大量分泌的蛋白的篩選和它們作為融合配偶體在重組蛋白制備中應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及鑒定用于超量分泌制備重組蛋白質(zhì)的合適的分泌融合配偶體(SFP)的方法。SFP可通過分泌蛋白質(zhì)組分析獲得。重組蛋白可與分泌融合配偶體(SFP)一起以融合蛋白形式制備得到，并通過體外蛋白酶處理與SFP相分離。本發(fā)明的SFP極大地提高了目標(biāo)蛋白和肽的分泌水平，所述目標(biāo)蛋白和肽對于生物制藥和生物產(chǎn)業(yè)很有價值。
【專利說明】大量分泌的蛋白的篩選和它們作為融合配偶體在重組蛋白制備中應(yīng)用
[0001]本申請要求2008年12月4日提交的美國專利申請N0.61/119，972的優(yōu)先權(quán)；本申請是申請日為2008年12月5日的中國專利申請N0.200880132268.3的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于重組蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及分泌融合配偶體和篩選合適的分泌融合配偶體(SFP)的技術(shù)。本發(fā)明公開了用于實現(xiàn)高水平分泌目標(biāo)多肽的最佳SFP。本發(fā)明的SFP可誘導(dǎo)超量分泌制備重組蛋白質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0003]目標(biāo)蛋白質(zhì)的重組表達(dá)是廣泛用來生產(chǎn)大量用于研究目的或治療和其它商業(yè)用途的蛋白質(zhì)的方法。本領(lǐng)域已知有多種重組表達(dá)系統(tǒng)，包括細(xì)菌、酵母和哺乳動物宿主細(xì)胞系統(tǒng)，并且許多不同蛋白質(zhì)已在這些系統(tǒng)中成功生產(chǎn)。然而，使用現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)還有許多蛋白質(zhì)很難生產(chǎn)，導(dǎo)致很少或沒有蛋白質(zhì)表達(dá)和分泌。提高重組表達(dá)蛋白質(zhì)分泌的方法，例如過量表達(dá)分子伴侶和折疊酶(Hackel等人，Pharm Res23:790 (2006) ;Poewer和Robinson,Biotechnol Prog23:364 (2007) ;Shusta 等人，Nat Biotechnoll6:773 (1998))、過量表達(dá)與分泌途徑相關(guān)的基因((Carla Fama 等人，Biochim Biophys Actal773:232 (2007)；Wentz 和 Shusta 等人，Appl Environ Microbiol73:1189 (1998))、對前導(dǎo)序列進(jìn)行操作(Clements 等人，Genel06:267 (1991) ；Kjaerulff 和 Jensen, Biochem Biophys ResCommun336:974 (2005) ；Sagiya 等人，Microbiol.Biotechnol42:358 (1994) ；Li 等人，Bitechnol Progl8:831 (2002))已在特定的目標(biāo)蛋白上取得一定成功。
[0004]提高蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力的另一種方法是將目標(biāo)蛋白連接到融合配偶體上。作為融合配偶體使用的分泌蛋白包括人血清白蛋白(Kang等人,Protein Expr Purif53:331 (2007)；Huang 等人，J.Pept.Sci 14:588 (2008)), α-乳白蛋白(W01995027782A1)、紅素氧還蛋白(W02000039310A1)、人胰高血糖素(W02000053777A1)、八目鰻抗菌肽相關(guān)肽(W02005019242A2)、磷酸核酮糖激酶(US6500647B1)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(Kajino等人，Appl Environ Microbiol66:638 (2000)、葡萄球菌 A 蛋白(Moreno 等人，ProteinExpr Purifl8:242 (2000)、Hspl50 蛋白(Sievi 等人，Biotechnol.Prog.19:1368 (2003)、纖維素結(jié)合域(Ahn 等人，Appl Microbiol Biotechnol.64:833 (2004))和金結(jié)合妝(US20050106625A1)已在特定的目標(biāo)蛋白上取得一定成功。
[0005] 為了鑒定分泌蛋白和新信號序列，已開發(fā)了數(shù)個信號序列捕獲系統(tǒng)。美國專利N0.6，228，590描述了一種篩選哺乳動物信號序列的技術(shù)，其使用含有哺乳動物編碼序列且與報告蛋白融合的核酸轉(zhuǎn)化報告蛋白缺乏的酵母，并檢測分泌報告蛋白的細(xì)胞。一種使用缺乏轉(zhuǎn)化酶的酵母和轉(zhuǎn)化酶報告蛋白的類似系統(tǒng)公開于歐洲專利EP0907727中?；诮湍傅男盘栃蛄胁东@已用于鑒定來自人DNA (Klein等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:7108 (1996) Jacobs 等人，Genel98:289 (1997))、鼠DNA (Gallicioti 等人，J.Membrane Biol.183:175 (2001))、斑馬魚 DNA (Crosier 等人，Dev.Dynamics222:637 (2001))、擬南芥 DNA(Goo 等人，Plant Mol.Biol.41:415 (1999))、馬鈴薯 DNA(Surpili 等人，Anais de Academia Brasileira de Ciencias74:599 (2002))和白色念珠菌DNA (Monteoliva等人，Eukaryotic Celll: 514 (2002))的分泌蛋白。已開發(fā)了使用哺乳動物宿主細(xì)胞(Gallicioti等人，J.Membrane Biol.183:175(2001))和細(xì)菌宿主細(xì)胞(Ferguson等人，Cancer Res.65:8209 (2000)的類似捕獲系統(tǒng)。已用于信號序列捕獲的報告蛋白包括轉(zhuǎn)化酶(Klein等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:7108 (1996))、α -淀粉酶(U.S.Patent N0.6，228，590)、酸性磷酸酯酶(PH05) (Surpili 等人，Anais deAcademia Brasileira de Ciencias74:599 (2002))和 β -內(nèi)酸胺酶(Ferguson等人，CancerRes.65:8209(2000))。
[0006]鑒定對目標(biāo)蛋白分泌有用的翻譯融合配偶體(TFPs)的方法公開于W02005/068658中。該方法包含:(i)制備多個宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞用包含核酸片段的文庫和與編碼報告蛋白的核苷酸序列融合的編碼目標(biāo)蛋白的核苷酸序列的多種載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化；其中所述的宿主細(xì)胞缺乏報告蛋白；和(ii)從宿主細(xì)胞中鑒定出TFP文庫，其中該TFP文庫包含單獨誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白分泌的核酸片段。
[0007]在酵母中分泌制備極少分泌型蛋白的翻譯融合配偶體(TFP)技術(shù)描述于W02007/015178。在從酵母基因組中篩選TFP的過程中，發(fā)現(xiàn)了 YGR106C (Voalp)基因。目前鑒定出Voalp蛋白在ER膜上的細(xì)胞定位(Ryan等人，Mol.Biol.Cell, Epub ahead ofprint, S印17，2008)。Voalp被認(rèn)為是5個用于液泡ATP酶的VO裝配因子中的一個。
[0008]因此本 領(lǐng)域仍亟需能提高蛋白表達(dá)的其它序列，以及鑒定這些序列的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]技術(shù)問題
