：94 °C預(yù)變性180秒；94 °C變性30秒，50-55°C退火30秒，72°C延伸60秒 ，30個(gè)循環(huán)；再72°C延伸7 min，擴(kuò)增完成； (3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析：將擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳 分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝 膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見(jiàn)光下觀 察、照相；依據(jù)被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度。
[0017] 實(shí)施例3 對(duì)比試驗(yàn)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序 列具有：SEQIDNO: 1-2所示的核苷酸序列。
2. -種采用權(quán)利要求1所述核苷酸檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度的方法，其特征 在于按如下的步驟進(jìn)行： 提取津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子基因組DNA; PCR擴(kuò)增：在PCR擴(kuò)增專(zhuān)用薄壁管中加入津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子基因組DNA10~ 20ng，再加入上游引物15~30ng、下游引物15~30ng、l倍的含Mg2+的PCR緩沖液、dNTP 2mmol、TaqDNA聚合酶0.5~1單位，加無(wú)菌重蒸餾水至IOyl;將PCR擴(kuò)增專(zhuān)用薄壁管 放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 °C預(yù)變性180秒；94 °C變性30秒，50-55°C退火30 秒，72°C延伸60秒，30個(gè)循環(huán)；再72°C延伸7min，擴(kuò)增完成； PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析：將擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分 離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠 上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見(jiàn)光下觀 察、照相；依據(jù)被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)津優(yōu)401號(hào)黃瓜雜交種子純度的核苷酸序列,具有：SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸。采用該核苷酸序列鑒定黃瓜種子純度的方法，包括：（1）供試材料DNA的提??；（2）用序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列及SEQ ID No2所述的核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增；（3）擴(kuò)增DNA片段的凝膠電泳分析；（4）依據(jù)被檢測(cè)的樣品在凝膠上條帶的狀況，鑒定黃瓜種子的純度。本發(fā)明具有快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠、低成本、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，在黃瓜種子純度鑒定上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】C12N15-11, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104762394
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510170435
【發(fā)明人】崔興華, 韓毅科, 杜勝利, 魏愛(ài)民, 劉楠, 陳正武, 趙海燕
【申請(qǐng)人】天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年4月13日