與大豆籽粒硬脂酸含量相關(guān)的緊密連鎖標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與大豆籽粒硬脂酸含量相關(guān)的緊密連鎖標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明公開的一對(duì)引物，該對(duì)引物由SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示的DNA分子組成。本發(fā)明公開的連鎖標(biāo)記可以應(yīng)用于評(píng)價(jià)大豆籽粒中硬脂酸含量及大豆選育。
【專利說明】與大豆籽粒硬脂酸含量相關(guān)的緊密連鎖標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分子標(biāo)記及其應(yīng)用；特別涉及一種與大豆籽粒硬脂酸含量相關(guān)的緊密連鎖標(biāo)記及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆油占世界植物油的30%，它主要包含有五種脂肪酸:軟脂酸約占11%左右，硬脂酸約占4%左右，油酸約占24%左右，亞油酸約占54%左右，亞麻酸約占7%左右。雖然軟脂酸和硬脂酸都是飽和脂肪酸，但硬脂酸并不同于軟脂酸，有研究證明硬脂酸可以降低血液中總的膽固醇水平，益于人類健康，并且可以不用氫化直接生產(chǎn)人造奶油、潤(rùn)滑劑，油墨和生物石油等。因此增加大豆飽和脂肪酸含量以滿足用油加工的需要將是一個(gè)重要的育種目標(biāo)。
[0003]近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)大豆硬脂酸的研究日漸增多，Spencer等(2003)用Dare xFAM94-41雜交的F2:3分離群體鑒定出連鎖群B2上和硬脂酸高度相關(guān)的3個(gè)SSR標(biāo)記Satt556, Satt474, Satt070 ；Xianzhi Wang 等利用 SD02-4-59 和 A02-381100 雜交的重組自交系F5，運(yùn)用CM和頂方法定位到5個(gè)和硬脂酸高度相關(guān)的標(biāo)記:BARC-041257-07953、BARC-029787-06340、Satt252、Sat_064、BARC-014699-01621 ;苗興芬等在多種環(huán)境下檢測(cè)到6個(gè)和硬脂酸有關(guān)的位點(diǎn)等，開發(fā)新的與大豆籽粒硬脂酸含量相關(guān)的緊密連鎖標(biāo)記對(duì)評(píng)價(jià)大豆籽粒中硬脂酸含量以及大豆育種具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種與大豆籽粒硬脂酸含量相關(guān)的緊密連鎖標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供一對(duì)引物，該對(duì)引物由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子組成。
[0006]一種分子標(biāo)記也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該分子標(biāo)記是以植物組織的基因組DNA為模板，以所述的引物對(duì)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段。
[0007]上述分子標(biāo)記中，所述植物為大豆；
[0008]所述組織具體為葉片；
[0009]所述大豆具體為冀豆12號(hào)和/或黑豆。
[0010]所述黑豆為黑豆(ZDD03651)。
[0011]一種評(píng)價(jià)待測(cè)大豆的籽粒硬脂酸含量高低的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，，包括如下步驟:以待測(cè)大豆組織的基因組DNA為模板，以所述的引物對(duì)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在140-155bp之間的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小分別在140-155bp之間的片段和在160-170bp之間的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小分別在140-155bp之間的片段和在160_170bp之間的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在160-170bp之間的大豆的籽粒硬脂酸含量。[0012]上述方法中，所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在140_155bp之間的片段，與以冀豆12號(hào)組織的基因組DNA為模板，以所述的引物對(duì)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段一致；
[0013]所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在160-170bp之間的片段，與以黑豆ZDD03651組織的基因組DNA為模板，以所述的引物對(duì)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段一致。
[0014]上述任一所述的方法中，所述組織為葉片。
[0015]上述任一所述的方法中，所述待測(cè)大豆為冀豆12號(hào)和黑豆ZDD03651的雜交后代。
[0016]上述任一所述的方法中，所述冀豆12號(hào)為母本；
[0017]所述黑豆ZDD03651為父本；
[0018]所述雜交后代為Fl代和/或Fl代自交得到的F2代和/或F2代連續(xù)自交得到的后代。