[0010]本發(fā)明涉及使用分泌融合配偶體(SFP)超量分泌制備和有效純化各種重組蛋白質(zhì)，所述的分泌融合配偶體可通過分泌蛋白質(zhì)組分析獲得。重組蛋白質(zhì)以含有分泌融合配偶體的融合體形式在胞外制備，并且可通過體外蛋白酶處理從SFP上分離出來。本發(fā)明所述SFP極大地提高了目標(biāo)蛋白的分泌水平并改良了對生物制藥和生物產(chǎn)業(yè)有價值的多肽。還描述了選擇/篩選SFP的方法。盡管可以確定甚至可以預(yù)測是否分泌出特定的蛋白質(zhì)，但不可能預(yù)測出分泌的蛋白質(zhì)是否具有SFP的功能。本發(fā)明的選擇/篩選方法使得可能選擇出具有SFP功能的蛋白質(zhì)和該蛋白質(zhì)的片段或衍生物。用本發(fā)明的選擇/篩選方法選擇出的SFP提高了可用于生物制藥和生物產(chǎn)業(yè)的蛋白質(zhì)的重組制備。本發(fā)明還包括鑒定出的SFP及其片段和衍生物。
[0011]技術(shù)方案
[0012]因此，本發(fā)明的一個目的在于提供鑒定分泌融合配偶體(SFP)的方法，所述的方法包括:
[0013](i)用可操作地連接有異源啟動子的編碼分泌多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化第一宿主細(xì)胞；
[0014](ii)與所述分泌多肽的天然啟動子連接到所述的編碼分泌多肽的多核苷酸時測得的所述多肽的分泌水平相比，確定所述的第一宿主細(xì)胞是否過量分泌所述的分泌多肽；[0015](iii)用包含第一編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸和第二編碼步驟(ii)中確定的過量分泌的多肽的多核苷酸的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化第二宿主細(xì)胞，其中，所述的第一和第二多核苷酸相對于彼此以任何順序位于相同的表達(dá)盒內(nèi)；
[0016](iv)在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述的第二宿主細(xì)胞，其中所述的構(gòu)建體表達(dá)所述目標(biāo)多肽和所述過量分泌多肽的融合多肽；和
[0017](V)確定所述的融合多肽是否分泌到培養(yǎng)基中；從而鑒定所述的過量分泌多肽是否為SFP。
[0018]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種分離的融合多肽，其包括:(i)上述的SFP或其片段或衍生物；和(ii)目標(biāo)多肽。
[0019]本發(fā)明另一個目的還在于提供一種分離的融合多肽，其包括:(i)包括含有SEQ IDNO:1的176-213位氨基酸的親水(HL)結(jié)構(gòu)域的SFP或其片段或衍生物，其中所述SFP沒有跨膜結(jié)構(gòu)域(TM);和(ii)目標(biāo)多肽。
[0020]本發(fā)明另一個目的還在于提供一種構(gòu)建體，其包括:(i)啟動子；(ii)編碼SEQ IDNO:1的176-213位的氨基酸或其片段或衍生物的第一多核苷酸，其中所述SFP無跨膜結(jié)構(gòu)域(TM);和(iii)編碼目標(biāo)多肽或其衍生物的第二多核苷酸。
[0021]本發(fā)明的另一個目的還在于提供一種包含上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。
[0022]本發(fā)明的另一個目的還在于提供一種重組制備目標(biāo)多肽的方法，其包括:(i)用編碼SFP的多核苷酸和編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(ii)在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，其中 從所述的宿主細(xì)胞中制備并分泌出包含融合到所述目標(biāo)多肽的所述SFP的融合多肽；和
[0023](iii)分離所述的融合多肽。
[0024]本發(fā)明的另一個目的還在于提供一種用上述方法重組制備的目標(biāo)多肽。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]從下述的詳細(xì)說明并結(jié)合所附的附圖，將更加清楚地理解本發(fā)明上述及其它目的、特征和優(yōu)點。
[0026]圖1所示為(A)預(yù)測的氨基酸序列和SFPl蛋白的結(jié)構(gòu)域；(B)表達(dá)連續(xù)缺失的SFPl基因的載體示意圖；(C) SDS-PAGE分析SFPl蛋白的相對表達(dá)水平。10% Tris-TricineSDS-PAGE分析用0.4mL丙酮濃縮的0.6mL的肉湯培養(yǎng)物。泳道1:用YGaT91載體轉(zhuǎn)化的2805株的培養(yǎng)物；2:用YGaT92載體轉(zhuǎn)化的2805株的培養(yǎng)物；3:用YGaT93載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；4:用YGaT94載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；5:用YGaT95載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；6:用YGaT96載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；7:用YGaT97載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道M:預(yù)染色的蛋白質(zhì)大小標(biāo)記(Invitrogen)。
[0027]圖2所示為(A)表達(dá)SFP1-1L2融合蛋白的載體示意圖；(B) SDS-PAGE分析SFP1-1L2融合蛋白表達(dá)水平。10% Tris-Tricine SDS-PAGE分析用0.4mL丙酮濃縮的0.6mL的肉湯培養(yǎng)物。泳道1:用YGaT92-1L2載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道2:用YGaT93-1L2載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道3:用YGaT94_IL2載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道M:預(yù)染色的蛋白質(zhì)大小標(biāo)記(Invitrogen)
[0028]圖3為含有YGaT92_EXD4的重組酵母株分批補料發(fā)酵的曲線圖和根據(jù)發(fā)酵時間SDS-PAGE分析分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)的結(jié)果。
[0029]圖4所示為SDS-PAGE分析用不同濃度的腸激酶(Invitrogen，USA)消化純化后的SFP1-EXD4融合蛋白的結(jié)果。泳道1:純化后的SFP1-EXD4融合蛋白；泳道2:用0.1 μ I腸激酶37°C消化I小時后純化的SFP1-EXD4融合蛋白；泳道3:用0.2 μ I腸激酶37°C消化I小時后純化的SFP1-EXD4融合蛋白；泳道4:用0.3 μ I腸激酶37°C消I小時后化純化的SFP1-EXD4融合蛋白；泳道M:預(yù)染色的蛋白質(zhì)大小標(biāo)記(Invitrogen)。
[0030]圖5所示為(A) HPLC分析腸激酶消化的SFP1-EXD4融合蛋白；(B) SDS-PAGE分析HPLC片段。凝膠上的數(shù)字表述HPLC片段的編號。
[0031 ] 圖6所示為MALD1-T0F分析純化的EXD4蛋白。
[0032]圖7所示為㈧表達(dá)SFPl突變體-EXD4融合蛋白的載體示意圖；⑶SDS-PAGE分析SFPl突變體-EXD4融合蛋白表達(dá)水平。10% Tris-Tricine SDS-PAGE分析用0.4mL丙酮濃縮的0.6mL的肉湯培養(yǎng)物。泳道1:用YGaT92-EXD4載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道2:用YGaT921-EXD4載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道3:用YGaT922_EXD4載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道4:用YGaT923-EXD4載體轉(zhuǎn)化的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道M:預(yù)染色的蛋白質(zhì)大小標(biāo)記(Invitrogen)。
[0033]圖8所示為含有YGaMKH_EXD4的重組酵母株在指定發(fā)酵時間的分批補料發(fā)酵的SDS-PAGE 分析。
[0034]圖9為含有YGaST6-EXD4_HL的重組酵母株分批補料發(fā)酵的曲線圖和根據(jù)發(fā)酵時間SDS-PAGE分析分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)的結(jié)果。
[0035]圖10所示為含有YGaMKH-EGF的重組酵母株分批補料發(fā)酵的曲線圖和根據(jù)發(fā)酵時間SDS-PAGE分析分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)的結(jié)果。
