一種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，包括以下步驟：⑴取材：在一天中任意時間取生長旺盛的盆栽新麥草的新生根并將其放入離心管中；⑵裝有根尖的離心管置于高壓容器裝置內(nèi)，通N2O進行預(yù)處理，得預(yù)處理后的新根；⑶預(yù)處理后的新根吸干水分，用卡諾氏液固定，得固定后的新根；⑷固定后的新根漂洗、吸干后用冰乙酸解離，得解離后的新根；⑸將解離后的新根中的水分吸干后置于載玻片上，制作壓片；⑹將壓片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行照相，以便進行熒光原位雜交，最后用玻璃刀做好蓋玻片位置的標記，將做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。本發(fā)明高效、穩(wěn)定。
【專利說明】一種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞遺傳學(xué)領(lǐng)域中植物染色體中期分裂相標本的制備方法，尤其涉及一種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]染色體制片是細胞遺傳學(xué)研究的基本方法，是研究生物遺傳變異、物種演化、分類、遠緣雜交以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間關(guān)系所不可缺少的重要手段。
[0003]染色體標本制備即染色體制片，是以體細胞分裂中期染色體為研究對象，但分裂中期持續(xù)的時間很短，一般僅l(T30min，使中期染色體細胞出現(xiàn)頻率不高。為了克服上述矛盾，常用化學(xué)或物理方法對材料進行預(yù)處理，預(yù)處理是否適宜，關(guān)系染色體制片的成敗?；瘜W(xué)試劑包括秋水仙素、對二氯苯、8-羥基喹啉、α -溴萘等，物理法主要指低溫法。上述化學(xué)藥物可阻止或破壞紡錘體的形成，毒性大，對實驗人員身體有害。而低溫法，預(yù)處理時間長，一次預(yù)處理就要廣3天，而且效果不理想。20世紀中葉，俄國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)笑氣具有阻止微管的形成，可用于植物染色體標本的制備。與常用方法相比，高壓笑氣法有處理時間短、實驗效果好的特點，笑氣相對其它化學(xué)試劑毒性小，也更安全。
[0004]新麥草屬iPsathyrostachysNeNski )是禾本科小麥族的植物,多年生,具根莖或形成密叢。該屬有很多具有重要利用價值的種。例如新麥草，抗寒、抗旱、耐踐踏，是適應(yīng)于溫帶干旱半干旱地區(qū)種植的一種優(yōu)良的放牧性牧草，也可用于退化草地的補播和改良。再如，華山新麥草iP.huashanica ),是農(nóng)作物的野生親緣種,有抗病、抗旱、早熟等優(yōu)良特性，對小麥新品種的研究有重大意義，同時還是國家一類珍稀保護植物和急需保護的農(nóng)作物野生親緣種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效、穩(wěn)定的新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法。
[0006]為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，包括以下步驟:
⑴取材:在一天中任意時間取生長旺盛的盆栽新麥草的新生根1.5^2cm,并將其放入一個敞口的1.5mL或2.0mL的內(nèi)壁附著水分的離心管中；
⑵在2(T27°C條件下，將所述步驟⑴中裝有根尖的離心管置于高壓容器裝置內(nèi)，通入
0.4^0.9MPa N2O進行預(yù)處理，3.5^4.5h后即得預(yù)處理后的新根；
⑶將所述預(yù)處理后的新根用濾紙吸干水分，采用卡諾氏液固定2(T24h，得到固定后的新根；
