一種高質(zhì)高效的多酚多糖類(lèi)植物樣品rna提取方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種多糖多酚類(lèi)植物樣品RNA的提取方法，結(jié)合CTAB法和OMEGA試劑盒所提供的商業(yè)試劑盒，開(kāi)發(fā)了一種高效率高質(zhì)量的RNA提取方法，經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)在黃梁木(Neolamarckia?cadamba)、茶樹(shù)(Camellia?sinensis?L.)、枇杷(Eriobotrya?japonica?Lindl.)、月季(Rosa?chinensis)、荔枝(Litchi?chinensis?Sonn.)、銀杏(Ginkgo?biloba?L.)、仙人掌(Opuntia?ficus-indica?L.)、火炬松(Pinus?taeda?L.)、蘆薈(Aloe?barbadensis?Mill.)、紅豆杉(Taxus?media)等植物各組織中都可以使用，效果良好，為今后分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中RNA的提取制備提供了一個(gè)良好的選擇。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種高質(zhì)高效的多酚多糖類(lèi)植物樣品RNA提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種高效率高質(zhì)量的植物RNA提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]提取高質(zhì)量的，沒(méi)有多糖、多酚、基因組DNA、蛋白質(zhì)或者其它次生代謝物質(zhì)污染的RNA對(duì)于研究植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中基因的功能和表達(dá)方式等很多后續(xù)的實(shí)驗(yàn)都至關(guān)重要，比如反轉(zhuǎn)錄PCR,實(shí)時(shí)定量PCR, cDNA文庫(kù)構(gòu)建，Northern印跡雜交和RNA-seq等。
[0003]酚類(lèi)很容易被氧化成為醌類(lèi)，而醌類(lèi)會(huì)和蛋白質(zhì)及核酸發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)合。而多糖類(lèi)物質(zhì)可以和RNA共沉淀，降低RNA的純度，影響在下游實(shí)驗(yàn)中的使用。
[0004]現(xiàn)在市場(chǎng)上常用的商業(yè)RNA提取試劑盒，比如Takara, Promega和Omega等對(duì)多酹多糖類(lèi)植物RNA提取也有較強(qiáng)的局限性。使用CTAB法可以部分克服多糖多酚類(lèi)物質(zhì)的干擾，但是CTAB法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，經(jīng)常會(huì)造成RNA的降解。
[0005]以此，我們結(jié)合使用CTAB裂解液裂解和試劑盒吸附柱純化的方法，發(fā)明了一種高效的在多酚多糖植物樣品中提取高質(zhì)量RNA的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)目前分子生物學(xué)研究中對(duì)高質(zhì)量植物RNA的需求，開(kāi)發(fā)了一種高效率高質(zhì)量提取含多酚多糖類(lèi)植物樣品RNA的方法。
[0007]本發(fā)明技術(shù)方案如下，主要特點(diǎn)是:
[0008]A裂解:液氮研磨后的樣品IOOmg加入經(jīng)過(guò)60 V預(yù)熱的CTAB裂解液600 μ I，同時(shí)加入12 μ I的β -巰基乙醇，渦旋振蕩2min，60°C裂解lOmin，期間上下顛倒混勻數(shù)次，
[0009]B抽提:加入600 μ I按照24:1混勻的氯仿:異戊醇，渦旋震蕩2min離心10min吸取上清后再次用上述氯仿:異戊醇抽提離心10min(對(duì)于芽、嫩葉等色素或者其它代謝物質(zhì)豐富的組織器官要適當(dāng)增加離心時(shí)間，比如黃梁木(Neolamarckia cadamba)的芽離心20min效果最佳)。
[0010]所述裂解液的配制:2% CTAB, 2 % PVP K-40, IOOmM Tris-HCl (pH8.0)，25mMEDTA (pH8.0)，2.0M NaCl，2g/L 亞精胺。
[0011]本發(fā)明的高效率高質(zhì)量的多酚多糖類(lèi)植物組織RNA提取方法，可以快速提取多酚多糖類(lèi)植物組織樣品的RNA，并且純度高，無(wú)降解，可以直接用于下游實(shí)驗(yàn)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為使用該方法提取的常見(jiàn)多酚多糖類(lèi)植物樣品的RNA電泳圖。
[0013]圖2為使用該方法提取的黃梁木各組織RNA電泳圖。
[0014]圖3為使用該方法提取的常見(jiàn)多酚多糖類(lèi)植物樣品的RNA濃度及OD值。
[0015]圖4為使用該方法提取的黃梁木各組織RNA濃度及OD值?！揪唧w實(shí)施方式】
[0016]結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0017]實(shí)施例一黃梁木葉片RNA的提取
[0018]采取一年生黃梁木(株高1.5m,地徑2.1cm)中上部成熟的葉片,迅速放入液氮速凍，研磨成微小的顆粒放入1.5ml無(wú)RNase污染的離心管中，每管樣品約lOOmg。
[0019]提前配制的CTAB裂解液經(jīng)60°C預(yù)熱后，吸取600 μ I加入樣品中，同時(shí)加入10 μ I的β -巰基乙醇，渦旋振蕩兩分鐘后60°C恒溫裂解lOmin，期間顛倒混勻數(shù)次。
[0020]加入按24:1混勻的氯仿:異戊醇抽提液600ul，渦旋振蕩2min，4°C 14, OOOx g離心IOmin0吸取上清液到一個(gè)新的離心管中再次加入600ul的抽提液渦旋振蕩2min，4°C 14，OOOx g 離心 10min.