[0036]圖11所示為(A)HL-EGF融合蛋白的N1-NTA親和層析結(jié)果。拼上去的圖是指定片段的SDS-PAGE分析和⑶用腸激酶消化后的HL-EGF融合蛋白的N1-NTA親和層析結(jié)果。拼上去的圖是指定片段的SDS-PAGE分析。
[0037]圖12為含有YGaMKH-PTH的重組酵母株分批補料發(fā)酵的曲線圖和根據(jù)發(fā)酵時間SDS-PAGE分析分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)的結(jié)果。
[0038]圖13所示為SDS-PAGE分析用分泌形式的重組子Kex2p (JH Sohn, KRIBB)和腸激酶(Invitrogen，USA)消化后純化的HL-PTH融合蛋白。泳道1:純化后的HL-PTH融合蛋白；泳道2:用Kex2p于37°C消化I小時后純化的HL-PTH融合蛋白；泳道3:用腸激酶37°C消化I小時后純化的HL-PTH融合蛋白；泳道M:預(yù)染色的蛋白質(zhì)大小標(biāo)記(Invitrogen)。
[0039]圖14所示為(A)2805株的生長曲線，箭頭所指是取樣點；(B)樣品細(xì)胞經(jīng)熒光染料hochest染色后的共焦激光掃描顯微鏡結(jié)果。
[0040]圖15所示為樣品M2的雙向凝膠電泳結(jié)果。
[0041]圖16所示為Ι-DE/MudPIT的SDS-PAGE分析l_DE/MudPIT (多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，Multidimensional Protein Identification Technology)。
[0042]圖17所示為(A)表達(dá)19個選自分泌蛋白質(zhì)組分析的基因的Y2805轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)物上清液的SDS-PAGE分析。10% Tris-Tricine SDS-PAGE分析用0.4mL丙酮濃縮的0.6mL的肉湯培養(yǎng)物。泳道1:過量表達(dá)BGL2基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道2:過量表達(dá)CIS3基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道3:過量表達(dá)CRHl基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道4:過量表達(dá)CWPl基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道5:過量表達(dá)DSE4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道7:過量表達(dá)EGT2基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道8:過量表達(dá)EXGl基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道9:過量表達(dá)GASl基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道10:過量表達(dá)GAS3基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道11:過量表達(dá)GAS5基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道12:過量表達(dá)PSTl基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道13:過量表達(dá)SCW4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道15:過量表達(dá)SMl基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道16:過量表達(dá)TOSl基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道17:過量表達(dá)UTHl基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道18:過量表達(dá)YGPl基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道19:過量表達(dá)YPSl基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道20:過量表達(dá)ZPSl基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道M:預(yù)染色的蛋白質(zhì)大小標(biāo)記(Invitrogen)。SDS-PAGE分析用Endo-H處理后的培養(yǎng)物上清液⑶。[0043]圖18所示為SDS-PAGE分析表達(dá)出分別與EXD4融合的11個基因的Y2805轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)物上清液。10% Tris-Tricine SDS-PAGE分析用0.4mL丙酮濃縮的0.6mL的肉湯培養(yǎng)物。泳道1:過量表達(dá)BGL2-EXD4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道2:過量表達(dá)GAS3-EXD4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道3:過量表達(dá)GAS5-EXD4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道4:過量表達(dá)PST1-EXD4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道5:過量表達(dá)SCW4-EXD4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道6:過量表達(dá)SCW10-EXD4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道7:過量表達(dá)SM1-EXD4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道8:過量表達(dá)UTH1-EXD4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道9:過量表達(dá)YGP1-EXD4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道10:過量表達(dá)YPS1-EXD4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道11:過量表達(dá)ZPS1-EXD4基因的2805株的肉湯培養(yǎng)物；泳道M:預(yù)染色的蛋白質(zhì)大小標(biāo)記(Invitrogen)。
[0044]圖19所示為(A)Kyte-Doolittle親水性分析和SCW4和EXD4融合體的缺失片段的示意圖；(B)SDS-PAGE分析含有逐漸缺失的SCW4-EXD4融合片段的各個轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物上清液。
[0045]圖20所示為分析分別含有YGa-SCW4-1-EXD4和YGa_SCW4-3_EXD4的重組酵母株2805在分批補料發(fā)酵過程中分泌到培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結(jié)果。
[0046]圖21所示為分析用腸激酶處理前后分泌的融合蛋白、SCW4-1-EXD4和SCW4-3-EXD4 的 SDS-PAGE 結(jié)果。
[0047]圖22所示為(A)分泌到培養(yǎng)基中的SCW4-hGH的SDS-PAGE結(jié)果，肉湯培養(yǎng)IOyL含有各自載體的細(xì)胞；(B)用腸激酶處理前后的樣品。
[0048]圖23所示為根據(jù)發(fā)酵時間，分析含有YGa-SCW4-2_hGH的重組酵母株分批補料發(fā)酵過程中分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結(jié)果。
[0049]圖24為IL-2表達(dá)載體pYGaT92_IL2的載體圖。
[0050]圖25為毒蜥外泌肽-4表達(dá)載體pYGaT923_EXD4的載體圖。
[0051 ] 圖26為毒蜥外泌肽-4表達(dá)載體pYGaMKH_EXD4的載體圖。