⑷將所述固定后的新根用蒸餾水漂洗3次，吸干水分后在體積濃度為45%的冰乙酸中解離3~8min，得到解離后的新根；
(5)將所述解離后的新根中的水分吸干后置于載玻片上，用干凈的刀片去掉根尖的最前端的根冠區(qū)0.5^1.5mm，取分生區(qū)0.5^1.5mm的長度，加一滴體積濃度為45%的冰乙酸，蓋上蓋玻片，蓋玻片的一側(cè)墊一薄刀片，用鑷子的基部輕輕敲擊蓋玻片，使組織成為一薄層，取走所述薄刀片，然后在酒精燈的火焰上烘烤至微熱，在所述蓋玻片上加一吸水紙，用拇指擠壓所述蓋玻片使細胞充分分散，得到壓片；
(6)將所述壓片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行照相，以便進行熒光原位雜交，最后用玻璃刀做好蓋玻片位置的標記，將做好的片子放入_80°C的冰箱保存即可。
[0007]所述步驟⑵中預(yù)處理過程是指壓強按恒定值的方式通入N2O進行或壓強按梯度遞增的方式通入N2O進行。
[0008]所述步驟⑶中的卡諾氏液是由無水乙醇與冰醋酸按3mL:l mL的比例混合而成。
[0009]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
1、本發(fā)明采用高壓笑氣對實驗材料進行預(yù)處理，處理效果穩(wěn)定，制片成功率高，較其它常規(guī)方法，取樣時間不受限制，處理時間由幾十小時縮短為幾小時。同時，本發(fā)明預(yù)處理過程所用試劑安全、低毒、對實驗人員身體損害小。
[0010]2、本發(fā)明獲得的染色體樣片經(jīng)鏡檢和顯微檢測，可以發(fā)現(xiàn)染色體形態(tài)好且分散好的細胞比較多(參見圖廣2)，可用于熒光原位雜交實驗，為新麥草資源開發(fā)利用等后續(xù)研究奠定良好基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0012]圖1為本發(fā)明美國地區(qū)的新麥草(A juncea)染色體鏡檢結(jié)果和顯微照相示意圖。
[0013]圖2為本發(fā)明哈薩克斯坦地區(qū)新麥草(A的染色體鏡檢結(jié)果和顯微照相示意圖。
【具體實施方式】
[0014]實施例1 一種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，包括以下步驟:
⑴取材:上午9點取生長旺盛的盆栽美國地區(qū)的新麥草0°.Juncea )的新生根1.5cm,并將其放入一個敞口的1.5mL的內(nèi)壁附著水分的離心管中。
[0015]⑵在20°C條件下，將步驟⑴中裝有根尖的離心管置于高壓容器裝置內(nèi)，先通入
0.4MPa N2O處理1.5h，然后在同一溫度下，再次通入N2O,使其分壓達到0.75MPa，繼續(xù)處理2h50min,即得預(yù)處理后的新根。
[0016]⑶將預(yù)處理后的新根用濾紙吸干水分，采用卡諾氏液固定20h，得到固定后的新根。
[0017]其中:卡諾氏液是由無水乙醇與冰醋酸按3mL:1 mL的比例混合而成。
[0018]⑷將固定后的新根用蒸餾水漂洗3次，吸干水分后在體積濃度為45%的冰乙酸中解離3min，得到解離后的新根。
[0019] (5)將解離后的新根中的水分吸干后置于載玻片上，用干凈的刀片去掉根尖的最前端的根冠區(qū)0.5mm，取分生區(qū)0.5mm的長度，加一滴體積濃度為45%的冰乙酸，蓋上蓋玻片，蓋玻片的一側(cè)墊一薄刀片，用鑷子的基部輕輕敲擊蓋玻片，使組織成為一薄層，取走薄刀片，然后在酒精燈的火焰上烘烤至微熱，在蓋玻片上加一吸水紙，用拇指擠壓蓋玻片使細胞充分分散，得到壓片。
[0020] (6)將壓片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行照相，以便進行熒光原位雜交，鏡檢結(jié)果和顯微照片見圖1。最后用玻璃刀做好蓋玻片位置的標記，將做好的片子放入_80°C的冰箱保存即可。
