一種凝膠微陣列反應(yīng)器及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種凝膠微陣列反應(yīng)器及其制備方法和應(yīng)用，凝膠微陣列反應(yīng)器包括凝膠和檢測探針，檢測探針包裹在凝膠中，凝膠表面均勻分布有用于進(jìn)樣的微孔。本發(fā)明提供的凝膠微陣列反應(yīng)器，檢測探針可快速檢測離子、小分子或生物分子，而凝膠為檢測探針提供的穩(wěn)定的檢測環(huán)境，提高了凝膠微陣列反應(yīng)器的實用性，具有操作簡便、檢測成本低、特異性強(qiáng)、可實現(xiàn)高通量和大眾化檢測的優(yōu)點。
【專利說明】一種凝膠微陣列反應(yīng)器及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種凝膠微陣列反應(yīng)器，還涉及一種凝膠微陣列反應(yīng)器的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]隨著當(dāng)前生活環(huán)境的日益破壞，環(huán)境污染物質(zhì)(例如重金屬離子、毒性小分子)不僅給動植物的生存帶來危害，更是直接影響人類的的生活質(zhì)量以及威脅人類的身體健康。因此，針對環(huán)境污染性物質(zhì)發(fā)明有效的檢測技術(shù)顯得十分重要。同時，很多離子、小分子、生物分子的存在情況與人類的生理代謝和身體疾病密切相關(guān)，因此，針對這些疾病相關(guān)性靶標(biāo)物質(zhì)發(fā)明有力的檢測技術(shù)也是十分必要的。現(xiàn)有的針對離子、小分子、生物分子等的分析檢測技術(shù)，往往表現(xiàn)出許多不足:依賴大型專業(yè)儀器、依賴專業(yè)技術(shù)人員、樣品處理復(fù)雜、檢測步驟繁瑣、分析成本高昂，很難實現(xiàn)高通量、大眾化應(yīng)用。因此發(fā)明一種通用性強(qiáng)、檢測步驟簡單、成本低廉、可實現(xiàn)高通量和大眾化應(yīng)用的分析檢測技術(shù)顯得十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通用性強(qiáng)、檢測成本低，可實現(xiàn)高通量和大眾化分析檢測應(yīng)用的凝膠微陣列反應(yīng)器。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種凝膠微陣列反應(yīng)器，包括凝膠和檢測探針，檢測探針包裹在所述凝膠中，凝膠表面均勻分布有用于進(jìn)樣的微孔。
[0005]上述的凝膠微陣列反應(yīng)器，所采用的檢測探針為T40核酸探針和抗壞血酸鈉的混合物，所述T40核酸探針為具有SEQ ID N0.1的DNA序列。優(yōu)選的，T40核酸探針的濃度為20~1000nM ;抗壞血酸鈉的濃度為0.2~10mM。
[0006]上述的凝膠微陣列反應(yīng)器厚度為0.4~1.0cm，微孔為具有倒圓錐形、圓柱形或長方體形的微孔，微孔的容積為5~50 μ L。
[0007]上述的凝膠微陣列反應(yīng)器，所采用的凝膠由瓊脂糖或丙烯酰胺制備而成。
[0008]在本發(fā)明提供的凝膠微陣列反應(yīng)器中，核酸探針Τ40和抗壞血酸鈉包裹在凝膠中。當(dāng)從微孔中點樣加入銅離子后，銅離子進(jìn)入凝膠間隙并與寡聚胸腺嘧啶核苷酸和抗壞血酸鈉反應(yīng)。其中Τ40核酸探針為模板，當(dāng)反應(yīng)器中存在銅離子時，銅離子會吸附在Τ40核酸探針上。而抗壞血酸鈉作為還原劑，將Τ40核酸探針上的銅離子還原為銅原子得到銅納米顆粒。而銅納米顆粒是一種具有熒光發(fā)射的納米顆粒，該熒光納米顆粒的最大激發(fā)在340nm左右,最大發(fā)射在610nm左右。通過凝膠微孔中突光強(qiáng)度大小和光斑大小的判斷,可以實現(xiàn)對銅離子的定性和定量檢測；利用紫外燈照射，就可以很方便地通過裸眼觀察到銅離子的存在信息。
[0009]凝膠對其內(nèi)部包裹的探針物質(zhì)具有保護(hù)作用，減少探針物質(zhì)受到環(huán)境的干擾，降低探針的性能發(fā)生變化而導(dǎo)致檢測信號不準(zhǔn)確的可能性，提高凝膠微陣列反應(yīng)器的檢測實用性。[0010]在上述技術(shù)方案的同一構(gòu)思下，本發(fā)明還提供了一種凝膠微陣列反應(yīng)器的制備方法，包括以下步驟:
51、將凝膠與檢測探針混合后制備凝膠溶液；
52、將梳狀微孔模型固定在所述凝膠溶液上，所述梳狀微孔模型的梳體插入凝膠溶液中，待凝膠溶液凝固后拔出，得到均勻分布有微孔的凝膠微陣列反應(yīng)器。
[0011]在上述技術(shù)方案的同一構(gòu)思下，本發(fā)明還提供了前述凝膠微陣列反應(yīng)器或前述制備方法制備得到的凝膠微陣列反應(yīng)器的應(yīng)用，將被檢測的靶物質(zhì)添加到所述凝膠微陣列反應(yīng)器的微孔內(nèi)，可獲得可供檢測的反應(yīng)信號。
[0012]上述的應(yīng)用方法中，靶物質(zhì)為能夠穿過凝膠間隙進(jìn)入凝膠內(nèi)部的物質(zhì)。優(yōu)選的，靶物質(zhì)為離子、小分子、生物分子中的一種或多種。進(jìn)一步的優(yōu)選的，靶物質(zhì)為Cu2+。
[0013]上述的應(yīng)用方法中，反應(yīng)信號的產(chǎn)生模式包括激活式、熄滅式、生成式；反應(yīng)信號為通過儀器采集得到的信號或者裸眼觀察得到的信號。優(yōu)選的，通過儀器采集的信號可以是熒光信號或比色信號。
[0014]在本發(fā)明提供的應(yīng)用方法中，靶標(biāo)物質(zhì)會擴(kuò)散到凝膠內(nèi)部，與凝膠間隙中預(yù)先包裹好的檢測探針或者反應(yīng)試劑進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而產(chǎn)生信號。如果產(chǎn)生的是比色信號(即顏色變化)，可以直接通過肉眼觀察或者相機(jī)拍攝記錄；如果產(chǎn)生的是熒光信號，可以借助紫外燈照射激發(fā)，然后觀察其熒光信號變化并可以通過相機(jī)拍攝記錄。在本發(fā)明中，因為銅離子與探針作用帶來的是紅色熒光信號，當(dāng)在凝膠微陣列反應(yīng)器的微孔中加入銅離子后，將凝膠微陣列反應(yīng)器放置于紫外燈下照射，觀察熒光信號的變化，并用相機(jī)拍攝記錄熒光信號，可以快速知道被檢測樣品中是否含有銅離子。而微孔中的熒光強(qiáng)度大小和光斑大小可以反映銅離子的濃度信息。
[0015]在本發(fā)明中凝膠微陣列反應(yīng)器又名功能化凝膠微陣列反應(yīng)器。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
1、本發(fā)明提供的凝膠微陣列反應(yīng)器，以凝膠作為基材，原料來源廣泛、檢測成本低，同時通過凝膠包裹檢測探針，為檢測探針提供的穩(wěn)定的檢測環(huán)境，避免了探針受到環(huán)境干擾而導(dǎo)致檢測信號不準(zhǔn)確、檢測實用性低的缺陷。
[0017]2、本發(fā)明提供的凝膠微陣列反應(yīng)器，可根據(jù)靶標(biāo)物質(zhì)的理化性質(zhì)，在凝膠中包裹一種或多種檢測探針，為靶標(biāo)物質(zhì)與檢測探針的反應(yīng)提供穩(wěn)定的環(huán)境；同時凝膠的形狀尺度可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)，方便于攜帶和實現(xiàn)原位檢測。
[0018]3、本發(fā)明提供的凝膠微陣列反應(yīng)器的制備方法，不依賴大型儀器制備，操作簡單，原料易得，可大眾化應(yīng)用。
[0019]4、本發(fā)明提供的凝膠微陣列反應(yīng)器的應(yīng)用方法，信號獲取快捷方便，可實現(xiàn)對靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行陣列式分析、實現(xiàn)高通量分析檢測、操作簡單、檢測迅速、不依賴大型檢測儀器、通用性強(qiáng)、可實現(xiàn)大眾化應(yīng)用。
[0020]除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點之外，本發(fā)明還具有其他的目的、特征和優(yōu)點，下面將參 照圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]構(gòu)成本申請的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。
[0022]圖1為本發(fā)明實施例1中凝膠微陣列反應(yīng)器的制備及其應(yīng)用的工藝流程圖。
[0023]圖2為本發(fā)明實施例1中凝膠微陣列反應(yīng)器制備過程圖。
