專利名稱：蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因轉(zhuǎn)化方法，具體地說是海洋蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物基因的遺傳轉(zhuǎn)化是指將外源DNA通過載體、媒體或其他物理、化學(xué)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞并得到整合和表達(dá)的過程。這些外源基因的受體都是細(xì)胞，由此需要借助一系列特殊的轉(zhuǎn)化手段來完成外源基因進(jìn)入細(xì)胞。目前已經(jīng)建立了十余種基因轉(zhuǎn)化方法，這些轉(zhuǎn)化系統(tǒng)所采用的方法都有或多或少的缺點(diǎn)(如表1所示)。
表1幾種主要植物基因轉(zhuǎn)化方法特點(diǎn)比較

蘚羽藻是一種多核單細(xì)胞的海洋綠藻。它的全能性不同于高等植物細(xì)胞的全能性，在沒有細(xì)胞膜和壁的情況下，蘚羽藻細(xì)胞內(nèi)的部分原生質(zhì)體就能團(tuán)聚，這些團(tuán)聚體在幾小時(shí)內(nèi)就可以形成新的膜和壁，并在數(shù)周內(nèi)發(fā)育成成熟的新個(gè)體。

發(fā)明內(nèi)容
就是克服上述轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供海洋蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，使轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化方法融為一體，過程簡單方便，是簡單高效的轉(zhuǎn)化方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)前，將蘚羽藻洗凈，吸凈(用吸水紙)蘚羽藻表面的水分，分離原生質(zhì)體，同時(shí)，加入外源基因，在緩沖液中使之團(tuán)聚在一起，形成團(tuán)聚體；所述外源基因應(yīng)為攜帶啟動(dòng)子的外源基因；所述蘚羽藻在分離原生質(zhì)體前培養(yǎng)4天到10天，培養(yǎng)條件為在海水或含0.1M NaNO3和0.1M的NH3H2PO4的富營養(yǎng)海水中，光照∶黑暗＝12～16h∶8～12h，光照強(qiáng)度15～80μmolm-2s-1；團(tuán)聚體的培養(yǎng)條件一般與野生蘚羽藻的培養(yǎng)條件相同即可。
可進(jìn)行應(yīng)用的外源基因的種類理論上，只要是自己攜帶啟動(dòng)子的外源基因都有機(jī)會(huì)在團(tuán)聚體內(nèi)表達(dá)。這種轉(zhuǎn)化形式類似于基因槍的轉(zhuǎn)化作用，但它比基因槍更精確，同時(shí)要比基因槍便宜地多；所述外源基因可以為phrGFP-1、plRES-hrGFP-1a、phrGFP-C或phrGFP。
緩沖液的種類緩沖液的作用是用來防止原生質(zhì)體團(tuán)聚前酶和氧對細(xì)胞器和外源DNA的損害作用。團(tuán)聚時(shí)使用的緩沖液并沒有固定的類別，但一定要注意兩個(gè)問題，一是PH值，范圍在6-8之間；另一個(gè)是注意緩沖液的滲透壓要和(蘚羽藻生活或培養(yǎng)的)海水的滲透壓相一致，避免細(xì)胞器膨脹或者物質(zhì)外滲。下面是我們采用的幾種緩沖液1)0.1M的磷酸鉀緩沖液(0.1mM EDTA，5mM巰基乙醇，pH6.6-7.1)；2)0.45M山梨糖醇，50mM Tris，5mM EDTA，0.2％BSA，1％聚乙烯吡咯烷酮，0.025％精胺，0.025％亞精胺，and 1mL β-巰基乙醇，pH 7.0；3)400mM蔗糖，50mM Tris，20mM EDTA-Na2，0.2％小牛血清蛋白，0.2％β-巰基乙醇，pH 6.5。