[0021]吸取上清到一個(gè)新的離心管中，加入500ul的Buffer RB,和500ul無(wú)水乙醇,顛倒混勻。
[0022]將上述溶液轉(zhuǎn)移到Hibind RNA Mini column上,常溫10，OOOx g離心Imin,棄去濾液。
[0023]吸附柱上加入300ul RffC wash Buffer,常溫10，OOOx g離心lmin,棄去濾液。
[0024]在吸附柱膜的中央滴入混合好的DNase I消化液75ul (使用時(shí)現(xiàn)配，1.5ulRNase-free DNase I 和 73.5ul OBI DNase I Digestion Buffer)，室溫(25°C -30°C )孵育15min。
[0025]將吸附柱轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的收集管中，加入400ul RffC wash Buffer,室溫放置5min,常溫10, OOOx g離心lmin,棄去濾液。
[0026]在吸附柱上加入500ul RNA wash Buffer II常溫10，OOOx g離心lmin,棄去濾液(RNA wash Buffer使用前需要按照說(shuō)明書(shū)使用無(wú)水乙醇稀釋)。
[0027]重復(fù)上述步驟。
[0028]倒出濾液，空管常溫10，OOOx g離心2min。
[0029]將吸附柱放入新的1.5ml無(wú)RNase污染的離心管上，加入40ul DEPC water到膜中央，室溫放置2min, 10, OOOx g離心lmin。
[0030]將離心管收集到的溶液重新吸取到吸附柱上，室溫放置2min，10，OOOx g離心Imin0
[0031]棄去吸附柱，保存離心管待用。
[0032]使用核酸蛋白檢測(cè)儀及電泳儀檢測(cè)濃度、純度及完整度。
[0033]備注:以上步驟所用Buffer RB, Hibind RNA Mini column, RffC wash Buffer,RNase-free DNase I , OBI DNase I Digestion Buffer, RNA wash Buffer II, DEPC water 等試劑及材料均來(lái)自O(shè)mega產(chǎn)品E.Z.N.A.? Plant RNA KU，其它試劑及材料為常規(guī)試劑耗材。
[0034]實(shí)施例二黃梁木葉芽RNA的提取
[0035]本實(shí)例中將實(shí)例一步驟中氯仿:異戊醇抽提離心的時(shí)間由IOmin改為20min，其它相同。
[0036]上述實(shí)例檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖。
[0037]以上結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作了說(shuō)明，但這些說(shuō)明不能被理解為限制了本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍由隨附的權(quán)利要求書(shū)限定，任何在本發(fā)明權(quán)利要求基礎(chǔ)上的改動(dòng)都是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明所述的一種高質(zhì)高效的多酚多糖類(lèi)植物組織RNA提取方法，其主要特征在于: A裂解:液氮研磨后的樣品IOOmg加入經(jīng)過(guò)60°C預(yù)熱的CTAB裂解液600 μ 1，同時(shí)加入10 μ 1的β -巰基乙醇，渦旋振蕩2min，60°C裂解10min，期間上下顛倒混勻數(shù)次。 B抽提:加入600 μ I按照24:1混勻的氯仿:異戍醇，潤(rùn)旋震蕩2min離心10min吸取上清后再次用上述氯仿:異戊醇抽提離心10min(對(duì)于芽、嫩葉等色素或者其它代謝物質(zhì)豐富的組織器官要適當(dāng)增加離心時(shí)間，比如黃梁木(Neolamarckia cadamba)的芽離心20min效果最佳)。 所述裂解液的配制:2 % CTAB, 2 % PVP K-40, 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mMEDTA (pH8.0)，2.0M NaCl，2g/L 亞精胺。 本發(fā)明所述的高質(zhì)高效的多酚多糖類(lèi)植物組織RNA提取方法，可以快速提取多酚多糖類(lèi)植物組織樣品的RNA，并且純度高，無(wú)降解，可以直接用于下游實(shí)驗(yàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高質(zhì)高效的多酚多糖類(lèi)植物組織RNA提取方法，其特征在于步驟A中所涉及的裂解液配方、步驟B中氯仿異戊醇抽提的時(shí)間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高質(zhì)高效的多酚多糖類(lèi)植物組織RNA提取方法，其特征在于步驟A中所涉及的CTAB裂解液，DEPC處理后加入2g/L亞精胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高質(zhì)高效的多酚多糖類(lèi)植物組織RNA提取方法，其特征在于步驟B所涉及的氯仿:異戊醇抽提時(shí)間，一般樣品抽提離心10min，對(duì)于芽、嫩葉或者其它代謝物質(zhì)豐富的組織適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104017804SQ201410298718
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】李俊成, 歐陽(yáng)昆唏, 黃浩, 陳曉陽(yáng) 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)