[0021]實施例2 —種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，包括以下步驟:
⑴取材:下午3:00取生長旺盛的盆栽哈薩克斯坦地區(qū)新麥草0°.juncea)的新生根
1.5cm，并將其放入一個敞口的2.0mL的內(nèi)壁附著水分的離心管中。
[0022]⑵在25°C條件下，將步驟⑴中裝有根尖的離心管置于高壓容器裝置內(nèi)，先通入0.4MPa N2O處理1.5h，然后在同一溫度下，再次通入N2O,使其分壓達到0.8MPa，繼續(xù)處理
2.5h，即得預(yù)處理后的新根。
[0023]⑶將預(yù)處理后的新根用濾紙吸干水分，采用卡諾氏液固定23h，得到固定后的新根。
[0024]其中:卡諾氏液同實施例1。
[0025]⑷將固定后的新根用蒸餾水漂洗3次，吸干水分后在體積濃度為45%的冰乙酸中解離5min，得到解離后的新根。
[0026](5)將解離后的新根中的水分吸干后置于載玻片上，用干凈的刀片去掉根尖的最前端的根冠區(qū)1.2mm，取分生區(qū)Imm的長度，加一滴體積濃度為45%的冰乙酸，蓋上蓋玻片，蓋玻片的一側(cè)墊一薄刀片，用鑷子的基部輕輕敲擊蓋玻片，使組織成為一薄層，取走薄刀片，然后在酒精燈的火焰上烘烤至微熱，在蓋玻片上加一吸水紙，用拇指擠壓蓋玻片使細胞充分分散，得到壓片。
[0027](6)將壓片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行照相，以便進行熒光原位雜交，鏡檢結(jié)果和顯微照片見圖2。最后用玻璃刀做好蓋玻片位置的標記，將做好的片子放入_80°C的冰箱保存即可。
[0028]實施例3 —種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，包括以下步驟:
⑴取材:下午3:00取生長旺盛的盆栽美國地區(qū)新麥草0°.的新生根2cm,并將
其放入一個敞口的2.0mL的內(nèi)壁附著水分的離心管中。
[0029]⑵在26°C條件下，將步驟⑴中裝有根尖的離心管置于高壓容器裝置內(nèi)，先通入0.4MPa N2O處理1.5h，然后在同一溫度下，再次通入N2O,使其分壓達到0.8MPa，繼續(xù)處理
2.5h，即得預(yù)處理后的新根。
[0030]⑶將預(yù)處理后的新根用濾紙吸干水分，采用卡諾氏液固定23h，得到固定后的新根。
[0031]其中:卡諾氏液同實施例1。
[0032]⑷將固定后的新根用蒸餾水漂洗3次，吸干水分后在體積濃度為45%的冰乙酸中解離6min，得到解離后的新根。[0033](5)將解離后的新根中的水分吸干后置于載玻片上，用干凈的刀片去掉根尖的最前端的根冠區(qū)1.5mm，取分生區(qū)1.5mm的長度，加一滴體積濃度為45%的冰乙酸，蓋上蓋玻片，蓋玻片的一側(cè)墊一薄刀片，用鑷子的基部輕輕敲擊蓋玻片，使組織成為一薄層，取走薄刀片，然后在酒精燈的火焰上烘烤至微熱，在蓋玻片上加一吸水紙，用拇指擠壓蓋玻片使細胞充分分散，得到壓片。
[0034](6)將壓片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行照相，以便進行熒光原位雜交，最后用玻璃刀做好蓋玻片位置的標記，將做好的片子放入_80°C的冰箱保存即可。
[0035]實施例4 一種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，包括以下步驟:
⑴取材:下午3:00取生長旺盛的盆栽哈薩克斯坦地區(qū)新麥草0°.juncea)的新生根2cm，并將其放入一個敞口的1.5mL的內(nèi)壁附著水分的離心管中。
[0036]⑵在26°C條件下，將步驟⑴中裝有根尖的離心管置于高壓容器裝置內(nèi)，先通入0.4MPa N2O處理1.5h，然后在同一溫度下，再次通入N2O,使其分壓達到0.8MPa，繼續(xù)處理
2.5h，即得預(yù)處理后的新根。
[0037]⑶將預(yù)處理后的新根用濾紙吸干水分，采用卡諾氏液固定22h，得到固定后的新根。
