一種用于快速檢測(cè)人類cyp2c19基因多態(tài)性的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域臨床檢測(cè)技術(shù)中的基因檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒及其使用方法。本發(fā)明所述試劑盒包括3對(duì)引物、3條探針、6條PNA序歹[I，1對(duì)13-Actin內(nèi)標(biāo)引物及1條內(nèi)標(biāo)探針，還包括Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合物、Taq酶和ddH20。利用本發(fā)明試劑盒能夠?qū)YP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行定性檢測(cè)，根據(jù)SNP位點(diǎn)進(jìn)行兩管PNA-PCR熒光擴(kuò)增反應(yīng)，只需根據(jù)兩管熒光曲線是否起線就能進(jìn)行結(jié)果判斷，不會(huì)產(chǎn)生人為誤差，假陽性和假陰性率低；本發(fā)明試劑盒更容易實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，更能滿足臨床使用。
【專利說明】-種用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒及其 使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域臨床檢測(cè)技術(shù)中的基因檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種用于快 速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒及其使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞色素？450化7丨〇(*1'〇1116?450,0￥?450)是由一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的超家族 基因（Superfamily gene)編碼的同工酶，對(duì)于人類，其主要存在于肝細(xì)胞微粒體中。在 CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，有15個(gè)亞家族（CYP2A到2Q)，它們代謝約20 %目前 臨床使用的藥物，其中CYP2A、CYP2C、CYP2D和CYP2E均具有遺傳多態(tài)性和種族差異。人的 肝臟中CYP2C約占20%，現(xiàn)已克隆出CYP2C8、2C9/10、2C18和2C19。近年來CYP450的基因 型與不同個(gè)體的藥物代謝酶活性的相關(guān)性研究有很大進(jìn)展，通過檢測(cè)編碼相關(guān)藥物代謝酶 的基因型來判斷不同個(gè)體對(duì)藥物的代謝以及藥效、不良反應(yīng)情況，從而指導(dǎo)用藥，達(dá)到個(gè)體 化醫(yī)療的目的。
[0003] 研究表明，CYP2C19對(duì)藥物代謝的能力隨著等位基因的不同組合而呈現(xiàn)出一定 的規(guī)律性，表現(xiàn)為：正?；蚣兒献印嫡；蚺c突變基因雜合子〉突變基因純合子或雜 合子，即通常所說的基因劑量效應(yīng)。CYP2C19*1/*1野生純合子代表的是強(qiáng)代謝者（EM)， CYP2C19*2/*2或CYP2C19*3/*3突變純合子代表的是弱代謝者（PM), CYP2C19*l/*2或 CYP2C19*l/*3雜合子代表的是中間代謝者（IM)，即雜合子強(qiáng)代謝者，CYP2C19*1/*17或 CYP2C19*17/*17代表的是超快代謝者（UM)。這些代謝類型的不同會(huì)造成藥物體內(nèi)不同的 代謝速率，造成不同的藥效。因此根據(jù)CYP2C19基因型來判斷不同個(gè)體對(duì)藥物的代謝以及 藥效、不良反應(yīng)情況，從而指導(dǎo)用藥，達(dá)到個(gè)體化醫(yī)療的目的。
[0004] 目前，用于基因分型的檢測(cè)方法分為四類：測(cè)序法，聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng) 度多態(tài)性技術(shù)（PCR-RFLP)、芯片法、熒光定量PCR法（qPCR)四種方法。
[0005] 測(cè)序法：先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有目的SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，然后純化PCR產(chǎn)物， 再對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序峰圖判讀基因型。優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果準(zhǔn)確，測(cè)序法是基因多態(tài)性位點(diǎn)檢 測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是其成本較高，操作繁瑣，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，限制了其在臨床使用。