[0052]圖27為毒蜥外泌肽-4表達(dá)載體pYGaST6-EXD_HL的載體圖。
[0053]圖28為EGF表達(dá)載體pYGaMKH_EGF的載體圖。
[0054]圖29為PTH表達(dá)載體pYGaMKH_PTH的載體圖。
[0055]圖30為毒蜥外泌肽-4表達(dá)載體pYGaSCW4-l_EXD4的載體圖。[0056]圖31為毒蜥外泌肽-4表達(dá)載體pYGaSCW4-3_EXD4的載體圖。
[0057]圖32為hGH表達(dá)載體pYGaSCW4-2_hGH的載體圖。
【具體實施方式】
[0058]本發(fā)明滿足了高水平地分泌目標(biāo)多肽和快速、有效地篩選可用于獲得高水平分泌的目標(biāo)多肽的SFP鑒定技術(shù)。本發(fā)明有助于優(yōu)化任何蛋白的重組表達(dá)，尤其有助于因在已知表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)水平低而不能大規(guī)模和/或低成本制備的蛋白質(zhì)制備。優(yōu)化后的SFP可獲得高水平的目標(biāo)多肽的分泌。
[0059]定義:
[0060]應(yīng)當(dāng)注意，術(shù)語“一”或“一個”個體是指一個或多個體；如“一個載體”應(yīng)當(dāng)理解為一個或多個載體。同樣，術(shù)語“一”(或“一個”)、“一個或多個”和“至少一個”在本申請
中可以互換使用。
[0061]本發(fā)明中，術(shù)語“多肽”包括單個的“多肽”以及多個“多肽”，是指通過酰胺鍵(也稱肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。術(shù)語“多肽”是指兩個或多個氨基酸的任何鏈，不是指產(chǎn)物具體的長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或其它用于指代兩個或多個氨基酸的鏈的任何術(shù)語都包括在“多肽”的定義內(nèi)，而且術(shù)語“多肽”用這些中的任何一個替代或可互換使用。術(shù)語“多肽”還指多肽表達(dá)后修飾的產(chǎn)物，包括但不限于:糖基化、?；?、磷酸化、酰胺化、用已知的保護(hù)/保衛(wèi)基團(tuán)衍生物、蛋白水解裂解或用非天然的氨基酸修飾。多肽可來源于天然的生物或通過重組技術(shù)制備，但不一定翻譯自特定的核酸序列。其可以用任何方法生成，包括化學(xué)合成。
[0062]“分離的多肽”或其片段、變體或衍生物是指不在其天然環(huán)境下的多肽。不需要特別的純化程度。例如，分離的多肽可移取自其原生的和天然的環(huán)境。為本發(fā)明目的，在宿主細(xì)胞中重組制備的多肽和蛋白被看做進(jìn)行了分離，其被認(rèn)為是已經(jīng)被任何合適的技術(shù)分開、分離、部分或基本純化的原生或重組的多肽。
[0063]本發(fā)明的多肽還包括前述多肽的片段、衍生物、類似物或變體和其任意組合。當(dāng)術(shù)語“片段”、“變體”、“衍生物”和“類似物”是指本發(fā)明的多肽時，包括至少保留一些相應(yīng)原始多肽的生物學(xué)、抗原或免疫的特性。本發(fā)明的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段，此外還包括其它本申請其它地方描述的特定片段。本發(fā)明多肽的變體包括如上所述的片段，還包括由于氨基酸取代、缺失或插入導(dǎo)致氨基酸序列改變的多肽。變體可自然發(fā)生或非自然發(fā)生。非自然發(fā)生的變體可通過使用本領(lǐng)域公知的誘變技術(shù)進(jìn)行制備。多肽變體可包括保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或增加。本發(fā)明多肽的衍生物包括為具有原始多肽所不具有的額外特性而已經(jīng)發(fā)生改變的多肽。多肽變體在本申請中還指“多肽類似物”。本申請中，多肽的“衍生物”指具有通過功能側(cè)基反應(yīng)后化學(xué)衍生出的一個或多個殘基的主體多肽(subject polypeptide)。“衍生物”還包括含有20個基本氨基酸的一個或多個天然氨基酸衍生物的肽。例如，4-羥基脯氨酸可用來取代脯氨酸；5_羥基賴氨酸可用來取代賴氨酸；3_甲基組氨酸可用來取代組氨酸；高絲氨酸可用來取代絲氨酸以及鳥氨酸可用來取代賴氨酸。
[0064]“ 參考氨基酸序列”是指沒有任何引入任何氨基酸取代的特異序列。作為本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，如果沒有發(fā)生取代，本發(fā)明“分離的多肽”包括與參考氨基酸序列相同的氨基酸序列。
[0065]本發(fā)明所述的多肽可具有多種改變，如取代、缺失或插入。可在多肽中取代的典型的氨基酸包括具有堿性側(cè)鏈如(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酸膠、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β -支鏈側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。
[0066]還包括與本申請所述的多肽和參考多肽具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%—致性的相應(yīng)
多肽片段。
[0067]序列一致性的計算是通過比較兩個在比較區(qū)域進(jìn)行最佳排列的序列，確定相同氨基酸殘基或核苷酸在兩個序列中所處位置的數(shù)目以獲得匹配位置的數(shù)目，用比較區(qū)域(例如窗口大小)的位置總數(shù)目除以匹配位置的數(shù)目并將其結(jié)果乘以100來獲得序列一致性的百分?jǐn)?shù)。一方面；當(dāng)長度為100個氨基酸或核苷酸的四個空位可被引入以使比對最大化時，一致性百分比的計算是指兩個序列中的較小序列氨基酸殘基或核苷酸的百分?jǐn)?shù)，其中所述的兩個序列與被比序列中的相同氨基酸殘基或核苷酸比對(Dayhoff, in Atlas ofProteinSequence and Structure (蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)地圖集)，Vol.5, p.124, NationalBiochemical Research Foundation (全國生化研究基金會)，Washington, D.C.(1972),作為引文并入本申請)。一致性的確定通常通過本領(lǐng)域已知的計算機同源性程序進(jìn)行。典型程序為 Gap 程序(Wisconsin Sequenc Analysis Package (Wisconsin 序列分析軟件包),Version8for UNIX, Genetics Computer Group, University ResearchPark, Madison, WI),使 用默認(rèn)設(shè)置，應(yīng)用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv.Appl.Math.，1981，2:482-489,其以引文形式整體并入本申請)。
[0068]優(yōu)選的，任何取代為保守氨基酸的取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔侵赴被釟埢镁哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基替代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域內(nèi)已有定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈如(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酸膠、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β -支鏈側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。
