保健品制備用殼聚糖-多肽復(fù)合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于保健食品【技術(shù)領(lǐng)域】的一種保健品制備用殼聚糖-多肽復(fù)合物及其制備方法。該殼聚糖-多肽復(fù)合物是通過將功能性多肽，谷胱甘肽或RoY，通過共價(jià)鍵連接到殼聚糖大分子上而形成。其中，氯化殼聚糖-谷胱甘肽具有良好的抗氧化特性，氯化殼聚糖-RoY具有促進(jìn)血管形成，改善血液循環(huán)的作用。同時(shí)這兩種復(fù)合物都具有調(diào)節(jié)人體pH值，改變酸性體質(zhì)，增強(qiáng)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，激活荷爾蒙作用；排除體內(nèi)重金屬，排除體內(nèi)農(nóng)藥毒素，排除體內(nèi)過剩的營(yíng)養(yǎng)的功效；可以作為保健品的主要成分。
【專利說明】保健品制備用殼聚糖-多肽復(fù)合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于保健食品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種保健品制備用殼聚糖-多肽復(fù)合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氧化是肌膚衰老和器官衰竭的最大威脅，日曬、壓力、環(huán)境污染等都能讓肌膚自由基泛濫，從而產(chǎn)生面色黯淡、缺水等氧化現(xiàn)象。都是身體產(chǎn)生氧化的“罪魁禍?zhǔn)住薄Ｑa(bǔ)充抗氧化物質(zhì)有利于運(yùn)動(dòng)機(jī)體減少自由基的產(chǎn)生或加速其清除，以對(duì)抗自由基的副作用，延緩器官的衰老。殼聚糖其分子鏈上帶有大量的氨基、羥基等活性基團(tuán)，具有良好的生物相容性和降解性能。具有良好的抗氧化性，已經(jīng)廣泛地被人們接受為“第六元素”，它是純天然最新一代機(jī)能性保健食品。但是，其在性條件下溶解性比較差，人體對(duì)其吸收性較差，導(dǎo)致功效難以發(fā)揮。為此，在殼聚糖分子鏈上引入特征官能基團(tuán)，破壞其分子間較強(qiáng)的作用力，增加其溶解性，改善其吸收性能。
[0003]人體中，含有巰基的谷胱甘肽(GSH)在抗氧化中其非常關(guān)鍵的作用，不僅參與了細(xì)胞抗氧化反應(yīng)、維持機(jī)體的氧化還原平衡，還參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、機(jī)體免疫應(yīng)答以及在神經(jīng)系統(tǒng)中充當(dāng)神經(jīng)調(diào)質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)的作用。此外，GSH還具有清除體內(nèi)毒素的作用，也是它是純天然最新一代機(jī)能性保健食品。RoY(多肽序列:YPHIDSLGHWRR)是一種新型的多妝,B.Hardy 等(Eur J Vasc Endovasc Surg(2010)40, 381-388)研究發(fā)現(xiàn) RoY 能在體內(nèi)微血管的形成，對(duì)血管類疾病的治療和防止具有重要的作用。RoY能夠促進(jìn)可在氧化應(yīng)激條件下促進(jìn)血管的形成，促進(jìn)血液循環(huán)，是抗氧化類保健品的有益補(bǔ)充。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種保健品制備用殼聚糖-多肽復(fù)合物。
[0005]本發(fā)明的目的還在于提供上述保健品制備用殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備方法。
[0006]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種用于制備保健品的殼聚糖-多肽復(fù)合物，該復(fù)合物由殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物、殼聚糖-RoY復(fù)合物單獨(dú)或者混合組成，混合時(shí)兩者的質(zhì)量比為20:80到60:40 ;所述殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物或殼聚糖-RoY復(fù)合物中的殼聚糖為氯化殼聚糖、羧甲基殼聚糖、磺酸化殼聚糖或磷酸化殼聚糖。
[0008]所述殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物的取代度為1-45%。
[0009]所述殼聚糖-RoY復(fù)合物的取代度為1-10%。
[0010]上述的殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
[0011]a.殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物的制備；
[0012](I)將殼聚糖溶于去離子水中，配制質(zhì)量濃度為I %的殼聚糖溶液；
[0013](2)將α -馬來酰亞胺-ω -琥珀酰亞胺酯基聚乙二醇(MAL_PEG_NHS)溶于PBS溶液中，配置質(zhì)量濃度為5%的α -馬來酰亞胺- ω-琥珀酰亞胺酯基聚乙二醇溶液；[0014](3)將步驟(I)和步驟(2)獲得的溶液按照體積比1:0.1-1混合攪拌，室溫反應(yīng)2-4小時(shí)；將混合溶液超濾后，用PBS復(fù)溶，形成質(zhì)量濃度為1-1.5%的反應(yīng)混合物溶液，備用；