[0024]圖3為本發(fā)明實施例1中銅離子檢測的機(jī)理圖。
[0025]圖4為本發(fā)明實施例1中銅離子檢測的可行性分析結(jié)果圖。
[0026]圖5為本發(fā)明實施例1中凝膠微陣列反應(yīng)器用于銅離子檢測的靈敏度考察圖。
[0027]圖6為本發(fā)明實施例1中凝膠微陣列反應(yīng)器用于銅離子檢測的特異性考察圖。
[0028]圖7為本發(fā)明實施例1中凝膠微陣列反應(yīng)器對DNA探針酶切保護(hù)作用的對比圖。
【具體實施方式】
[0029]以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但是本發(fā)明可由權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同的方式實施。
實施例
[0030]以下實施例中，所采用的原料和涉及到的儀器均為市售。
[0031]實施例1:
凝膠微陣列反應(yīng)器采用瓊脂糖制備凝膠溶液，以具有SEQ ID N0.1的DNA序列的T40核酸探針和抗壞血酸鈉的混合物為檢測探針，檢測探針加入凝膠溶液中，待凝膠溶液凝固成型，得到具有均勻分布有用于進(jìn)樣的微孔的凝膠微陣列反應(yīng)器。
[0032]如圖1所示，凝膠微陣列反應(yīng)器的制備方法和應(yīng)用方法具體包括以下步驟:
S1、制備瓊脂糖溶液:稱取質(zhì)量為0.15g的瓊脂糖粉末，置于量程為50ml的小燒杯中，再加入15ml的MOPS緩沖液(10 mM 3-嗎啉丙磺酸，150 mM氯化鈉，pH=7.8)，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% (即IOOmL的溶液中含有Ig的瓊脂糖)、制膠體積為15ml的瓊脂糖溶液。
[0033]S2、引入檢測探針:將840nM的T40核酸探針和2mM的抗壞血酸鈉充分混勻，加入到SI中制備的瓊脂糖溶液中，充分混勻，制得含有檢測探針的瓊脂糖溶液；T40為具有SEQID N0.1 的 DNA 序列 ο
[0034]S3、制備凝膠:將S2中制備好的含有檢測探針的瓊脂糖溶液在加熱器上加熱至沸騰，沸騰持續(xù)Imin后，停止加熱，得到含有檢測探針的凝膠溶液；將含有檢測探針的凝膠溶液倒入直徑為5.6cm，高度為1.2cm的圓形玻璃皿中。
[0035]S4、凝膠微陣列反應(yīng)器的制備與成型:在S3中制備凝膠溶液上插上梳狀微孔模型，待凝膠溶液成型成凝膠之后，將梳狀微孔模型抽出，得到具有均勻分布有微孔的凝膠微陣列反應(yīng)器。
[0036]本實施例中凝膠微陣列反應(yīng)器的厚度為0.6cm，有21個倒圓錐體的作為后期進(jìn)樣的微孔，各微孔的容積為20 μ L ;微孔模型通過eppendorf 96-孔板剪切而成。
[0037]實施例1為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，在本發(fā)明中，凝膠微陣列反應(yīng)器可以為0.4~
1.0cm之間任意厚度，微孔的容積可以在5~50 μ L之間，微孔還可以為圓柱體或長方體，凝膠還可以由丙烯酰胺制備而成。
[0038]如圖3所示:當(dāng)從微孔中點樣加入銅離子后，銅離子進(jìn)入凝膠間隙并與寡聚胸腺嘧啶核苷酸(Τ40)和抗壞血酸鈉反應(yīng)。其中Τ40核酸探針為模板，當(dāng)反應(yīng)器中存在銅離子時，銅離子會吸附在T40核酸探針上。而抗壞血酸鈉作為還原劑，將T40核酸探針上的銅離子還原為銅原子得到熒光銅納米顆粒，從而獲得可供檢測的熒光信號。具體的檢測方法為:
S5、進(jìn)樣:通過移液槍將20 μ L的銅離子溶液加入到實施例1的凝膠微陣列反應(yīng)器的微孔內(nèi)。
[0039]S6、信號檢測:進(jìn)樣后，室溫放置5分鐘，將凝膠微陣列反應(yīng)器放置于紫外燈下照射，觀察銅納米顆粒的熒光，并用相機(jī)拍攝記錄熒光信號。
[0040]在本發(fā)明中，實施例1僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，Τ40核酸探針的濃度在20~1000nM之間；抗壞血酸鈉的濃度在0.2~IOmM之間均可以實施。本發(fā)明提供的凝膠微陣列反應(yīng)器并不僅限于包裹Τ40探針和抗壞血酸鈉，還可以包裹其他的分子探針和/或納米探針，如:熒光染料分子、金納米粒子等。
[0041]同時，本發(fā)明提供的凝膠微陣列反應(yīng)器還可應(yīng)用于其他能夠穿過凝膠間隙進(jìn)入凝膠內(nèi)部的物質(zhì)，如:汞離子等其他重金屬離子、ATP等生物分子。