[0069]在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種鑒定分泌融合配偶體(SFP)的方法，所述的方法包括:(i)用可操作地與編碼分泌多肽的多核苷酸連接的異源啟動子轉(zhuǎn)化第一宿主細(xì)胞；(ii)與所述分泌多肽的天然啟動子連接到所述的編碼分泌多肽的多核苷酸時測得的所述多肽的分泌水平相比，確定所述第一宿主細(xì)胞是否過量分泌所述的分泌多肽；(iii)用包含第一編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸和第二編碼步驟(ii)中確定的過量分泌的多肽的多核苷酸的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化第二宿主細(xì)胞，其中，所述的第一和第二多核苷酸相對于彼此以任何順序位于相同的表達(dá)盒內(nèi)；(iv)在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述的第二宿主細(xì)胞，其中所述的構(gòu)建體表達(dá)所述目標(biāo)多肽和所述過量分泌多肽的融合多肽；和(V)確定所述的融合多肽是否分泌到培養(yǎng)基中；從而鑒定所述的過量分泌多肽是否為SFP。[0070]在本發(fā)明的方法中，可從“分泌蛋白質(zhì)組”或“總分泌多肽”中鑒定SFP。分泌蛋白質(zhì)組包括分泌到胞外培養(yǎng)基并從胞外培養(yǎng)基中收集的多肽。任何真核或原核生物的DNA可編碼分泌蛋白質(zhì)組，包括細(xì)菌、真菌(如酵母)、植物和動物(如哺乳動物)。適合的細(xì)菌包括但不限于:埃希氏桿菌屬和芽孢桿菌屬。適合的酵母包括但不限于:念珠菌屬、德巴利酵母屬、漢森酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬、耶羅威亞酵母屬、酵母菌屬、許旺酵母屬和Arxula。具體的物種實例包括:產(chǎn)朊假絲酵母、博伊丁假絲酵母、白色念珠菌、產(chǎn)乳糖酶酵母、巴斯德畢赤酵母、樹干畢赤酵母、粟酒裂殖酵母、釀酒酵母、多形漢森酵母、解脂耶氏酵母、西方許旺酵母和Arxula adeninivorans。其它可作為DNA來源的真菌包括但不限于:曲霉屬、青霉屬、根霉屬和木霉屬?？勺鳛镈NA來源的植物包括但不限于:擬南芥、玉米、煙草和馬鈴薯。適合的動物細(xì)胞包括但不限于:人、鼠、白鼠、兔子、狗、貓和猴子。在一個實施方案中，分泌蛋白質(zhì)組可源自酵母、細(xì)菌、植物或動物。
[0071]可使用本領(lǐng)域可獲得的技術(shù)分析分泌蛋白質(zhì)組用于篩選大量分泌的多肽。例如，從濃縮的培養(yǎng)物上清液中分離出的總分泌多肽可通過雙向凝膠電泳和/或多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(Ι-DE/MudPIT)進(jìn)行分析。可通過任何一種蛋白質(zhì)純化柱從分泌蛋白質(zhì)組分析多肽，如離子交換柱、疏水交互作用柱、凝膠過濾柱、親和層析柱和反相柱。
[0072]在一個實施方案中，分析正常的酵母細(xì)胞生長過程中制備的總分泌多肽(酵母分泌蛋白質(zhì)組)。正常的細(xì)胞生長是指細(xì)胞培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基(如0.67%無氨基酸的酵母含氮堿基、0.5%酪蛋白水解物、2%葡萄糖和0.002%尿嘧啶)?？墒褂酶淖兊臈l件，所述條件可包括用不同的碳源替代葡萄糖，如半乳糖、木糖、果糖、甘露糖、蔗糖、棉子糖和纖維二糖。改變的條件還可包括限制培養(yǎng)基中任何組分的水平，如氮或磷。
[0073]術(shù)語“大量 分泌”是指分泌多肽的水平達(dá)到至少40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %或70%的分泌蛋白質(zhì)組。大量分泌多肽可通過PAI (蛋白豐富指數(shù)，protein abundanceindex)確定(Rappsilber 等人,Genome Res.12:1231-45 (2002)),其可與分泌蛋白質(zhì)的量成正比。大量分泌的蛋白的實例列于表1中。
[0074]術(shù)語“過量分泌”被定義為宿主細(xì)胞的多肽分泌水平至少超過用天然啟動子表達(dá)的多肽分泌水平的5X、6X、7X、8X、9X或10X。還可通過與野生型蛋白分泌水平和大量分泌的多肽分泌水平相比，確定過量分泌。例如，野生型酵母在正常細(xì)胞生產(chǎn)過程中，分泌的蛋白不超過20mg/L的分泌水平，然而連接到一個強異源啟動子后，一些這樣的蛋白就過量分泌，分泌水平超過了 20mg/L。
[0075]在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還包括確定用于分泌融合多肽的SFP的最佳大小。SFP的最佳大小可通過缺失分析所述SFP進(jìn)行確定，其中，比較各自含有不同SFP的缺失構(gòu)建體的融合多肽的分泌水平。一些SFP可能具有最佳的大小，從而使其融合多肽的表達(dá)水平可能甚至高于最初鑒定的SFP的表達(dá)水平。與目標(biāo)多肽融合到次優(yōu)的SFP上時目標(biāo)多肽的分泌水平相比，最佳大小的SFP可增加目標(biāo)多肽的分泌水平。SFP的最佳大小可隨目標(biāo)多肽而變，但只要SFP被首次鑒定后，就可使用本申請的方法或本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行確定。
[0076]在一個實施方案中，選擇以親水序列結(jié)束的SFP缺失片段。蛋白的親水結(jié)構(gòu)域通常定位于蛋白表面的附近。因此，SFP和目標(biāo)多肽的結(jié)合點連接可輕易地暴露于兩個多肽之間，使得蛋白酶更易在體外切割連接點而釋放目標(biāo)多肽。[0077]術(shù)語“其片段”，如SFP所使用的，是指含有任意部分的SFP的氨基酸序列的多肽，其中該片段基本保留了誘導(dǎo)與其融合的目標(biāo)多肽分泌的能力。
[0078]本申請中所用的術(shù)語“基本上保留誘導(dǎo)與其融合的目標(biāo)多肽分泌的能力”是指保留原始SFP的誘導(dǎo)與其融合的目標(biāo)多肽分泌的能力至少50%的片段或其衍生物。在一些實施方案。至少保留60、65、70、75、80、85、90或95 %誘導(dǎo)與其融合的目標(biāo)蛋白分泌的能力。誘導(dǎo)目標(biāo)多肽分泌的能力可通過本領(lǐng)域公知和前述的常規(guī)技術(shù)來確定。
[0079]術(shù)語“其衍生物”，如SFP所使用的，是指由與SFP的氨基酸序列至少70 %相同的氨基酸序列組成的多肽，其中該多肽基本上保留誘導(dǎo)與其融合的目標(biāo)多肽分泌的能力。在一些實施方案中，該衍生物包含與SFP的氨基酸序列至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% —致性的氨基酸序列。該衍生物還可包含對SFP氨基酸序列的增加、刪除、取代或其組合。衍生物可包括用1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11-15、16-20、21-25、26-30增加、取代或缺失的突變多肽。增加或取代還包括使用非天然產(chǎn)生的氨基酸。
[0080]SFP的衍生物的實例包括但不限于:缺失突變(如單向突變?nèi)笔?、增加功能序列(如糖基化位點、限制性酶切位點)和缺失或增加(如交換)SFP中鑒定的前導(dǎo)序列或前序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用常規(guī)的誘變技術(shù)，如文所引的參考文獻(xiàn)中所述，制備SFP的衍生物或編碼SFP的核酸的衍生物，并且鑒定基本保留誘導(dǎo)與其融合的目標(biāo)多肽的分泌能力的衍生物。
[0081]在一個實施方案中，用本發(fā)明的方法鑒定SFP或其衍生物或片段。在另一個實施方案中，編碼SFP的核苷酸序列選自下述:BGL2 (SEQ ID NO: 62)、GAS3 (SEQ ID NO:63),GAS5 (SEQ ID NO:64)、PSTl(SEQ ID NO:65)、SCW4(SEQ ID NO:66)、SCWlO(SEQ ID NO:67)、SIMI(SEQ ID N0:68)、UTHl(SEQ ID NO:69)、YGPI(SEQ ID NO:70)、YPSI(SEQ ID NO:71)和ZPSl (SEQ ID NO: 72)。在另一個實施方案中，SFP選自下述:BGL2 (SEQ ID NO: 80)、GAS3 (SEQID N0:81)、GAS5(SEQ ID NO:82)、PSTl (SEQ ID NO:83)、SCW4 (SEQ ID NO:84)、SCWlO (SEQID NO:85),SIMI(SEQ ID NO:86)、UTHl(SEQ ID NO:87)、YGPl(SEQ ID NO:88)、YPSI(SEQ IDNO:89)和 ZPSl (SEQ ID NO:90)。
[0082]本發(fā)明的方法可使用術(shù)語“目標(biāo)多肽”或其衍生物，它們?yōu)楸黄谕懈咚街亟M表達(dá)的多肽。術(shù)語“其衍生物”如所用于“目標(biāo)多肽”，是指由與多肽的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列組成的多肽，其中該多肽基本上保留誘導(dǎo)與其融合的目標(biāo)多肽分泌的能力。在一些實施方案中，該衍生物包含與目標(biāo)多肽的氨基酸序列至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的氨基酸序列。該衍生物還可包含對目標(biāo)多肽的氨基酸序列的增加、缺失、取代或其組合。衍生物可包括用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15、16-20、21-25、26-30增加、取代或缺失的突變多肽。增加或取代還包括使用非天然產(chǎn)生的氨基酸。