[0015](4)將谷胱甘肽溶于去離子水形成質(zhì)量濃度為I % -3 %的谷胱甘肽溶液；
[0016](5)將步驟(4)獲得的溶液加入步驟(3)制備的溶液中，兩者的體積比為1-5:10，混合攪拌12_24h后，將混合液體裝入透析袋中透析48-96小時(shí)，冷凍干燥獲得殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物；
[0017]b.殼聚糖-RoY復(fù)合物的制備:
[0018](I)將殼聚糖溶于去離子水，配制質(zhì)量濃度為I %的殼聚糖溶液；
[0019](2)將RoY多肽溶于去離子水中配制質(zhì)量濃度為0.3-1%的RoY溶液；
[0020](3)將羥基琥珀酰亞胺加入步驟(2)制備的溶液中，其中羥基琥珀酰亞胺與殼聚糖的物質(zhì)量之比為1:1，靜置；
[0021](4)將步驟(3)獲得的混合液與步驟(I)配制的溶液按體積比6-3:1混合，攪拌；
[0022](5)將碳化二亞胺加入步驟⑷獲得的混合液中，攪拌；其中碳化二亞胺與殼聚糖的質(zhì)量比為10-4:1 ;pH控制在5 ;攪拌6-10小時(shí)后，將混合液透析48-96小時(shí)，冷凍干燥獲得殼聚糖-RoY復(fù)合物；
[0023]c.混合物的制備:將制備的殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物和殼聚糖-RoY復(fù)合物按照質(zhì)量比為20:80到60:40混合得到可用于制備保健品的殼聚糖-多肽復(fù)合物。
[0024]所述殼聚糖的平均分子量為20萬，脫乙酰度大于85%。
[0025]步驟a的⑵中所述PBS溶液的pH值為8.0。
[0026]步驟a的(3)中所述PBS溶液的pH值為7.0。
[0027]上述的殼聚糖-多肽復(fù)合物在制備保健品中的應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明的有益效果
[0029]本發(fā)明的殼聚糖-多肽復(fù)合物具有可調(diào)節(jié)人體pH值，改變酸性體質(zhì)，增強(qiáng)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，激活荷爾蒙作用；排除體內(nèi)重金屬，排除體內(nèi)農(nóng)藥毒素，排除體內(nèi)過剩的營(yíng)養(yǎng)的保健功效；在CSCl上引入GSH，提高了 CSCl的抗氧化性能，克服了單獨(dú)使用GSH時(shí)其熱穩(wěn)定性差，提高GSH使用效率；CSC1-GSH復(fù)合物相比于氯化殼聚糖具有更強(qiáng)的抗氧化性能，抗氧化性能可提高10-30%，可有效清除多種氧自由基，如羥自由基、超氧自由基、有機(jī)氧自由基。利于運(yùn)動(dòng)機(jī)體減少自由基的產(chǎn)生或加速其清除，以對(duì)抗自由基的副作用，延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生和加快體能恢復(fù)。RoY修飾的氯化殼聚糖(CSCl-R0Y)具有在氧化應(yīng)激條件下，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成官腔的能力。氯化殼聚糖-RoY復(fù)合物具有促進(jìn)缺損或處于亞健康狀態(tài)區(qū)域的組織或器官周圍血管的形成進(jìn)一步促進(jìn)血液循環(huán)，減少疾病發(fā)生。上述殼聚糖-多肽復(fù)合物可以作為保健品的主要成分。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物對(duì)羥自由基(A)、超氧自由基(B)、有機(jī)氧DPPH自由基(C)的清除能力；CSC1為氯化殼聚糖；CSC1-GSH2取代度為10%，CSC1-GSH4取代度為20 %，CSC1-GSH6 取代度為 30 %。
[0031]圖2為氯化殼聚糖-RoY復(fù)合物在低氧條件下促進(jìn)血管內(nèi)皮形成管腔；(A)氯化殼 聚糖處理，(B)氯化殼聚糖-RoY復(fù)合物處理(取代度2.5% )。
【具體實(shí)施方式】
[0032]以下實(shí)施例中的氯化殼聚糖(CSC1，分子量20萬，脫乙酰度大于85% )購(gòu)自浙江金殼有限公司，谷胱甘肽(GSH)購(gòu)自Sigma公司，RoY由上海強(qiáng)耀生物有限公司合成，其余試劑無特殊說明均為市售。
[0033]實(shí)施例1取代度為10 %的氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物制備
[0034](I)稱取0.5g氯化殼聚糖，溶于IOOml去離子水中，備用。
[0035](2)稱取 0.78g MAL-PEG-NHS 溶于 IOml PBS (pH = 8.0)中，并將其滴加到步驟(I)配制的溶液中，室溫?cái)嚢?h。
[0036](3)將步驟⑵所得的產(chǎn)物用超濾管超濾(Ultra-15，截留分子量IOKDa)，并將其產(chǎn)物溶于 100ml PBS (pH = 7.0)中。
[0037](4)稱取0.093g谷胱甘肽溶于IOml去離子水中，并將其滴加到步驟(3)所得的溶液中。
[0038](5)室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，將混合液體裝入透析袋中透析48小時(shí)。冷凍干燥獲得氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物(CSC1-GSH2)。
