一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒，其特征在于：包括PCR反應液A、PCR反應液B、Taq/UNG酶混合液、陽性對照和陰性對照；其中，所述PCR反應液A包括10×PCR?buffer、外顯子19缺失突變的引物和探針、T790M突變的引物和探針、L861Q突變的引物和探針、外顯子2的引物和探針、MgCl2、dNTPs和無菌蒸餾水；所述PCR反應液B包括10×PCR?buffer、外顯子20插入突變的引物和探針、S768的引物和探針I(yè)、L858R的引物和探針、G719X的引物和探針、MgCl2、dNTPs和無菌蒸餾水。本發(fā)明可用于檢測人表皮生長因子受體突變基因。
【專利說明】一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬體外診斷試劑領(lǐng)域，具體地，涉及一種試劑盒，更具體地，涉及一種人表 皮生長因子受體突變基因（29種）檢測的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC)是一種嚴重威脅人類健康 的惡性腫瘤，盡管手術(shù)和化療技術(shù)不斷提高，但患者的預后仍較差，5年存活率小于20 %。 目前，以人表皮生長因子受體（epithelium growth factor recptor，EGFR)為祀點的分子 靶向治療已成為治療NSCLC最重要的方式。
[0003] EGFR是原癌基因 C-erbB-Ι的表達產(chǎn)物，基因定位于第7號染色體上，屬于跨膜受 體酪氨酸激酶。EGFR與其配體結(jié)合后，能激活下游信號通路，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、分化、血 管生成及凋亡抑制，從而調(diào)控一系列腫瘤生物學行為。
[0004] 目前臨床上使用的針對EGFR的靶向藥物是EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI)， EGFR-TKI通過抑制EGFR自身磷酸化而阻斷EGFR信號傳導通路，從而抑制腫瘤細胞增殖分 化，實現(xiàn)靶向治療。EGFR-TKI的療效與EGFR基因突變狀況密切相關(guān)，EGFR基因突變主要集 中在外顯子18?21上，包括敏感突變和耐藥突變。因此，EGFR基因外顯子18?21突變 檢測可以很好的預測分子靶向藥物的治療效果，對指導臨床開展NSCLC的個體化靶向治療 具有重要意義。
[0005] 目前，針對EGFR基因突變的檢測方法主要有直接測序法、探針雜交法、高分辨率 熔解曲線法和ARMS熒光定量PCR等方法。
[0006] 直接測序法步驟繁瑣、周期長且靈敏度低，不適合應用于臨床檢測。探針雜交法對 雜交的條件非常敏感，需要嚴格控制實驗條件。分辨率熔解曲線法在檢測缺失突變時效果 較差。熒光定量PCR法具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應 等優(yōu)點，市場上已有該類產(chǎn)品。但是，對同一樣本需要同時進行8管PCR反應才能對29個 突變型進行檢測，檢測成本高，時效性不強。
[0007] 當前，迫切需要開發(fā)一種異性強、靈敏度高、操作簡單、經(jīng)濟方便、檢測通量高和時 效性強的EGFR基因突變檢測試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明旨在克服上述缺陷，提供一種特異性強、靈敏度高、操作簡單、經(jīng)濟方便、檢 測通量高和時效性強的試劑盒。
[0009] 本發(fā)明提供的一種試劑盒，其特征在于：包括PCR反應液A、PCR反應液B、Taq/UNG 酶混合液、陽性對照和陰性對照；
[0010] 其中，PCR反應液A包括10XPCR buffer、外顯子19缺失突變的引物和探針、T790M 突變的引物和探針、L861Q突變的引物和探針、外顯子2的引物和探針、MgCl2、dNTPs和無菌 蒸餾水；
[0011] 上述外顯子19缺失突變的引物和探針的序列為如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10 所示的序列，
[0012] 具體地，外顯子19缺失突變型上游引物19F1 :
[0013] 5， -TAAAATTCCCGTCGCTATCAAAACGA-3，；
[0014] 外顯子19缺失突變型上游引物19F2 :
[0015] 5， -ATTCCCGTCGCTATCAAAATATCGA-3';
[0016] 外顯子19缺失突變型上游引物19F3 :
[0017] 5，-ATTCCCGTCGCTATCAAGGATCGA-3';