[0083]目標(biāo)蛋白或目標(biāo)多肽的衍生物的實例包括但不限于:缺失突變(如單向突變?nèi)笔?、增加功能序列(如糖基化位點、限制性酶切位點)和缺失或增加(如交換)目標(biāo)多肽中鑒定的前導(dǎo)序列或前序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用常規(guī)的誘變技術(shù)，如本文所引的參考文獻(xiàn)中所述，制備目標(biāo)多肽的衍生物或編碼目標(biāo)多肽的核酸的衍生物，并且鑒定基本保留誘導(dǎo)與其融合的目標(biāo)多肽的分泌能力的衍生物。[0084]如目標(biāo)多肽融合到SFP，目標(biāo)多肽和SFP就不是同樣的天然存在蛋白的多肽。目標(biāo)多肽可為正以研究目的而研究的多肽或正以商業(yè)為目的如制藥和產(chǎn)業(yè)用途而生產(chǎn)的多肽。目標(biāo)多肽可來自于任何植物、動物或微生物，只要它可以被核酸編碼，可以是天然發(fā)生的或經(jīng)過修飾的。在一個實施方案中，目標(biāo)多肽為人類蛋白。在另一個實施方案中，目標(biāo)多肽為細(xì)胞因子、血清蛋白、集落刺激因子、生長因子、激素或酶。
[0085]例如，目標(biāo)多肽可選自下述:白細(xì)胞介素、凝結(jié)因子、干擾素-α、_β或-Y、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、組織生長因子、上皮生長因子、TGFa、TGFiK表皮生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、促卵泡激素、促甲狀腺激素、抗利尿激素、色素性激素、甲狀旁腺激素、促黃體生成激素釋放激素、碳水化合物特異性酶、蛋白水解酶、脂肪酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶、免疫球蛋白、細(xì)胞因子受體、乳鐵蛋白、磷脂酶Α2激活蛋白、胰島素、胖瘤壞死因子、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽、腦啡肽、生長調(diào)節(jié)素、促紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳素、絨毛膜促性腺激素、組織纖溶酶原激活物、生長激素釋放肽、胸腺體液因子、抗癌肽或抗菌肽。具體實例包括但不限于:人白細(xì)胞介素_2(hIL-2)、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4 (EXD4)、胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)、甲狀腺激素(PTH)、人白細(xì)胞介素-1 β、人白細(xì)胞介素-6、人白細(xì)胞介素-32α、-32β或32y、VII因子、VIII因子、IX因子、人血清白蛋白、人干擾素_ a、-β或-Y、人粒細(xì)胞集落刺激因子、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、人生長激素(hGH)、人血小板衍生生長因子、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、人表皮生長因子(EGF)、人胰島素樣生長因子、人神經(jīng)生長因子、人轉(zhuǎn)化生長因子β -1、人促卵泡激素、葡萄糖氧化酶、葡聚糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、萄糖醛酸酶、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨基酶、過氧化物歧化酶、內(nèi)毒素酶、過氧化氫酶、糜蛋白酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶、膽紅素氧化酶、牛半乳糖-1-磷酸尿苷酸轉(zhuǎn)移酶、水母綠色熒光蛋白、南極假絲酵母脂肪酶B、假絲酵母脂肪酶、真菌氯過氧化物酶、半乳糖苷酶、解離酶、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、海藻糖合酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、木聚糖酶、植酸酶、人乳鐵蛋白、人促紅細(xì)胞生成素、人對氧磷酶、人生長分化因子15、人半乳凝素-3結(jié)合蛋白、人絲氨酸蛋白酶抑制劑、Kunitz2型、人Janus激酶2、人FMS樣酪氨酸激酶3配體、人YM1&2、人CEM1、人二?；视王；D(zhuǎn)移酶、人瘦蛋白、人mL259、人蛋白水解酶3、人溶菌酶、人DEAD盒蛋白41、人依托泊苷誘導(dǎo)蛋白24、小鼠半胱天冬酶1、牛血管生成因子和蚯蚓蚓激酶。
[0086] 在一個實施方案中，目標(biāo)多肽為很難用常規(guī)的重組制備方法制備的多肽，也即不能制備或僅以很低的水平進(jìn)行制備。在另一個實施方案中，目標(biāo)多肽為易于用已知的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行制備的多肽，但期望其獲得更高水平的表達(dá)。
[0087]在一個實施方案中，本發(fā)明的融合多肽是指包含分泌多肽以任何順序融合到目標(biāo)多肽而形成的多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含融合到目標(biāo)多肽的本發(fā)明SFP的分離融合多肽。
[0088] 術(shù)語“融合的”在本申請中是指重組制備的融合多肽。在一個實施方案中，融合多肽包含融合到目標(biāo)多肽的分泌多肽，其中分泌多肽和目標(biāo)多肽以任何順序進(jìn)行融合。在另一個實施方案中，SFP在目標(biāo)多肽的N-末端或C-末端進(jìn)行融合。SFP和目標(biāo)多肽可使用或不使用插入的氨基酸如由連接DNA編碼的氨基酸進(jìn)行融合。在一些實施方案中，SFP和目標(biāo)多肽的距離可為O~10 ;0~20 ；0~30 ;0~40個或更多氨基酸。在一些實施方案中，融合多肽包含蛋白酶識別序列和或親和標(biāo)簽。
[0089]在一個實施方案中，分離的融合多肽包括含有SEQ ID NO:1的176-213位氨基酸的親水(HL)結(jié)構(gòu)域的SFP或其片段或衍生物和目標(biāo)多肽。在一個實施方案中，修飾的HL結(jié)構(gòu)域由SEQ ID N0:45編碼。
[0090]本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的SFP重組制備目標(biāo)蛋白的方法。在一個實施方案中，該方法包括:制備構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼目標(biāo)蛋白的核苷酸序列，該核苷酸序列可操作性地連接至編碼SFP或其衍生物或片段的核苷酸序列；用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；在宿主細(xì)胞生成和分泌目標(biāo)蛋白的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；再從所述的目標(biāo)多肽中分離出SFP。
[0091]目標(biāo)蛋白可使用任何本領(lǐng)域已知表達(dá)系統(tǒng)重組制備。優(yōu)選地，目標(biāo)蛋白在例如細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中重組表達(dá)。重組表達(dá)包括:制備包含編碼目標(biāo)蛋白的多核苷酸的載體，運送載體至宿主細(xì)胞，在目標(biāo)蛋白表達(dá)條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以及分離目標(biāo)蛋白。制備重組載體和使用同樣的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、在宿主細(xì)胞中復(fù)制載體和表達(dá)生物活性外源多肽和蛋白質(zhì)的方法和材料在前面討論且描述于Sambrook等人，MolecularCloning(《分子克隆》)，第三版,Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)，2001和Ausubel 等人,Current Protocols in Molecular Biology (《現(xiàn)代分子生物學(xué)教程》)，Johnffiley&Sons, New York第三版(2000),均以參閱的方式納入本申請。