[0039]實(shí)施例2取代度為20 %的氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物制備
[0040](I)稱取0.5g氯化殼聚糖，溶于IOOml去離子水中，備用。
[0041](2)稱取 0.156g MAL-PEG-NHS 溶于 IOml PBS (pH = 8.0)中，并將其滴加到步驟(I)配制的溶液中，室溫?cái)嚢?h。
[0042](3)將步驟⑵所得的產(chǎn)物用超濾管超濾(Ultra-15，截留分子量IOKDa)，并將其產(chǎn)物溶于 100ml PBS (pH = 7.0)中。
[0043](4)稱取0.186g谷胱甘肽溶于IOml去離子水中，并將其滴加到步驟(3)所得的溶液中。
[0044](5)室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，將混合液體裝入透析袋中透析48小時(shí)。冷凍干燥獲得氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物(CSC1-GSH4)。
[0045]實(shí)施例3取代度為30 %的氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物制備
[0046](I)稱取0.5g氯化殼聚糖，溶于IOOml去離子水中，備用。
[0047](2)稱取 2.36g MAL-PEG-NHS 溶于 IOml PBS (pH = 8.0)中，并將其滴加到步驟(I)配制的溶液中，室溫?cái)嚢?h。
[0048](3)將步驟⑵所得的產(chǎn)物用超濾管超濾(Ultra-15，截留分子量IOKDa)，并將其產(chǎn)物溶于 100ml PBS (pH = 7.0)中。
[0049](4)稱取0.278g谷胱甘肽溶于IOml去離子水中，并將其滴加到步驟(3)所得的溶液中。
[0050](5)室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，將混合液體裝入透析袋中透析48小時(shí)。冷凍干燥獲得氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物(CSC1-GSH6)。
[0051 ] 實(shí)施例4取代度為I %的氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物制備
[0052](I)稱取5g氯化殼聚糖，溶于IOOOml去離子水中，備用。
[0053](2)稱取 0.78g MAL-PEG-NHS 溶于 IOml PBS (pH = 8.0)中，并將其滴加到步驟(I)配制的溶液中，室溫?cái)嚢?h。
[0054](3)將步驟⑵所得的產(chǎn)物用超濾管超濾(Ultra-15，截留分子量IOKDa)，并將其產(chǎn)物溶于 100ml PBS (pH = 7.0)中。
[0055](4)稱取0.092g谷胱甘肽溶于IOml去離子水中，并將其滴加到步驟(3)所得的溶液中。
[0056](5)室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，將混合液體裝入透析袋中透析48小時(shí)。冷凍干燥獲得氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物。
[0057]實(shí)施例5取代度為45 %的氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物制備
[0058](I)稱取0.5g氯化殼聚糖，溶于100mL去離子水中， 備用。
[0059](2)稱取 3.5Ig MAL-PEG-NHS 溶于 IOml PBS (pH = 8.0)中，并將其滴加到步驟(1)配制的溶液中，室溫?cái)嚢?h。
[0060](3)將步驟⑵所得的產(chǎn)物用超濾管超濾(Ultra-15，截留分子量IOKDa)，并將其產(chǎn)物溶于 100ml PBS (pH = 7.0)中。
[0061](4)稱取0.418g谷胱甘肽溶于IOml去離子水中，并將其滴加到步驟(3)所得的溶液中。
[0062](5)室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，將混合液體裝入透析袋中透析48小時(shí)。冷凍干燥獲得氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物。
[0063]實(shí)施例6氯化殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物的抗氧化能力檢測(cè)
[0064](I)對(duì)超氧自由基的清除能力
[0065]取(λ 05M(pH = 8.2)Tris-HCl緩沖液4.5ml于試管中，置于25 °C水浴中預(yù)熱25min,分別加入 Iml 濃度的 5.0mg/ml CSCl 和 CSC1-GSH2 (取代度:10% ), CSC1-GSH2 (取代度:20%)，05(:1-65!12(取代度:30%)的試樣液，3mM鄰苯三酚0.4ml，以蒸餾水為空白，混勻混合，于25°C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)4min，立即向其中加入8M HC12滴終止反應(yīng)，并在299nm處測(cè)其光密度值。按照下列公式計(jì)算復(fù)合物對(duì)超氧自由基的清除能力。結(jié)果如圖1(A)所示，低取代度的CSCl-GSH與CSCl清除超氧自由基的能力無明顯差異，但是取代度為30%的CSCl-GSH復(fù)合物清除超氧自由基的清除能力得到明顯提升。