[0018] 外顯子19缺失突變型上游引物19F4 :
[0019] 5' -TCCCGTCGCTATCAAGGAGCTC-3' ；
[0020] 外顯子19缺失突變型上游引物19F5 :
[0021] 5，-TCCCGTCGCTATCAAGGAGCAAT-3，；
[0022] 外顯子19缺失突變型上游引物19F6 :
[0023] 5，-TTCCCGTCGCTATCAAGGAACAT-3，；
[0024] 外顯子19缺失突變型上游引物19F7 :
[0025] 5，-TTCCCGTCGCTATCAAGGAACAGA-3';
[0026] 外顯子19缺失突變型上游引物19F8 :
[0027] 5，-TTCCCGTCGCTATCAAGGAACCA-3';
[0028] 外顯子19缺失突變型下游引物19R :
[0029] 5， -AGGTGAGGCAGATGCCCAG-3，；
[0030] 外顯子19缺失突變型探針19P :
[0031] 5; -CCAACAAGGAAATCCTC-3;；
[0032] 其中，5 ^端標記FAM熒光報告基團，3 ^端標記BHQ1熒光淬滅基團；
[0033] 上述T790M突變的引物和探針的序列為如SEQ ID N0. 11、SEQ ID N0. 12、SEQ ID NO. 13所示的序列，
[0034] 具體地，T790M突變型上游引物20F4 :
[0035] 5，-TCCACCGTGCAGCTCATGCA-3';
[0036] T790M突變型下游引物20R :
[0037] 5; -GTCCTCCAAGTAGTTC-3;；
[0038] T790M插入突變型探針20P1 :
[0039] 5; -TTCGGCTGCCTCCTGGAC-3;；
[0040] 其中，5'端標記J0E熒光報告基團，3'端標記BHQ1熒光淬滅基團；
[0041] 上述 L861Q 突變的引物和探針為如 SEQ ID N0. 14、SEQ ID N0. 15、SEQ ID N0. 16 所示的序列，
[0042] 具體地，L861Q突變型上游引物21F1 :
[0043] 5; -CAGATTTTGGGCTGGCCAAACAGC-3;；
[0044] L861Q突變型下游引物21R :
[0045] 5，-GACATCACTCTGGTGGGT-3，；
[0046] L861Q 突變型探針 21P1 :
[0047] 5; -GGAGGCAAAGTGCCTATC-3;；
[0048] 其中，5'端標記R0X熒光報告基團，3'端標記BHQ1熒光淬滅基團；
[0049] 上述外顯子2的引物和探針為如SEQ ID N0. 17、SEQ ID N0. 18、SEQ ID N0. 19所 示的序列，
[0050] 具體地，外顯子2上游引物EF :
[0051] 5， -TGCCAAGGCACGAGTAACAAG-3，；
[0052] 外顯子2下游引物ER :
[0053] 5; -TCCAAATTCCCAAGGACCAC-3;；
[0054] 外顯子2探針EP :
[0055] 5，-CTCAGCCTCCAGAGGATG-3，；
[0056] 其中，5'端標記CY5熒光報告基團，3'端標記BHQ1熒光淬滅基團。
[0057] 此外，本發(fā)明涉及的PCR反應液B包括10XPCR buffer、外顯子20插入突變的引 物和探針、S768的引物和探針I(yè)、L858R的引物和探針、G719X的引物和探針、MgCl 2、dNTPs 和無菌蒸餾水。
[0058] 上述外顯子20插入突變的引物和探針為如SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24 所示的序列，
[0059] 具體地，外顯子20插入突變型上游引物20F1 :
[0060] 5，-AGCGTGGACAACCCCCACACGT-3，；
[0061] 外顯子20插入突變型上游引物20F2 :
[0062] 5， -GTGGACAACCCCCACGGGTTGTGC-3';
[0063] 外顯子20插入突變型上游引物20F3 :
[0064] 5，-ATGGCCAGCGTGCCAGCGTGGGAC-3，；
[0065] 外顯子20插入突變型下游引物20R :
[0066] 5， -TGAGCAGGTACTGGGTGCC-3';
[0067] 外顯子20探針20P :
[0068] 5; -TTCGGCTGCCTCCTGGAC-3 ;；
[0069] 其中，5'端標記FAM熒光報告基團，3'端標記BHQ1熒光淬滅基團；
[0070] 上述 S768 的引物和探針 I 為如 SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26、SEQ ID N0. 27 所示 的序列，