[0006] PCR-RFLP技術(shù)：先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有目的SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，然后對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切，電泳檢測(cè)酶切條帶，根據(jù)酶切條帶進(jìn)行判讀。優(yōu)點(diǎn)：成本低，結(jié)果比較直觀； 缺點(diǎn)：有的多態(tài)性位點(diǎn)所在位置沒有合適的限制性酶切位點(diǎn)，需要人工引入突變，另外容易 造成產(chǎn)物污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果，同時(shí)操作繁瑣，試驗(yàn)周期長(zhǎng)。
[0007] 芯片法：先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有目的SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，然后將PCR產(chǎn)物與 突變探針、野生探針雜交，通過比較兩個(gè)探針雜交的信號(hào)強(qiáng)度判斷樣品基因型。缺點(diǎn)=PCR 產(chǎn)物需要進(jìn)行后續(xù)分析，操作繁瑣；另外結(jié)果不好判讀，容易出現(xiàn)假陽性。
[0008] qPCR法：又分為ARMS-PCR法、HRM法和Taqman探針法。qPCR的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單， 試驗(yàn)周期短，PCR產(chǎn)物無需進(jìn)行后續(xù)分析即可判斷結(jié)果，因全過程在封閉的管內(nèi)進(jìn)行，減少 產(chǎn)物交叉污染。同時(shí)該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短。目前該方法已成為臨床常用的檢測(cè)方 法。
[0009] ARMS-PCR法又叫等位基因特異PCR，TaqDNA聚合酶缺少3' - 5'外切酶活性，在 一定條件下PCR引物3'末端的錯(cuò)配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少，針對(duì)不同的已知突變，分別設(shè)計(jì) 突變引物、野生引物，2個(gè)引物主要是3'末端堿基不同。由于3'末端不配對(duì)的引物產(chǎn)物量 減少或不擴(kuò)增，突變引物和野生引物的Ct值會(huì)有顯著差異，通過設(shè)定區(qū)分野生型和突變型 的閾值，當(dāng)突變引物與野生引物Ct值差值（ACt)大于閾值時(shí)即為突變型。缺點(diǎn)：引物設(shè)計(jì) 困難，對(duì)于多態(tài)性位點(diǎn)還有大量GC或AT序列時(shí)，往往束手無策，同時(shí)結(jié)果判斷較為困難。
[0010] HRM法：高分辨率熔解曲線分析技術(shù)（High Resolution Melting，HRM)，有染料法 和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)雙探針法等。染料法對(duì)熒光染料、PCR儀器要求較高，臨床檢 測(cè)比較少用。FRET (fluorescence resonance energy transfer, FRET)探針比較常用，羅氏 專利的FRET探針又稱為雙雜交探針。在SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩條FRET探針，當(dāng)兩條探針和模版 互補(bǔ)、且相鄰的特異探針組成，上游探針的3'端標(biāo)記供體熒光基團(tuán)，相鄰下游探針的5' 端標(biāo)記Red640受體熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時(shí)，兩探針同時(shí)結(jié)合在模板上，供體基團(tuán)和Red640受 體基團(tuán)緊密相鄰，激發(fā)供體產(chǎn)生的熒光能量被Red640基團(tuán)吸收，使得檢測(cè)探頭可以檢測(cè)到 Red640發(fā)出波長(zhǎng)為640的熒光。當(dāng)變性時(shí)，兩探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能檢測(cè)到640波 長(zhǎng)的熒光。FRET探針檢測(cè)的信號(hào)是退火時(shí)的實(shí)時(shí)信號(hào)，每次檢測(cè)信號(hào)始終嚴(yán)格對(duì)應(yīng)模版的 數(shù)量，非累積信號(hào)，可以用于做Tm曲線進(jìn)行SNP檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：一個(gè)SNP位點(diǎn)基因型，只需要 一管PCR完成檢測(cè)；缺點(diǎn)：根據(jù)HRM溶解曲線Tm值差異不容易判讀，不同基因型溶解曲線峰 圖差異不明顯。