[0019]上述引物對(duì)、上述任一所述的分子標(biāo)記在評(píng)價(jià)大豆籽粒的硬脂酸含量高低中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]上述引物對(duì)、上述任一所 述的分子標(biāo)記在大豆選育中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021]上述任一所述的應(yīng)用中，所述大豆為冀豆12號(hào)和黑豆的雜交后代；
[0022]所述冀豆12號(hào)具體為母本；
[0023]所述黑豆具體為父本；
[0024]所述黑豆具體為黑豆(ZDD03651)；
[0025]所述雜交后代為Fl代和/或Fl代自交得到的F2代和/或F2代連續(xù)自交得到的后代。
[0026]本發(fā)明提供的連鎖標(biāo)記可以應(yīng)用于評(píng)價(jià)大豆籽粒中硬脂酸含量及大豆選育。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為群體1、群體II以及兩親本的籽粒硬脂酸含量的表型分布。
[0028]圖2為satt556附近的5個(gè)標(biāo)記間遺傳連鎖圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0030]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031]冀豆12號(hào)(Glycine max(L.)Merr)在文獻(xiàn)“陳強(qiáng)等.冀豆12遺傳背景下3個(gè)回交組合高低蛋白含量后代品系SSR標(biāo)記分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47 (2): 230-239”中公開過，公眾可從河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所獲得。
[0032]黑豆(ZDD03651)(Glycine soja Sieb.Et Zucc.)在文獻(xiàn)“雷雅坤.大豆五種脂肪酸含量遺傳分析與QTL定位[D].石家莊:河北師范大學(xué)，2012.”中公開過，公眾可從河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所獲得。
[0033]實(shí)施例1、大豆籽粒硬脂酸含量檢測(cè)方法
[0034]將待檢大豆樣品用研磨儀充分研磨，磨好后取0.1g豆粉放入2.0mL離心管中，加ImL脂肪提取液(苯:石油醚體積比1: 1，混勻)，振蕩混勻60min，離心后取上清，加1.5mL的0.4mol/L甲醇鉀(IOmL甲醇中加入0.2g氫氧化鉀)甲酯化，靜置60min，加5ml蒸餾水，使樣品分層。吸取2 μ L最上層油份萃取物進(jìn)行氣相色譜分析(采用安捷倫6890Ν氣相色譜儀)。
[0035]色譜條件:FID檢測(cè)器，F(xiàn)FAP彈性石英毛細(xì)管柱，恒壓的模式，載氣:高純氮?dú)饬魉?lmL/min ;H2 流速:35mL/min ;空氣流速:350mL/min。進(jìn)樣量:2yL。分流比:10:1,進(jìn)樣口的溫度:250°C。檢測(cè)器的溫度:250°C。程序溫:180°C，3min，9°C /min升到225°C /min,保持 25min。
[0036]通過氣相色譜計(jì)算檢測(cè)的硬脂酸占總脂肪酸的含量，最終得到待檢大豆籽?？傊舅嶂械挠仓岷俊?br> [0037]實(shí)施例2、與大豆籽粒硬脂酸含量相關(guān)的緊密連鎖標(biāo)記的篩選
[0038]一、群體的構(gòu)建
[0039]以冀豆12號(hào)(Glycine max(L.)Merr)為母本，地方半野生品種黑豆(ZDD03651)(Glycine soja Sieb.Et Zucc.)為父本雜交，在初定位的基礎(chǔ)上，選擇與硬脂酸含量緊密連鎖標(biāo)記satt556附近的3個(gè)標(biāo)記(satt474、sct_094、satt556)在其衍生的F2:6代次級(jí)群體中進(jìn)行掃描，篩選出3個(gè)標(biāo)記均雜合的剩余雜合體，將其衍生的85個(gè)單株組成RHL (剩余雜合系)。
[0040]2012年6月將RHL播種于石家莊堤上試驗(yàn)站，篩選3個(gè)標(biāo)記均雜合的單株I株。2012年11月該單株200粒種子衍生成次級(jí)群體I，采用單粒點(diǎn)播種植于三亞試驗(yàn)站，單株收獲。2013年6月從群體I每株的種子中取一粒種子衍生成次級(jí)群體II，單粒播種于石家莊堤上試驗(yàn)站，單株收 獲。
[0041]二、DNA的提取及SSR引物的篩選
[0042]在田間采集次級(jí)群體I和次級(jí)群體II的單株苗期第4周的第三片復(fù)葉，采用SDS 法提取 DNA。參照文獻(xiàn)“Song QJ, Jia GF, Zhu YL, Grant D, Nelson RT, Hwang EY, HytenDL, Cregan PB (2010) Abundance of SSR motifs and development of candidate polymorphicSSR markers(BARCS0YSSR_1.0)in soybean.Crop Sci50:1950 - 1960.Cregan, P.B.，T.Jarvik, A.L.Bush, R.C.Shoemaker, K.G.Lark, A.L.Kahler, N.Kaya, T.T.VanToai, D.G.Lohnes, J.Chung, and J.E.Specht.1999.An integrated genetic linkage map of thesoybean.Crop Sc1.39:1464 - 1490”公開的標(biāo)記，從中選擇48個(gè)在satt556附近的標(biāo)記，篩選出3個(gè)在母本和父本中有差異的SSR引物,并根據(jù)Soybase網(wǎng)站(http://soybase.0rg/)提供的大豆SSR序列合成擴(kuò)增相應(yīng)標(biāo)記的引物。