[0071] 具體地，S768I突變型上游引物20F5 :
[0072] 5， -TAGCCTACGTGATGGCCATC-3';
[0073] S768I突變型下游引物20R:
[0074] 5，-TGAGCAGGTACTGGGTGCC-3';
[0075] 外顯子20探針20P :
[0076] 5; -TTCGGCTGCCTCCTGGAC-3 ;；
[0077] 其中，5'端標記J0E熒光報告基團，3'端標記BHQ1熒光淬滅基團；
[0078] 上述 L858R 的引物和探針為如 SEQ ID N0. 28、SEQ ID N0. 29、SEQ ID N0. 30 所示 的序列，
[0079] 具體地，L858R突變型上游引物21F2 :
[0080] 5; -GATTTTGGGCGGGCCAAAC-3;；
[0081] L858R突變型下游引物21R :
[0082] 5，-GACATCACTCTGGTGGGT-3，；
[0083] L858R突變型探針21P :
[0084] 5，-GGAGGCAAAGTGCCTATC-3';
[0085] 其中，5'端標記R0X熒光報告基團，3'端標記BHQ1熒光淬滅基團；
[0086] 上述 G719X 的引物和探針為如 SEQ ID N0. 31、SEQ ID N0. 32、SEQ ID N0. 33、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 所示的序列，
[0087] 具體地，G719X突變型（G719A)上游引物18F1 :
[0088] 5，-ATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGCCT-3，；
[0089] G719X 突變型（G719S)上游引物 18F2 :
[0090] 5; -GAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGAG-3 ;；
[0091] G719X 突變型（G719C)上游引物 18F3 :
[0092] 5， -ATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGTG-3，；
[0093] G719X突變型下游引物18R :
[0094] 5; -CTTTCTACCTTCTGGGATC-3 ;；
[0095] G719X突變型探針18P :
[0096] 5; -GTGCGTTCGGCACGGTG-3 ;；
[0097] 其中，5'端標記CY5熒光報告基團，3'端標記BHQ1熒光淬滅基團。
[0098] 在本發(fā)明中，外顯子19缺失突變、T790M突變、L861Q突變、外顯子2的引物和探針 的濃度為10-100 μ M。
[0099] 在本發(fā)明中，外顯子20插入突變、S768I、L858R和G719X的引物和探針的濃度為 10-100 μΜ〇
[0100] 在本發(fā)明中，MgCl2的濃度為25-100mM。
[0101] 在本發(fā)明中，dNTPs 為選自 25-100mM dATP、25-100mM dGTP、25-100mM dCTP、 12. 5-50mM dUTP、12. 5-50mM dTTP中的一種或幾種的混合物。
[0102] 在本發(fā)明中，Taq/UNG酶混合液包括5-20U/ μ L耐熱DNA聚合酶和1-10U/ μ L尿 嘧啶DNA糖基化酶。
[0103] 在本發(fā)明中，陰性對照為生理鹽水；
[0104] 在本發(fā)明中，陽性對照為含有G719X、外顯子19缺失突變型、外顯子20插入突變 型、T790M、L861Q、S768I、L858R和exon2的線性化重組質(zhì)粒的生理鹽水。
[0105] 此外，根據(jù)上述方法提供的試劑盒能應用于檢測人表皮生長因子受體突變基因。
[0106] 本發(fā)明的作用和效果
[0107] 本發(fā)明采用多色熒光PCR的技術(shù)，將同一樣本進行2管PCR擴增，以EGFR基因常 見的29種突變類型（如表1所示）作為檢測目標。
[0108] 能實現(xiàn)對高突變率的Exonl9缺失突變和Exon21的L858R突變檢測，也能對低突 變率的L861Q、T790M、S768I、G719X及Exon20插入突變檢測，同時還可通過exon2基因?qū)?檢測過程進行質(zhì)量控制，可有效實現(xiàn)對EGFR突變的監(jiān)控，滿足用藥前的篩查要求。
[0109] 表1 29種EGFR基因突變
[0110]

【權(quán)利要求】