[0011] MGB-Taqman探針法：Taqman探針是一種經(jīng)典的定量PCR技術(shù)，現(xiàn)階段得到廣泛應(yīng) 用，在PCR反應(yīng)體系中加入一對(duì)引物的和一個(gè)特異性熒光探針，探針只與兩條引物之間特 異性模板結(jié)合，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程。探針的5'端連接報(bào)告熒光，3' 端連接淬滅熒光，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸 時(shí)，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會(huì)將探針序列上5'端的報(bào)告熒光切下，淬滅 熒光不再能對(duì)報(bào)告熒光進(jìn)行抑制，使得報(bào)告熒光發(fā)光。針對(duì)SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)兩個(gè)不同熒 光標(biāo)記突變探針、野生探針，根據(jù)突變探針、野生探針熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行SNP位點(diǎn)基因型判 讀。缺點(diǎn)=Taqman探針需要采用MGB-Taqman探針，當(dāng)SNP位點(diǎn)的上游和下游含有大量GC或 AT堿基時(shí)，MGB-Taqman探針的設(shè)計(jì)和合成非常困難，且價(jià)格非常昂貴。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因 多態(tài)性的試劑盒及其使用方法，本發(fā)明提供的是一種基于PNA-PCR方法的基因多態(tài)性檢測(cè) 試劑盒，該試劑盒成本低廉、操作簡(jiǎn)單、特異性和敏感性好，能夠快速靈敏地檢測(cè)待測(cè)位點(diǎn) 基因類型，從而準(zhǔn)確對(duì)人類CYP2C19基因多態(tài)性進(jìn)行基因分型。
[0013] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0014] 一種用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒，包括3對(duì)引物、3條探針、6 條PNA序列，1對(duì)P-Actin內(nèi)標(biāo)引物及1條內(nèi)標(biāo)探針序列，具體的包括：
[0015] 用于檢測(cè)CYP2C19基因681G的引物序列如SEQ NO. 1、SEQ NO. 2所示，探針序列如 SEQ NO. 7所示，PNA序列如SEQ NO. 10所示；
[0016] 用于檢測(cè)CYP2C19基因681A的引物序列如SEQ NO. 1、SEQ NO. 2所示，探針序列如 SEQ NO. 7所示，PNA序列如SEQ NO. 11所示；
[0017] 用于檢測(cè)CYP2C19基因836G的引物序列如SEQ NO. 3、SEQ NO. 4所示，探針序列如 SEQ NO. 8所示，PNA序列如SEQ NO. 12所示；
[0018] 用于檢測(cè)CYP2C19基因836A的引物序列如SEQ NO. 3、SEQ NO. 4所示，探針序列如 SEQ NO. 8所示，PNA序列如SEQ NO. 13所示；
[0019] 用于檢測(cè)CYP2C19基因-806C的引物序列如SEQ NO. 5、SEQ NO. 6所示，探針序列 如SEQ NO. 9所示，PNA序列如SEQ NO. 14所示；
[0020] 用于檢測(cè)CYP2C19基因-806T的引物序列如SEQ NO. 5、SEQ NO. 6所示，探針序列 如SEQ NO. 9所示，PNA序列如SEQ NO. 15所示；
[0021] 用于P -Actin內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增的引物序列如SEQ NO. 16、SEQ NO. 17所示，內(nèi)標(biāo)探針序列 如SEQ NO. 18所示。
[0022] 按上述方案，所述的用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒還包括Mg2+ 的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合物、Taq酶和CldH 2O。
[0023] 按上述方案，所述的用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒還包括6個(gè) 陽性對(duì)照品和1個(gè)陰性對(duì)照品，所述陽性對(duì)照品為包含有CYP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)681G、 681A、836G、836A、-806C或-806T的重組質(zhì)粒和包含有內(nèi)標(biāo)基因的重組質(zhì)粒的混合物，所述 陰性對(duì)照品為不包含內(nèi)標(biāo)基因和目的基因位點(diǎn)的重組質(zhì)粒。
[0024] 按上述方案，所述3條探針為Taqman探針，探針5'端的熒光基團(tuán)為FAM，3'端的 淬滅基團(tuán)為BHQl。
[0025] 按上述方案，所述1條內(nèi)標(biāo)探針為Taqman探針，探針5'端的突光基團(tuán)為R0X，3' 端的淬滅基團(tuán)為BHQl。