[0042]實驗例1:關(guān)于實施例1的凝膠微陣列反應(yīng)器檢測銅離子的可行性分析。
[0043]將500ηΜ的Τ40核酸探針和2mM的抗壞血酸鈉的混合物分別放入三份緩沖溶液中得到混合溶液(緩沖溶液包含IOmM的3-嗎啉丙磺酸、150mM的氯化鈉；pH=7.8)。
[0044]a:前述混合溶液中不加入銅離子；
b:前述混合溶液中加入100 μ M的銅離子； c:前述混合溶液中加入100 μ M的銅離子和ImM的EDTA。
[0045]將a、b、c三份溶液在室溫反應(yīng)5分鐘，通過熒光分光光度計F-7000測得不同情況下的熒光光譜，考察銅離子的存在與否對熒光信號的影響。
[0046]圖4A為熒光強(qiáng)度與銅離子存在與否的關(guān)系圖，當(dāng)溶液中只有T40和抗壞血酸鈉存在時(參見圖4A的曲線a)，溶液中檢測不到熒光信號；當(dāng)在T40和抗壞血酸鈉混合液的體系中加入銅離子時(參見圖4A的曲線b)，經(jīng)反應(yīng)后的溶液檢測到很強(qiáng)的熒光信號；當(dāng)在T40和抗壞血酸鈉混合液的體系中存在EDTA的時候(參見圖4A的曲線C)，因為EDTA能夠螯合二價的銅離子，所以再加入銅離子的時候，也是觀察不到熒光信號。通過以上三組對照實驗，充分的證明了銅離子的存在與否是導(dǎo)致熒光信號有無的直接原因，本發(fā)明通過T40核酸探針和抗壞血酸鈉混合液作為檢測探針可以實現(xiàn)對銅離子的檢測。
[0047]圖4B是銅納米顆粒熒光信號產(chǎn)生速度的圖，在熒光分光光度計時間掃描的模式下，將不含銅離子的b和c溶液掃描至110秒的時候，加入銅離子，繼續(xù)監(jiān)測熒光信號的變化。從圖4B中的b曲線的變化可知，銅離子與T40和抗壞血酸鈉混合物的反應(yīng)并產(chǎn)生熒光信號的速度十分迅速，在5分鐘之內(nèi)就可以完成。
[0048]實驗例2:關(guān)于實施例1的凝膠微陣列反應(yīng)器檢測銅離子時的靈敏度分析。
[0049]分別配置濃度為O μ M、20 μ M、40 μ M、80 μ M、0.lmM、0.2mM、0.4mM、0.8mM、lmM、2mM、4mM、8mM、IOmM的銅離子溶液；將各濃度的銅離子溶液20 μ L連續(xù)快速的加入到凝膠上不同的進(jìn)樣微孔中，在紫外燈照射下觀察熒光信號。
[0050]結(jié)果如圖5所示，5分鐘后，隨著銅離子的濃度不斷上升，在紫外燈下呈現(xiàn)的熒光光斑不斷增大，熒光亮度也不斷變亮。在銅離子濃度小到20 μ M的時候，還可以觀察到能夠區(qū)分于背景的熒光信號，這一檢測下限能夠滿足世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定的飲用水中銅離子的安全極限(30μΜ)。說明利用實施例1中制備的凝膠微陣列反應(yīng)器可以實現(xiàn)對銅離子的高通量快速靈敏檢測。
[0051]實驗例3:關(guān)于實施例1的凝膠微陣列反應(yīng)器檢測銅離子時的選擇性考察。
[0052]分別將濃度為500 μ M的銅離子溶液和濃度均為I mM的Ag+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Sn2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+、Cd2+、Ba2+、Ca2+、Mg2+溶液各20 μ L連續(xù)快速的加入到凝膠上不同的進(jìn)樣微孔中，在紫外燈照射下觀察熒光信號。
[0053]檢測結(jié)果如圖6所示:只有銅離子會導(dǎo)致很強(qiáng)熒光信號的產(chǎn)生，而其他離子的存在不帶來任何的信號干擾。由此可知，本發(fā)明采用凝膠微陣列反應(yīng)器檢測銅離子的方法具有高特異性的優(yōu)勢。
[0054] 實驗例4:凝膠微陣列反應(yīng)器對DNA探針酶切保護(hù)作用的對比考察。
[0055]實驗組:將包裹了 Τ40和抗壞血酸鈉的凝膠微陣列反應(yīng)器浸泡在SI核酸外切酶溶液(4mM的醋酸鈉、30mM的氯化鈉、0.2mM的硫酸鋅、50單位/ ml的SI核酸外切酶、pH=4.6)中，浸泡30min后，用蒸餾水沖洗3次，轉(zhuǎn)移到含有抗壞血酸鈉的MOPS溶液(IOmM的3-嗎啉丙磺酸、150mM的氯化鈉、3mM的抗壞血酸鈉、pH=7.8)中，浸泡5min后,將微孔倒干,再在微孔中加入20 μ L的銅離子液體，在紫外燈照射下觀察熒光信號。