團(tuán)聚體的培養(yǎng)條件培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液均高壓滅菌。原生質(zhì)體團(tuán)聚后有一個(gè)生成膜和壁的過程，它們的形成時(shí)間分別約為6小時(shí)和12小時(shí)，而且團(tuán)聚體有貼壁的特點(diǎn)，所以在挪動(dòng)和換水時(shí)不要改變團(tuán)聚體原來的位置，在換培養(yǎng)液時(shí)可以用注射器吸水加水，加水時(shí)要注意貼壁緩慢進(jìn)行。培養(yǎng)液不能添加過多，以4mm高度為宜。團(tuán)聚體有較強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境的能力，溫度在10-30℃均可，15℃-20℃左右最好，但要注意溫度保持相對恒定，所以要在恒溫?zé)o菌的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。團(tuán)聚體培養(yǎng)要注意避免強(qiáng)光，光強(qiáng)在15-80μmolm-2s-1范圍都可以，隨著團(tuán)聚體的發(fā)育逐漸增加光強(qiáng)增大培養(yǎng)液體積。團(tuán)聚體延伸后最好轉(zhuǎn)移到藍(lán)光下進(jìn)行培養(yǎng)，因?yàn)樗{(lán)光更加接近海水中的光質(zhì)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.轉(zhuǎn)化過程簡單。本發(fā)明轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化方法融為一體，過程簡單方便，轉(zhuǎn)化效率高，組培條件簡單，外源基因接受范圍廣，并且可以在較短時(shí)間內(nèi)表達(dá)外源基因。帶有外源基因的原生質(zhì)體再生植株生命活力強(qiáng)，繁殖能力高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，從原生質(zhì)體到團(tuán)聚體只需要2分鐘時(shí)間，從團(tuán)聚體到具有完整的膜和壁的再生細(xì)胞在10小時(shí)內(nèi)就可以完成，從團(tuán)聚體到具有有性再生能力的植株只需要7周的時(shí)間，而且從再生植株產(chǎn)生足夠的原生質(zhì)體起，就可以再利用其原生質(zhì)體進(jìn)行擴(kuò)繁。葉狀體的剪段培養(yǎng)更是增殖轉(zhuǎn)基因植株的有效方式。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，葉狀體片段平均每天可以生長33毫米，無論是原生質(zhì)體再生植株還是葉狀體片段再生植株，它們的生物量都要比野生植株的大得多，而且它們的繁殖能力更強(qiáng)。
2.本受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率高，外源基因產(chǎn)物量大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在8小時(shí)的轉(zhuǎn)化率為15.3％，72后的轉(zhuǎn)化率可增至21％。由于蘚羽藻為多核的單細(xì)胞藻，同一細(xì)胞內(nèi)的有大量的基因組DNA，DAIPI染色可以看出，一個(gè)亞細(xì)胞中就有數(shù)個(gè)核，加之羽藻的增殖速度快，從而產(chǎn)生大量的外源基因產(chǎn)物。
3.成本低。原生質(zhì)體團(tuán)聚體受體系統(tǒng)的建立耗費(fèi)低廉，設(shè)備要求低；蘚羽藻的原生質(zhì)體在有限空間和時(shí)間內(nèi)可以產(chǎn)生較大量的外源基因受體，組織培養(yǎng)條件要求低。本發(fā)明外源基因表達(dá)系統(tǒng)的材料較容易獲得。蘚羽藻在整個(gè)中國的海域都有分布，在我國南方海域可以常年在高低潮之間采到蘚羽藻；在北方秋冬季節(jié)也可以采到蘚羽藻。蘚羽藻葉狀體可以剪段培養(yǎng)，因此即使從野外采集不到新鮮的材料，也可以通過組培的方法獲得一定的生物量。
4.應(yīng)用效果好。實(shí)驗(yàn)證明，在原生質(zhì)體團(tuán)聚前加入帶有啟動(dòng)子的外源基因，這些外源基因可以能夠高效地進(jìn)入原生質(zhì)體的團(tuán)聚體內(nèi)，并在團(tuán)聚體內(nèi)表達(dá)；這些帶有外源基因的原生質(zhì)體團(tuán)聚體在一定條件下能夠發(fā)育為正常植株。因此，蘚羽藻的原生質(zhì)體團(tuán)聚體可以成為一個(gè)全新的外源基因受體與表達(dá)系統(tǒng)。單株蘚羽藻的原生質(zhì)體就能產(chǎn)生上千個(gè)團(tuán)聚體，而且團(tuán)聚體有較高的存活率。Kim(2001)實(shí)驗(yàn)證明團(tuán)聚體的平均存活率可達(dá)40％。在實(shí)驗(yàn)中，我們培養(yǎng)原生質(zhì)體的存活率為15％。