[0026] 一種用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒的使用方法，包括如下步 驟：（1)提取待測(cè)人的基因組DNA作為檢測(cè)樣品；
[0027] (2)取1個(gè)PCR8聯(lián)管，在其中A?F 6個(gè)管中分別加入檢測(cè)樣品，另取一個(gè)PCR8 聯(lián)管，在A?F 6個(gè)管中分別加入6個(gè)不同的陽性對(duì)照品，再取一個(gè)PCR8聯(lián)管，在A?F 6 個(gè)管中分別加入陰性對(duì)照品；
[0028] (3)將PCR8聯(lián)管置于熒光PCR儀器中進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采集FAM和ROX熒 光信號(hào)；
[0029] (4)結(jié)果判斷：a.當(dāng)陽性對(duì)照管均有FAM和ROX熒光信號(hào)起線，陰性對(duì)照管均無 FAM和ROX熒光信號(hào)起線，檢測(cè)樣品管均有ROX熒光信號(hào)起線時(shí)，判斷試驗(yàn)成功；b.根據(jù)檢 測(cè)樣品管A和B的FAM熒光信號(hào)是否起線判斷CYP2C19基因681的分型，根據(jù)檢測(cè)樣品管 C和D的FAM熒光信號(hào)是否起線判斷CYP2C19基因836的分型，根據(jù)檢測(cè)樣品管E和F的 FAM熒光信號(hào)是否起線判斷CYP2C19基因-806的分型。
[0030] 按上述方案，所述PCR8聯(lián)管中A和B管內(nèi)含有與檢測(cè)人類CYP2C19基因681分型 相關(guān)的PCR反應(yīng)液，所述C管和D管內(nèi)含有與檢測(cè)人類CYP2C19基因836分型相關(guān)的PCR反 應(yīng)液，所述E管和F管中含有與檢測(cè)人類CYP2C19基因-806分型相關(guān)的PCR反應(yīng)液，所述 PCR反應(yīng)液包含與檢測(cè)基因位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的引物、探針、PNA序列、內(nèi)標(biāo)引物及內(nèi)部探針、Taq 酶、dNTP混合液、Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液和ddH20。
[0031] 按上述方案，所述陽性對(duì)照品為包含有CYP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)681G、681A、 836G、836A、-806C或-806T的重組質(zhì)粒和包含有內(nèi)標(biāo)基因的重組質(zhì)粒的混合物，所述陰性 對(duì)照品為不包含內(nèi)標(biāo)基因和目的基因位點(diǎn)的重組質(zhì)粒。
[0032] 本發(fā)明試劑盒是基于PNA-PCR方法的基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其技術(shù)原理是：肽 核酸是（peptide nucleic acids,PNA) -類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它 是在第一代、第二代反義試劑的基礎(chǔ)上，通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)構(gòu)建并最終人工合成的第三代反 義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了 DNA 中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對(duì)的形 式識(shí)別并結(jié)合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶負(fù)電荷，與DNA和 RNA之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA 間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜 交能力遠(yuǎn)優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識(shí)別能力、 不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA與互補(bǔ)DNA具有1個(gè)堿基不匹配時(shí)，其溶解溫度會(huì)下 降8°C?20°C，2個(gè)堿基不匹配時(shí)則完全不能雜交，當(dāng)PNA與互補(bǔ)DNA完全匹配時(shí)，因其PNA 為肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵，所以能夠阻止DNA擴(kuò)增。