[0038]其中:卡諾氏液同實施例1。
[0039]⑷將固定后的新根用蒸餾水漂洗3次，吸干水分后在體積濃度為45%的冰乙酸中解離5min，得到解離后的新根。
[0040](5)將解離后的新根中的水分吸干后置于載玻片上，用干凈的刀片去掉根尖的最前端的根冠區(qū)1.3mm，取分生區(qū)Imm的長度，加一滴體積濃度為45%的冰乙酸，蓋上蓋玻片，蓋玻片的一側(cè)墊一薄刀片，用鑷子的基部輕輕敲擊蓋玻片，使組織成為一薄層，取走薄刀片，然后在酒精燈的火焰上烘烤至微熱，在蓋玻片上加一吸水紙，用拇指擠壓蓋玻片使細胞充分分散，得到壓片。
[0041](6)將壓片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行照相，以便進行熒光原位雜交，最后用玻璃刀做好蓋玻片位置的標記，將做好的片子放入_80°C的冰箱保存即可。
[0042]實施例5 —種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，包括以下步驟:
⑴取材:下午3:30取生長旺盛的盆栽美國地區(qū)新麥草0°.的新生根1.8cm,并
將其放入一個敞口的2.0mL的內(nèi)壁附著水分的離心管中。
[0043]⑵在26 °C條件下，將步驟⑴中裝有根尖的離心管置于高壓容器裝置內(nèi)，通入0.85MPa N2O進行預(yù)處理，3.5h后即得預(yù)處理后的新根。
[0044]⑶將預(yù)處理后的新根用濾紙吸干水分，采用卡諾氏液固定23h，得到固定后的新根。
[0045]其中:卡諾氏液同實施例1。
[0046]⑷將固定后的新根用蒸餾水漂洗3次，吸干水分后在體積濃度為45%的冰乙酸中解離5min，得到解離后的新根。[0047](5)將解離后的新根中的水分吸干后置于載玻片上，用干凈的刀片去掉根尖的最前端的根冠區(qū)1mm，取分生區(qū)Imm的長度，加一滴體積濃度為45%的冰乙酸，蓋上蓋玻片，蓋玻片的一側(cè)墊一薄刀片，用鑷子的基部輕輕敲擊蓋玻片，使組織成為一薄層，取走薄刀片，然后在酒精燈的火焰上烘烤至微熱，在蓋玻片上加一吸水紙，用拇指擠壓蓋玻片使細胞充分分散，得到壓片。
[0048](6)將壓片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行照相，以便進行熒光原位雜交，最后用玻璃刀做好蓋玻片位置的標記，將做好的片子放入_80°C的冰箱保存即可。
[0049]實施例6 —種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，包括以下步驟:
⑴取材:在一天中任意時間取生長旺盛的盆栽新麥草的新生根1.5cm,并將其放入一個敞口的1.5mL的內(nèi)壁附著水分的離心管中。
[0050]⑵在20°C條件下，將步驟⑴中裝有根尖的離心管置于高壓容器裝置內(nèi)，通入0.4MPa N2O進行預(yù)處理，4h后即得預(yù)處理后的新根。
[0051]⑶將預(yù)處理后的新根用濾紙吸干水分，采用卡諾氏液固定20h，得到固定后的新根。
[0052]其中:卡諾氏液同實施例1。
[0053]⑷將固定后的新根用蒸餾水漂洗3次，吸干水分后在體積濃度為45%的冰乙酸中解離3min，得到解離后的新根。
[0054](5)將解離后的新根中的水分吸干后置于載玻片上，用干凈的刀片去掉根尖的最前端的根冠區(qū)0.5mm，取分生區(qū)0.5mm的長度，加一滴體積濃度為45%的冰乙酸，蓋上蓋玻片，蓋玻片的一側(cè)墊一薄刀片，用鑷子的基部輕輕敲擊蓋玻片，使組織成為一薄層，取走薄刀片，然后在酒精燈的火焰上烘烤至微熱，在蓋玻片上加一吸水紙，用拇指擠壓蓋玻片使細胞充分分散，得到壓片。
[0055](6)將壓片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行照相，以便進行熒光原位雜交，最后用玻璃刀做好蓋玻片位置的標記，將做好的片子放入_80°C的冰箱保存即可。
[0056]實施例7 —種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，包括以下步驟:
⑴取材:在一天中任意時間取生長旺盛的盆栽新麥草的新生根2cm，并將其放入一個敞口的2.0mL的內(nèi)壁附著水分的離心管中。
[0057]⑵在27°C條件下，將步驟⑴中裝有根尖的離心管置于高壓容器裝置內(nèi)，通入
0.9MPa N2O進行預(yù)處理，4.5h后即得預(yù)處理后的新根。
[0058]⑶將預(yù)處理后的新根用濾紙吸干水分，采用卡諾氏液固定24h，得到固定后的新根。
[0059]其中:卡諾氏液同實施例1。
[0060]⑷將固定后的新根用蒸餾水漂洗3次，吸干水分后在體積濃度為45%的冰乙酸中解離8min，得到解離后的新根。
[0061] (5)將解離后的新根中的水分吸干后置于載玻片上，用干凈的刀片去掉根尖的最前端的根冠區(qū)1.5mm，取分生區(qū)1.5mm的長度，加一滴體積濃度為45%的冰乙酸，蓋上蓋玻片，蓋玻片的一側(cè)墊一薄刀片，用鑷子的基部輕輕敲擊蓋玻片，使組織成為一薄層，取走薄刀片，然后在酒精燈的火焰上烘烤至微熱，在蓋玻片上加一吸水紙，用拇指擠壓蓋玻片使細胞充分分散，得到壓片。
[0062](6)將壓片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行照相，以便進行熒光原位雜交，最后用玻璃刀做好蓋玻片位置的標記，將做好的片子放入_80°C的冰箱保存即可。
[0063]上述實施例廣7中的用于預(yù)處理的高壓容器裝置是指中國科學(xué)院西北高原生物研究所研發(fā)的專利號為ZL201320543644.6的用于植物染色體制備預(yù)處理的自動計時控溫
控壓裝置。
【權(quán)利要求】
1.一種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，包括以下步驟: ⑴取材:在一天中任意時間取生長旺盛的盆栽新麥草的新生根1.5~2cm，并將其放入一個敞口的1.5mL或2.0mL的內(nèi)壁附著水分的離心管中； ⑵在2(T27°C條件下，將所述步驟⑴中裝有根尖的離心管置于高壓容器裝置內(nèi)，通入0.4^0.9MPa N2O進行預(yù)處理，3.5^4.5h后即得預(yù)處理后的新根； ⑶將所述預(yù)處理后的新根用濾紙吸干水分，采用卡諾氏液固定2(T24h，得到固定后的新根； ⑷將所述固定后的新根用蒸餾水漂洗3次，吸干水分后在體積濃度為45%的冰乙酸中解離3~8min，得到解離后的新根； (5)將所述解離后的新根中的水分吸干后置于載玻片上，用干凈的刀片去掉根尖的最前端的根冠區(qū)0.5^1.5mm，取分生區(qū)0.5^1.5mm的長度，加一滴體積濃度為45%的冰乙酸，蓋上蓋玻片，蓋玻片的一側(cè)墊一薄刀片，用鑷子的基部輕輕敲擊蓋玻片，使組織成為一薄層，取走所述薄刀片，然后在酒精燈的火焰上烘烤至微熱，在所述蓋玻片上加一吸水紙，用拇指擠壓所述蓋玻片使細胞充分分散，得到壓片； (6)將所述壓片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行照相，以便進行熒光原位雜交，最后用玻璃刀做好蓋玻片位置的標記，將做好的片子放入_80°C的冰箱保存即可。
2.如權(quán)利要求1所述的一種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，其特征在于:所述步驟⑵中預(yù)處理過程是指壓強按恒定值的方式通入N2O進行或壓強按梯度遞增的方式通入N2O進行。
3.如權(quán)利要求1所述的一種新麥草屬植物細胞染色體中期分裂相標本制備方法，其特征在于:所述步驟⑶中的卡諾氏液是由無水乙醇與冰醋酸按3mL:1 mL的比例混合而成。
【文檔編號】C12Q1/68GK103993095SQ201410252230
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】蔡振媛, 李媛, 張毓, 喻鳳, 劉瑞娟, 林麗 申請人:中國科學(xué)院西北高原生物研究所