[0043]三、帶型檢測(cè)
[0044]分別以步驟二提取的DNA為模板，以各SSR引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行相應(yīng)分子標(biāo)記帶型檢測(cè)，將所得的帶型記作帶型X ;以冀豆12 (母本)的DNA為模板，以相應(yīng)的SSR引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行相應(yīng)分子標(biāo)記帶型檢測(cè)，將所得的帶型記作帶型A ;以黑豆(父本)的DNA為模板，以相應(yīng)的SSR引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行相應(yīng)分子標(biāo)記帶型檢測(cè)，將所得的帶型記作帶型B ；X有三種情形，第一種為X與A —致，第二種為X與B —致，第三種為X為既含有A，又含有B的雜合帶型，將此雜合帶型記作帶型H。
[0045]其中5個(gè)標(biāo)記的引物如表1所示。
[0046]其中Barcsoyssr_14_1033的上游引物如SEQ ID N0.3所示，下游引物如SEQ IDN0.4所示。
[0047]當(dāng)所用的SSR引物為Barcsoyssr_14_1033標(biāo)記的引物時(shí)，A帶型的大小在140-155bp之間，B帶型的大小在160-170bp之間，H帶型的大小分別在140_155bp和160-170bp 之間。
[0048]表1引物序列表
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一對(duì)引物，該對(duì)引物由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子組成。
2.一種分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記是以植物組織的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1所述的引物對(duì)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記，其特征在于:所述植物為大豆； 所述組織具體為葉片； 所述大豆具體為冀豆12號(hào)和/或黑豆。
4.一種評(píng)價(jià)待測(cè)大豆的籽粒硬脂酸含量高低的方法，包括如下步驟:以待測(cè)大豆組織的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1所述的引物對(duì)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在140-155bp之間的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小分別在140-155bp之間的片段和在160-170bp之間的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小分別在140-155bp 之間的片段和在160-170bp之間的片段的大豆的籽粒硬脂酸含量高于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在160-170bp之間的大豆的籽粒硬脂酸含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在140-155bp之間的片段，與以冀豆12號(hào)組織的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1所述的引物對(duì)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段一致； 所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在160-170bp之間的片段，與以黑豆ZDD03651組織的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1所述的引物對(duì)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段一致。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述組織為葉片。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一所述的方法，其特征在于:所述待測(cè)大豆為冀豆12號(hào)和黑豆ZDD03651的雜交后代。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一所述的方法，其特征在于:所述冀豆12號(hào)為母本； 所述黑豆ZDD03651為父本。
9.權(quán)利要求1所述的引物對(duì)、權(quán)利要求2或3所述的分子標(biāo)記在評(píng)價(jià)大豆籽粒的硬脂酸含量高低中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的引物對(duì)、權(quán)利要求2或3所述的分子標(biāo)記在大豆選育中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104004757SQ201410251971
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】張孟臣, 鄧瑩瑩, 張梅申, 雷雅坤, 楊春燕, 閆龍, 東方陽, 喬亞科 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所, 河北科技師范學(xué)院