本試劑盒利用PNA的這些特性 進(jìn)行CYP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)分型，此處以CYP2C19基因681分型為例說明本發(fā)明試劑盒 的工作原理：首先根據(jù)CYP2C19基因681G設(shè)計(jì)PNA序列1 (序列如SEQ ID NO. 10所示）， 根據(jù)CYP2C19基因681A設(shè)計(jì)PNA序列2(序列如SEQ ID NO. 11所示），然后對(duì)待測(cè)基因同 時(shí)進(jìn)行兩管PNA-PCR熒光PCR反應(yīng)（即在進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)加入PNA序列），其中一管 PNA-PCR熒光PCR反應(yīng)中加入PNA序列1，另一管PNA-PCR熒光PCR反應(yīng)中加入PNA序列2， 當(dāng)PNA與待測(cè)基因的DNA序列相匹配時(shí)，熒光PCR反應(yīng)被阻斷，熒光PCR反應(yīng)無起線；當(dāng)PNA 與待測(cè)基因的DNA序列不相匹配時(shí)，熒光PCR反應(yīng)順利進(jìn)行，熒光PCR反應(yīng)有起線），因此可 以根據(jù)兩管熒光PCR反應(yīng)是否起線來判斷CYP2C19基因681的分型，所述分型為純合野生 型（僅一管PCR反應(yīng)起線）、雜合型（二管PCR反應(yīng)同時(shí)起線）或純合突變型（僅一管PCR 反應(yīng)起線）。
[0033] 本發(fā)明的有益效果：
[0034] (1)利用本發(fā)明試劑盒能夠?qū)YP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行定性檢測(cè)，根據(jù)SNP位 點(diǎn)進(jìn)行兩孔PNA-PCR熒光擴(kuò)增反應(yīng)，只需根據(jù)兩孔熒光曲線是否起線就能進(jìn)行結(jié)果判斷， 不會(huì)產(chǎn)生人為誤差，假陽性和假陰性率低，避免了傳統(tǒng)ARMS-PCR方法需要根據(jù)A ct值進(jìn)行 結(jié)果判斷，結(jié)果判定困難的缺點(diǎn)；
[0035] (2)本發(fā)明試劑盒所使用的熒光檢測(cè)探針為Taqman探針，該探針費(fèi)用低廉；同時(shí) 本發(fā)明所有的反應(yīng)全程閉管操作，PCR反應(yīng)后不需要進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化、電泳、酶切、雜交 等，在節(jié)省了檢測(cè)成本的同時(shí)，大大縮短了檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)的效率，另外降低了 PCR 產(chǎn)物污染引起假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。
[0036] (3)本發(fā)明試劑盒中包括內(nèi)標(biāo)引物和探針，通過檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因，減少了因樣本提取 問題導(dǎo)致的假陰性。
[0037] (4)本發(fā)明中使用的PNA設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，不需要進(jìn)行特殊的修飾就可以滿足CYP2C19基 因多態(tài)性檢測(cè)分析。
[0038] (5)本發(fā)明試劑盒是采用PNA鉗夾熒光定量PCR技術(shù)平臺(tái)，相對(duì)于測(cè)序法、 PCR-RFLP、芯片法更容易實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，更能滿足臨床使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 附圖1是CYP2C19基因681純合野生型擴(kuò)增曲線；
[0040] 附圖2是CYP2C19基因681雜合型擴(kuò)增曲線；
[0041] 附圖3是CYP2C19基因681純合突變型擴(kuò)增曲線；
[0042] 附圖4是CYP2C19基因836純合野生型擴(kuò)增曲線；
[0043] 附圖5是CYP2C19基因836雜合型擴(kuò)增曲線；
[0044] 附圖6是CYP2C19基因836純合突變型擴(kuò)增曲線；
[0045] 附圖7是CYP2C19基因-806純合野生型擴(kuò)增曲線；
[0046] 附圖8是CYP2C9基因-806雜合型擴(kuò)增曲線；
[0047] 附圖9是CYP2C9基因-806純合突變型擴(kuò)增曲線；
[0048] 附圖10是內(nèi)標(biāo)P -Actin基因擴(kuò)增曲線。 具體實(shí)施方案
[0049] 下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。
[0050] -種用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒，試劑盒中包括以下多態(tài)性 檢測(cè)的3對(duì)引物，3條探針、6條PNA序列、1對(duì)P-Actin內(nèi)標(biāo)引物和1條內(nèi)標(biāo)探針。

【權(quán)利要求】