1. 一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒，其特征在于：包括PCR反應液A、PCR 反應液B、Taq/UNG酶混合液、陽性對照和陰性對照； 其中，所述PCR反應液A包括10XPCR buffer、外顯子19缺失突變的引物和探針、 T790M突變的引物和探針、L861Q突變的引物和探針、外顯子2的引物和探針、MgCl2、dNTPs 和無菌蒸餾水； 所述PCR反應液B包括10XPCR buffer、外顯子20插入突變的引物和探針、S768的引 物和探針I(yè)、L858R的引物和探針、G719X的引物和探針、MgCl2、dNTPs和無菌蒸餾水。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒，其特征在于： 所述外顯子19缺失突變的引物和探針的序列為如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、 SEQ ID NO. 10所示的序列； 所述T790M突變的引物和探針的序列為如SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 所示的序列； 所述L861Q突變的引物和探針為如SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16所示 的序列； 所述外顯子2的引物和探針為如SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19所示的 序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒，其特征在于： 所述外顯子20插入突變的引物和探針為如SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24 所示的序列； 所述S768的引物和探針I(yè)為如SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27所示的序 列； 所述L858R的引物和探針為如SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 30所示的序 列； 所述 G719X 的引物和探針為如 SEQ ID NO. 31、SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 所示的序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒，其特征在 于：所述外顯子19缺失突變、T790M突變、L861Q突變、外顯子2的引物和探針的濃度為 10-100 μM〇
5. 如權(quán)利要求1所述的一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒，其特征在于： 所述外顯子20插入突變、S768I、L858R和G719X的引物和探針的濃度為10-100 μ M。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒，其特征在于： 所述MgCl2的濃度為25-100mM。
7. 如權(quán)利要求1所述的一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒，其特征在 于：所述 dNTPs 為選自 25-100mM dATP、25-100mM dGTP、25-100mM dCTP、12.5-50mM dUTP、 12. 5-50mM dTTP中的一種或幾種的混合物。
8. 如權(quán)利要求1所述的一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒，其特征在于： 所述Taq/UNG酶混合液包括5-20U/ μ L耐熱DNA聚合酶和1-10U/ μ L尿嘧啶DNA糖基化酶。
9. 如權(quán)利要求1所述的一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒，其特征在于： 所述陰性對照為生理鹽水； 所述陽性對照為含有G719X、外顯子19缺失突變型、外顯子20插入突變型、T790M、 L861Q、S768I、L858R和人β-globin的線性化重組質(zhì)粒的生理鹽水。
10.如權(quán)利要求1-9任一所述的一種人表皮生長因子受體突變基因檢測試劑盒，其特 征在于：用于檢測人表皮生長因子受體突變基因。
【文檔編號】C12Q1/68GK104087674SQ201410336176
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】宋冬梅, 劉軍輝, 劉代新 申請人:江蘇同科醫(yī)藥科技有限公司