圖1為自然界中的蘚羽藻圖片；(其為棲息在高低潮之間海域的野生蘚羽藻配子體；在北方廣大海域，7月份后出現(xiàn)羽藻配子體，10月份后其生物量達(dá)到最大，12月份后氣溫降至0℃以后，逐漸死亡消失。但在部分溫暖的海域，如一些較大工廠溫水的排水口仍然可以發(fā)現(xiàn)少量能夠越冬的蘚羽藻配子體。)圖2為蘚羽藻原生質(zhì)體團(tuán)聚體的發(fā)育過程的顯微照片；(其為蘚羽藻原生質(zhì)體團(tuán)聚萌發(fā)并發(fā)育成成熟的個(gè)體，表示原生質(zhì)體可以團(tuán)聚并發(fā)育成成熟的個(gè)體，再生藻株的生物量比野生藻株的要大；擠出的原生質(zhì)體在培養(yǎng)液中2分鐘就可以團(tuán)聚成球狀體，30分鐘內(nèi)形成糖-脂膜，6小時(shí)內(nèi)形成脂質(zhì)的膜，12小時(shí)內(nèi)形成由木糖和果膠質(zhì)組成的細(xì)胞壁。這些團(tuán)聚體的成活率為15％左右。3日后，團(tuán)聚體開始萌發(fā)。其中A和B為第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，C和D為第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A為72小時(shí)時(shí)團(tuán)聚體萌發(fā)的情況，A中有一些團(tuán)聚體仍然沒有萌發(fā)。萌發(fā)后的再生植株生長速度相當(dāng)快，每天達(dá)到33毫米；B為培養(yǎng)原生質(zhì)體27天時(shí)的情況。C為團(tuán)聚12小時(shí)時(shí)的情況，有些團(tuán)聚體已經(jīng)開始拉長；D為團(tuán)聚后第10天的生長狀況。)圖3為蘚羽藻葉狀體片段的再生圖片；(其為蘚羽藻葉狀體剪段培養(yǎng)的結(jié)果；其中A是取出的一根單獨(dú)的藻絲，有較長的葉狀體，也有少量的假根；B是將藻絲按順序剪成3段；C是剪段培養(yǎng)后第二天的情況，可以看出，每段都有假根長出，而且葉狀體的生長量也較大；D是一周后的剪段培養(yǎng)情況，從圖可以看出，每一段葉狀體都長出大量的假根，新的葉狀體因?yàn)樯L量較大而在培養(yǎng)皿邊緣彎曲。)圖4為外源基因(phrGFP-1)在蘚羽藻原生質(zhì)體團(tuán)聚體中的表達(dá)的熒光顯微照片。(其中A為團(tuán)聚0.5小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察外源基因表達(dá)的情況，其中大約有15的團(tuán)聚體有熒光發(fā)出；B為對照，團(tuán)聚前沒有加入外源基因，沒有團(tuán)聚體從團(tuán)聚體中發(fā)出；C和D是團(tuán)聚初期較早發(fā)光的團(tuán)聚體。)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1操作步驟和過程如下外源基因的表達(dá)于海濱的高低潮之間采集蘚羽藻※，挑選干凈完整的藻株，挑選好的藻株用大量的煮沸過的海水沖洗，盡可能除去表面的雜質(zhì)、蟲子和卵。然后將蘚羽藻在培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)一周，培養(yǎng)條件為富營養(yǎng)海水(煮沸的天然海水中加入0.1M NaNO3和0.1M的NH3H2PO4)，光照∶黑暗＝16∶8，光照(～20μmolm-2s-1)由日光燈提供，20℃，每24小時(shí)更換一次培養(yǎng)液，更換時(shí)注意清洗羽藻和去處破裂的藻株。
挑選完整潔凈的藻株，在解剖鏡下用去除雜藻和其它雜質(zhì)，用0.3％的KMnO4消毒5分鐘，然后用大量高壓滅菌海水沖洗數(shù)次。再用大量高壓滅菌純水快速?zèng)_洗蘚羽藻，去處表面離子，馬上用吸水紙吸干表面水分。將藻株剪段后用8層紗布濾出原生質(zhì)體于1.5ml eppendorf管中(使用器具均高壓滅菌)。按15-20ng/ml原生質(zhì)體的比例加入外源基因-未經(jīng)RNA酶處理的phrGFP-1(Stratagene)載體DNA，并在0.1M的磷酸鉀緩沖液(0.1mMEDTA，5mM巰基乙醇，pH 6.6-7.1)中，25℃下處理20分鐘，使之團(tuán)聚在一起。將管中的緩沖液倒入培養(yǎng)皿(r＝30mm，h＝10mm)中，用注射器吸出緩沖液，加入滅菌的海水，再吸出海水，重復(fù)多次，除去緩沖液成分，然后加入滅菌海水培養(yǎng)團(tuán)聚體。團(tuán)聚體的培養(yǎng)條件同上述野生蘚羽藻的培養(yǎng)條件。萬能熒光顯微鏡紫外光(380nm)觀察外源基因表達(dá)情況(如圖4所示)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在8小時(shí)的轉(zhuǎn)化率為15.3％，72后的轉(zhuǎn)化率可增至21％。最終發(fā)育成熟的個(gè)體占團(tuán)聚體總數(shù)的15％，其中1.72％的植株攜帶外源基因phrGFP-1。