1. 一種用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包括 3對(duì)引物、3條探針、6條PNA序列，1對(duì)P -Actin內(nèi)標(biāo)引物及1條內(nèi)標(biāo)探針，所述3對(duì) 引物的序列如SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 6所示，所述3條探針的序列如SEQ ID NO. 7?SEQ ID NO. 9所示，所述6條PNA序列如SEQ ID NO. 10?15所示，所述1對(duì)0-Actin內(nèi)標(biāo)引物的 序列如SEQ ID NO. 16?SEQ ID NO. 17所示，所述1條內(nèi)標(biāo)探針的序列如SEQ ID NO. 18所 /Jn 〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在 于，還包括Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合物、Taq酶和ddH 20。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在 于，還包括6個(gè)陽性對(duì)照品和1個(gè)陰性對(duì)照品，所述陽性對(duì)照品為包含有CYP2C19基因多態(tài) 性位點(diǎn)681G、681A、836G、836A、-806C或-806T的重組質(zhì)粒和包含有內(nèi)標(biāo)基因的重組質(zhì)粒的 混合物，所述陰性對(duì)照品為不包含內(nèi)標(biāo)基因和CYP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)的重組質(zhì)粒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在 于，所述3條探針為Taqman探針，探針5'端的熒光基團(tuán)為FAM，3'端的淬滅基團(tuán)為BHQl。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒，其特征 在于，所述1條內(nèi)標(biāo)探針為Taqman探針，探針5'端的突光基團(tuán)為R0X，3'端的洋滅基團(tuán)為 BHQl 0
6. 權(quán)利要求1所述的用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒的使用方法，其 特征在于，包括如下步驟： (1) 提取待測(cè)人的基因組DNA作為檢測(cè)樣品； (2) 取1個(gè)PCR8聯(lián)管，在其中A~F 6個(gè)管中分別加入檢測(cè)樣品，另取一個(gè)PCR8聯(lián)管， 在A~F 6個(gè)管中分別加入6個(gè)不同的陽性對(duì)照品，再取一個(gè)PCR8聯(lián)管，在A~F 6個(gè)管中分 別加入陰性對(duì)照品； (3) 將PCR8聯(lián)管置于熒光PCR儀器中進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采集FAM和ROX熒光信 號(hào)； (4) 結(jié)果判斷：a.當(dāng)陽性對(duì)照管均有FAM和ROX熒光信號(hào)起線，陰性對(duì)照管均無FAM和 ROX熒光信號(hào)起線，檢測(cè)樣品管均有ROX熒光信號(hào)起線時(shí)，判斷試驗(yàn)成功；b.根據(jù)檢測(cè)樣品 管A和B的FAM熒光信號(hào)是否起線判斷CYP2C19基因681的分型，根據(jù)檢測(cè)樣品管C和D 的FAM熒光信號(hào)是否起線判斷CYP2C19基因836的分型，根據(jù)檢測(cè)樣品管E和F的FAM熒 光信號(hào)是否起線判斷CYP2C19基因-806的分型。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒的使用方 法，其特征在于，所述PCR8聯(lián)管中A和B管內(nèi)含有與檢測(cè)人類CYP2C19基因681分型相關(guān) 的PCR反應(yīng)液，所述C管和D管內(nèi)含有與檢測(cè)人類CYP2C19基因836分型相關(guān)的PCR反應(yīng) 液，所述E管和F管中含有與檢測(cè)人類CYP2C19基因-806分型相關(guān)的PCR反應(yīng)液，所述PCR 反應(yīng)液包含與檢測(cè)基因位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的引物、探針、PNA序列、內(nèi)標(biāo)引物及內(nèi)部探針、Taq酶、 dNTP混合液、Mg 2+的PCR反應(yīng)緩沖液和ddH20。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于快速檢測(cè)人類CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒的使用 方法，其特征在于，所述陽性對(duì)照品為包含有CYP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)681G、681A、836G、 836A、-806C或-806T的重組質(zhì)粒和包含有內(nèi)標(biāo)基因的重組質(zhì)粒的混合物，所述陰性對(duì)照品 為不包含內(nèi)標(biāo)基因和目的基因位點(diǎn)的重組質(zhì)粒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104212904SQ201410473101
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】葉倫, 王寧, 劉金水, 李雪梅, 李倩, 陳剛 申請(qǐng)人:武漢康錄生物技術(shù)有限公司