[0066]

清除率(?) =X 100
[0067](2)對(duì)羥自由基的清除能力
[0068]配制濃度為5.0mg/ml的CSCl和不同取代度的CSC1-GSH復(fù)合物樣品溶液；取500 μ I樣品溶液并在其中依次加入去離子水500 μ l、2mM FeSO4溶液500 μ 1,360 μ g/ml番紅花溶液500 μ 1，均勻混合靜置IOmin后加入6wt%雙氧水溶液800 μ 1，并將其55°C加熱反應(yīng)30min。在測(cè)定過程中以500 μ I去離子水代替樣品溶液作為對(duì)照組，以500 μ I去離子水和800 μ I去離子水分別代替樣品溶液和雙氧水溶液。取200 μ I反應(yīng)液置于96孔板中，波長(zhǎng)492nm處測(cè)定其吸光度值，按照下列公式計(jì)算CSCl-GSH復(fù)合物對(duì)羥自由基的清除能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSH的引入可以明顯提高其對(duì)羥自由基的清除能力，但是不同取代度的復(fù)合物之間對(duì)羥自由基的清除能力沒有顯著性差異，(如圖1⑶所示)。
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種用于制備保健品的殼聚糖-多肽復(fù)合物，其特征在于該復(fù)合物由殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物、殼聚糖-RoY復(fù)合物單獨(dú)或者混合組成，混合時(shí)兩者的質(zhì)量比為20:80到60:40 ；所述殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物或殼聚糖-RoY復(fù)合物中的殼聚糖為氯化殼聚糖、羧甲基殼聚糖、磺酸化殼聚糖或磷酸化殼聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖-多肽復(fù)合物，其特征在于所述殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物的取代度為1_45%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖-多肽復(fù)合物，其特征在于所述殼聚糖-RoY復(fù)合物的取代度為1-10%。
4.權(quán)利要求1所述的殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟: a.殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物的制備: (1)將殼聚糖溶于去離子水中，配制質(zhì)量濃度為I%的殼聚糖溶液； (2)將α-馬來酰亞胺-ω-琥珀酰亞胺酯基聚乙二醇溶于PBS溶液中，配置質(zhì)量濃度為5 %的α -馬來酰亞胺-ω -琥珀酰亞胺酯基聚乙二醇溶液； (3)將步驟(1)和步驟(2)獲得的溶液按照體積比1:0.1-1混合攪拌，室溫反應(yīng)2-4小時(shí)；將混合溶液超濾后，用PBS復(fù)溶，形成質(zhì)量濃度為1-1.5%的反應(yīng)混合物溶液，備用； (4)將谷胱甘肽溶于去離子水形成質(zhì)量濃度為1%-3%的谷胱甘肽溶液； (5)將步驟(4)獲得的溶液加入步驟(3)制備的溶液中，兩者的體積比為1-5:10，混合攪拌12-24h后，將混合液體裝入透析袋中透析48-96小時(shí)，冷凍干燥獲得殼聚糖_谷胱甘肽復(fù)合物； b.殼聚糖-RoY復(fù)合物的制備: (1)將殼聚糖溶于去離子水，配制質(zhì)量濃度為I%的殼聚糖溶液； (2)將RoY多肽溶于去離子水中配制質(zhì)量濃度為0.3-1%的RoY溶液； (3)將羥基琥珀酰 亞胺加入步驟(2)制備的溶液中，其中羥基琥珀酰亞胺與殼聚糖的物質(zhì)量之比為1:1，靜置； (4)將步驟(3)獲得的混合液與步驟(1)配制的溶液按體積比6-3:1混合，攪拌； (5)將碳化二亞胺加入步驟(4)獲得的混合液中，攪拌；其中碳化二亞胺與殼聚糖的質(zhì)量比為10-4:1 ;pH控制在5 ;攪拌6-10小時(shí)后，將混合液透析48-96小時(shí)，冷凍干燥獲得殼聚糖-RoY復(fù)合物； c.混合物的制備:將制備的殼聚糖-谷胱甘肽復(fù)合物和殼聚糖-RoY復(fù)合物按照質(zhì)量比為20:80到60:40混合得到可用于制備保健品的殼聚糖-多肽復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述殼聚糖的平均分子量為20萬，脫乙酰度大于85%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟a的(2)中所述PBS溶液的pH值為 8.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟a的(3)中所述PBS溶液的pH值為 7.0。
8.權(quán)利要求1所述的殼聚糖-多肽復(fù)合物在制備保健品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23L1/305GK104012839SQ201410209617
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】王常勇, 李俊杰, 舒瑤, 郝彤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所