[0092]目標(biāo)蛋白可從宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中分離出來，通過本領(lǐng)域已知的純化方法例如常規(guī)色譜方法包括免疫親和層析法、受體親和層析法、流水作用色譜法、凝集素親和層析法、尺寸排阻過濾法、陽離子或陰離子交換色譜法、高效液相色譜法(HPLC)、反相HPLC等。其它純化方法還包括那些預(yù)期多肽作為融合多肽被表達(dá)和純化的方法，其中所述的融合多肽具有特定的親和 肽、標(biāo)簽、標(biāo)記或被特定結(jié)合配偶體或試劑識別的螫合部分。經(jīng)純化的蛋白質(zhì)可斷裂以獲得預(yù)期蛋白，或可作為完整的融合蛋白被保存。作為斷裂過程的結(jié)果，親和標(biāo)簽組分的斷裂可生成具有其它氨基酸殘基的預(yù)期蛋白質(zhì)形式。在一個實施方案中，親和標(biāo)簽為GST、MBP、NusA、硫氧還蛋白、泛素、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD、S-標(biāo)簽或其組合。
[0093]本發(fā)明的目標(biāo)多肽與分泌融合配偶體以融合形式在胞外制備，并可通過體外蛋白酶處理從SFP中分離出來。如果被分離的目標(biāo)蛋白在采用分離操作后沒有生物活性，可使用多種方法使多肽發(fā)生“重折疊”或轉(zhuǎn)化成其三級結(jié)構(gòu)并生成二硫鍵使之恢復(fù)生物活性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法包括在特定濃度的離液劑存在下將溶解的多肽的PH調(diào)節(jié)至通常大于7。離液劑的選擇類似于包涵體增溶作用的選擇，但是通常濃度較低且不必要和增溶作用使用同種離液劑。可能需要使用還原劑或特定比例的還原劑和其氧化形式，以得到特定的氧化還原電位使蛋白質(zhì)的半脫氨酸橋形成中可發(fā)生二硫鍵的轉(zhuǎn)移。一些常用的氧化還原對包括半脫氨酸/胱胺、谷胱苷肽(GSH)/二硫代谷胱甘肽、氯化銅、二硫蘇糖醇(DTT)/二噻烷DTT、2-巰基乙醇(bME)/二硫代-b(ME)。為了增加重折疊效率，可能有必要使用助溶劑，例如甘油、多種分子量的聚乙二醇和精氨酸。
[0094]術(shù)語“多核苷酸”包括單個核酸以及多個核酸，是指分離的核酸分子或構(gòu)建體，如信使RNA (mRNA)、病毒來源的RNA或質(zhì)粒DNA (pDNA)。多核苷酸可包括常規(guī)的磷酸二酯鍵或非常規(guī)的鍵(如酰胺鍵，例如發(fā)現(xiàn)于肽核酸中(PNA))。術(shù)語“核酸”是存在于多核苷酸的指任何一種或多種核酸片段，如DNA或RNA片段。“分離的”核酸或多核苷酸是指從它的原始環(huán)境中移取的核酸分子，DNA或RNA。例如，載體中所含的編碼治療用多肽的重組多核苷酸被認(rèn)為是為本發(fā)明目的的分離的重組多核苷酸。分離的多核苷酸的進(jìn)一步的實例包括異源宿主細(xì)胞中維持的重組多核苷酸或溶液中的(部分地或大體上地)純化的多核苷酸。分離的RNA分子包括本發(fā)明體內(nèi)或體外的RNA轉(zhuǎn)錄本以及本申請公開的瘟病毒載體的正鏈和負(fù)鏈形式和雙鏈形式。
[0095]本發(fā)明分離的多核苷酸或核酸包括該合成制備的分子。此外，多核苷酸或核酸可為或可包括調(diào)控元件，如啟動子、核糖體結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄終止子。
[0096]本申請使用的“編碼區(qū)域”為含有翻譯成氨基酸的密碼子的核酸的一部分。盡管“終止子”(TAG、TGA或TAA)不翻譯成氨基酸，但它被認(rèn)為是編碼區(qū)域的一部分，但如果存在任何側(cè)翼序列，如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子、5’和3’非編碼區(qū)等則不是編碼區(qū)的一部分。本發(fā)明的兩個或多個編碼區(qū)可存在于單個的多核苷酸構(gòu)建體如在單個載體中，或分別存在于多核苷酸構(gòu)建體如分別(不同)的載體中。此外，任何載體可含有單個編碼區(qū)或可包含兩個或多個編碼區(qū)，如本發(fā)明的載體可編碼一個或多個多肽，其通過蛋白酶裂解翻譯后或共翻譯分離出最終的多肽。此外，本發(fā)明的載體、多核苷酸、或核酸可編碼異源編碼區(qū)，可以融合或不融合到本發(fā)明的第一或第二編碼區(qū)或其變體或衍生物。異源編碼區(qū)包括不受限的特殊的元件或基序，如分泌的信號肽或異源功能域。
[0097]在某些實施方案中，多核苷酸或核酸為DNA。對于DNA，多核苷酸包括核酸，其通常編碼包括啟動子和/或其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件可操作地與一個或多個編碼區(qū)相連的多肽。當(dāng)基因產(chǎn)物，如多肽的編碼區(qū)可操作地與一個或多個調(diào)節(jié)序列連接時，這樣在調(diào)控序列的影響或控制下進(jìn)行基因產(chǎn)物的表達(dá)。如果啟動子功能的誘導(dǎo)導(dǎo)致了編碼所期望的基因產(chǎn)物的mRNA的誘導(dǎo)，如 果兩個DNA片段之間的自然的連接沒有干擾表達(dá)調(diào)節(jié)序列直接表達(dá)基因產(chǎn)物的能力，或沒有干擾的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄DNA模板的能力，那么兩個DNA片段(如多肽編碼區(qū)和與之相連的啟動子)是“可操作性地連接”的，因此，如果啟動子可影響核酸的轉(zhuǎn)錄，那么啟動子區(qū)是可操作性地與編碼多肽的核酸相連。啟動子可以為細(xì)胞特異性啟動子，其基本上只在預(yù)定的細(xì)胞內(nèi)的指導(dǎo)DNA的大量轉(zhuǎn)錄。除啟動子外的其它的轉(zhuǎn)錄控制元件，如增強子、操作子、抑制子和轉(zhuǎn)錄終止信號可與多核苷酸可操作性地相連，以指導(dǎo)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。本申請公開了合適的啟動子和其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域。
[0098]各種轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。它們包括但不限于:在脊椎動物中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域，例如不限于巨細(xì)胞病毒的啟動子和增強元件(如與內(nèi)含子A相連的即刻早期啟動子)、猴病毒40(如早期啟動子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(如勞氏肉瘤病毒)。其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域包括來自于脊椎動物基因，如肌動蛋白、熱激蛋白、牛生長激素和兔β_球蛋白的啟動子以及其它可在真核生物細(xì)胞中控制基因表達(dá)的序列。此外合適的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域包括組織特異性啟動子和增強子以及淋巴因子可誘導(dǎo)啟動子(如可被干擾素或白細(xì)胞介素誘導(dǎo)的啟動子)。
[0099]同樣的，各種翻譯控制元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。它們包括但不限于:核糖體結(jié)合位點、翻譯起始和終止密碼子和源自病毒系統(tǒng)的元件(特別為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點，或IRES,也被稱為CITE序列)。
[0100]本發(fā)明的多核苷酸可包括RNA，如信使RNA(mRNA)形式的。本發(fā)明的RNA可以是單鏈或雙鏈的。
[0101]本發(fā)明的多核苷酸和核酸編碼區(qū)域可與其它的編碼分泌或信號多肽的編碼區(qū)域相關(guān)，其指導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽分泌。根據(jù)信號假說，哺乳動物細(xì)胞分泌的蛋白具有信號肽或分泌前導(dǎo)序列，其在穿越粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生長中蛋白鏈開始輸出時裂解自成熟蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，通過脊椎動物的細(xì)胞分泌的多肽通常具有融合到多肽N-末端的信號肽，其裂解自全部或“全長”多肽中而產(chǎn)生分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些實施方案中，使用了天然的信號肽如免疫球蛋白的重鏈或輕鏈信號肽，或使用與多肽可操作性相連、保留指導(dǎo)多肽分泌能力的序列的功能性衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能性衍生物。例如，野生型前導(dǎo)序列可被人組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)或鼠葡糖酸醛酶的前導(dǎo)序列取代。