[0056]對照組為均相溶液體系:先將Τ40在50單位/ml的SI核酸外切酶溶液中處理IOmin,再用于檢測銅離子，檢測條件與實驗組相同。
[0057]結(jié)果如圖7所示，在對照組中，T40探針很容易被核酸酶降解，使得被SI核酸外切酶處理過的探針T40不再具備合成熒光銅納米顆粒的能力，銅離子加入之后沒有熒光信號的產(chǎn)生；而實驗組中，凝膠微陣列反應(yīng)器被同等濃度的核酸酶處理更長的時間之后，對銅離子的響應(yīng)跟沒有被處理過的凝膠微陣列反應(yīng)器一樣，這證明了凝膠微陣列反應(yīng)器對其內(nèi)部包裹的核酸探針具有很好的酶切保護(hù)作用，使得核酸探針T40沒有被核酸酶降解。
[0058]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實施例。凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)該指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下的改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種凝膠微陣列反應(yīng)器，其特征在于，包括凝膠和檢測探針，所述檢測探針包裹在所述凝膠中，所述凝膠的表面均勻分布有用于進(jìn)樣的微孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝膠微陣列反應(yīng)器，其特征在于，所述檢測探針為T40核酸探針和抗壞血酸鈉的混合物，所述T40核酸探針為具有SEQ ID N0.1的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凝膠微陣列反應(yīng)器，其特征在于，所述T40核酸探針的濃度為20 ~1000nM0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凝膠微陣列反應(yīng)器，其特征在于，所述抗壞血酸鈉的濃度為0.2 ~10mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項所述的凝膠微陣列反應(yīng)器，其特征在于，所述凝膠微陣列反應(yīng)器厚度為0.4~1.0cm，所述微孔為倒圓錐體、圓柱體或長方體，所述微孔的容積為5~50 μ L，所述凝膠由瓊脂糖或丙烯酰胺制備而成。
6.一種權(quán)利要求1至5中任意一項所述的凝膠微陣列反應(yīng)器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51、將凝膠與檢測探針混合后制備凝膠溶液； 52、將梳狀微孔模型固定在所述凝膠溶液上，所述梳狀微孔模型的梳體插入所述凝膠溶液中，待所述凝膠溶液凝固后拔出，得到均勻分布有微孔的凝膠微陣列反應(yīng)器。
7.—種權(quán)利要求1至5中任意一項所述的凝膠微陣列反應(yīng)器或由權(quán)利要求6所述制備方法制備得到的凝膠微陣列反應(yīng)器的應(yīng)用，其特征在于，將靶物質(zhì)添加到所述凝膠微陣列反應(yīng)器的微孔內(nèi)，待所述靶物質(zhì)與所述檢測探針發(fā)生反應(yīng)，獲得可供檢測的反應(yīng)信號。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述靶物質(zhì)為能夠穿過凝膠間隙進(jìn)入凝膠內(nèi)部的物質(zhì)；所述反應(yīng)信號為通過儀器采集的信號或者裸眼觀察的信號。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述通過儀器采集的信號可以是熒光信號或比色信號，所述靶物質(zhì)為離子、小分子、生物分子中的一種或多種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述靶物質(zhì)為Cu2+。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004643SQ201410194439
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月9日
【發(fā)明者】王柯敏, 卿志和, 何曉曉, 卿太平, 毛珍貴, 鄒振 申請人:湖南大學(xué)