實(shí)施例2-4與實(shí)施例1不同之處在于，外源基因分別為熒光蛋白報(bào)告基因plRES-hrGFP-1a，phrGFP-C和phrGFP，它們在團(tuán)聚體初期的表達(dá)率為0.2％，1.9％和0.07；熒光素酶表達(dá)基因pGL2-Promoter和pGL2-Bisc(采用TD20/20熒光發(fā)光計(jì)檢測)，初期表達(dá)率為0.06％，0.01％。攜帶外源基因的藻株正在培養(yǎng)中。
權(quán)利要求
1.蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述的蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于將蘚羽藻洗凈，吸凈蘚羽藻表面的水分，分離原生質(zhì)體，同時(shí)，加入外源基因，在緩沖液中使之團(tuán)聚在一起，形成團(tuán)聚體。
3.按照權(quán)利要求1所述的蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于所述外源基因?yàn)閿y帶啟動(dòng)子的外源基因。
4.按照權(quán)利要求2所述的蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于所述蘚羽藻在分離原生質(zhì)體前培養(yǎng)4-10天，培養(yǎng)條件為含0.1M NaNO3和0.1M的NH3H2PO4的富營養(yǎng)海水中，光照∶黑暗＝12-16h∶8-12h，光照強(qiáng)度10～100μmolm-2s-1。
5.按照權(quán)利要求2所述的蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于團(tuán)聚體的培養(yǎng)條件與野生蘚羽藻的培養(yǎng)條件相同。
6.按照權(quán)利要求2所述的蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于所述緩沖液PH值為6-8，滲透壓與蘚羽藻生活的海水的滲透壓相一致。
7.按照權(quán)利要求2所述的蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于所述緩沖液含0.1mM EDTA、5mM巰基乙醇的0.1M的磷酸鉀緩沖液，pH6.6-7.1；0.45M山梨糖醇，50mM Tris，5mMEDTA，0.2％BSA，1％聚乙烯吡咯烷酮，0.025％精胺，0.025％亞精胺，和1mL β-巰基乙醇，pH7.0；或400mM蔗糖，50mM Tris，20mM EDTA-Na2，0.2％小牛血清蛋白，0.2％β-巰基乙醇，pH6.5。
8.按照權(quán)利要求2所述的蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于所述外源基因?yàn)閜hrGFP-1、plRES-hrGFP-1a、phrGFP-C或phrGFP。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因轉(zhuǎn)化方法，具體地說是蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體作為外源基因的受體表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化方法融為一體，過程簡單方便，轉(zhuǎn)化效率高，組培條件簡單，外源基因接受范圍廣、產(chǎn)物量大，并且可以在較短時(shí)間內(nèi)表達(dá)外源基因，成本低，應(yīng)用效果好。
文檔編號C12N1/13GK1673345SQ20041002148
公開日2005年9月28日 申請日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者王廣策, 葉乃好, 曾呈奎 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所