[0102]術(shù)語“構(gòu)建體”是指非天然存在的核酸分子。構(gòu)建體是編碼融合多肽的多核苷酸。在一個實施方案中，構(gòu)建體編碼含有SFP或候選的SFP和目標(biāo)多肽的融合多肽。構(gòu)建體可進(jìn)一步包括環(huán)狀或線性載體，并可與其它多核苷酸組合，如進(jìn)行同源重組。[0103]如本申請所使用的，術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運與其相連的另一個核酸的核酸分子。一種載體是“質(zhì)粒”，它是指能連接其它DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種載體是病毒載體，其中其它DNA片段可連接到該病毒基因組中。某些載體能夠在其引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌的復(fù)制起始區(qū)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)一旦引入至宿主細(xì)胞后就整合至宿主細(xì)胞的基因組中從而隨著宿主基因組復(fù)制。本發(fā)明的載體能夠指導(dǎo)編碼與它們可操作性連接的目標(biāo)蛋白基因的表達(dá)。這些載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。一般而言，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可互換使用，因為質(zhì)粒是載體的最常用形式。但是，本發(fā)明也包括具有相同功能的其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
[0104]載體DNA可通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入到原核或真核細(xì)胞內(nèi)。如本申請所使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”是指各種本領(lǐng)域公知的將外源核酸(如DNA)引入到宿主DNA的技術(shù),包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀法、DEAE-dextran介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電轉(zhuǎn)法。適合轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法可見Sambrook等人的(MOLE⑶LAR CLONING:ALABORATORY MANUAL.2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)和其它實驗室手冊。
[0105]已知的是，哺乳動物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染取決于表達(dá)載體和所用的轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅有一小部分的細(xì)胞可將外源DNA整合到其基因組中。為鑒定和選擇這些整合體，通常將編碼選擇標(biāo)記(如抗抗生素)的基因隨目標(biāo)基因一起導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)。各種選擇標(biāo)記包括那些抗藥標(biāo)記，如G418、潮霉素和甲胺嘌呤?？蓪⒕幋a選擇標(biāo)記的基因和編碼目標(biāo)多肽的基因在同一個載體或在各自的載體上導(dǎo)入宿主細(xì)胞。用導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞可通過藥物選擇、營養(yǎng)缺陷型的選擇、基質(zhì)組合物、碳源選擇或其它本領(lǐng)域公知的方法(如含有選擇標(biāo)記基因的成活，而其它細(xì)胞死亡)鑒別。
[0106]在一個實施方案中，編碼本發(fā)明的方法中所使用的多肽或其片段或衍生物的核苷酸序列還可在5’端和3’端包含用于與本發(fā)明的線性載體進(jìn)行體內(nèi)同源重組的DNA。當(dāng)5’端和3’端DNA共轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)時，它們能提供足夠的序列以允許編碼多肽或其片段或衍生物的核苷酸序列和線性載體之間進(jìn)行體內(nèi)重組。在一個實施方案中，5’端和3’端DNA各自包含至少20個與線性載體序列重疊的堿基對，如至少30個或40個堿基對?？墒褂贸Ｒ?guī)的重組技術(shù)添加5’和3’ DNA,如PCR和/或限制性內(nèi)切酶消化和連接。
[0107]本發(fā)明的多核苷酸還可編碼親和標(biāo)簽，如GST、MBP、NusA、硫氧還蛋白、泛素、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP, CBD、或S-標(biāo)簽。親和標(biāo)簽可由連接DNA編碼或由本發(fā)明其它部分的多核苷酸編碼，如融合蛋白編碼區(qū)域的5’或3’部分。
[0108]本發(fā)明的多核苷酸還可包括連接DNA。在一個實施方案中，連接DNA編碼連接肽。
[0109]本發(fā)明的連接DNA可足夠長，并與線性載體的核苷酸序列部分具有足夠的一致性，從而在它們共轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)后，允許編碼多肽的核苷酸序列和線性載體之間發(fā)生體內(nèi)重組。在一個實施方案中，連接DNA的長度至少為20個堿基對，或至少長度為30個或40個堿基對。在進(jìn)一步的實施方案中，連接DNA至少與相應(yīng)的線性載體的序列具有80%的一致性，例如至少85 %、90 %、95 %或99 %的一致性。
[0110]在一個實施方案中，連接DNA編碼蛋白酶識別序列，從而允許在SFP和目標(biāo)多肽的連接點發(fā)生裂解。例如，連接DNA可編碼酵母kex2p-或Kex2樣蛋白酶識別序列(如含有 Lys-Arg、Arg-Arg 或 Leu-Asp-Lys-Arg(SEQ ID NO:74)的氨基酸)、哺乳動物弗林蛋白酶識別序列(如含有Arg-X-X-Arg的氨基酸序列)、因子Xa-識別序列(如含有Ile-Glu-Gly-Arg(SEQ ID NO: 75)的氨基酸序列)、腸激酶-識別序列(如含有Asp-Asp-Lys的氨基酸序列)、枯草桿菌蛋白酶-識別序列(如含有Ala-Ala-His-Tyr (SEQ ID NO:76)的氨基酸序列)、煙草蝕刻病毒蛋白酶-識別序列(如含有Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly (SEQ ID NO: 77)的氨基酸)，泛素水解酶-識別序列(如含有Arg-Gly-Gly的氨基酸)或凝血酶-識別序列(如含有Arg-Gly-Pro-Arg (SEQ IDNO:78)的氨基酸)。
[0111]在連接子的蛋白酶位點內(nèi)或在分泌多肽或目標(biāo)多肽內(nèi)，優(yōu)選通過內(nèi)源宿主蛋白酶避免融合多肽的不想要的裂解。同樣，在目標(biāo)多肽或分泌多肽或SFP或其片段或衍生物內(nèi)，優(yōu)選通過用于從目標(biāo)多肽中裂解分泌多肽的蛋白酶避免裂解。因此，如果作為編碼融合多肽的多核苷酸一部分，編碼蛋白酶識別序列的連接DNA被轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞時，則所述宿主細(xì)胞優(yōu)選不表達(dá)識別連接子內(nèi)蛋白酶序列的蛋白酶。宿主細(xì)胞既可以天然地不表達(dá)蛋白酶，或宿主細(xì)胞也可以經(jīng)過修飾而不表達(dá)蛋白酶(如kex2突變體宿主細(xì)胞、Kex2樣蛋白酶突變體宿主細(xì)胞和弗林蛋白酶突變體宿主細(xì)胞)ο如果融合多肽包含分泌多肽和目標(biāo)多肽，則分泌多肽或SFP或其片段或衍生物和/或目標(biāo)多肽可天然不包含宿主蛋白酶識別序列，或分泌多肽或SFP或其片段和衍生物和/或目標(biāo)多肽可以經(jīng)過修飾而不含有被宿主蛋白酶識別的序列。如果融合多肽包含分泌多肽或SFP或其片段或衍生物、目標(biāo)多肽和含有蛋白酶識別序列的肽連接子，則分泌序列或SFP或其片段或衍生物和/或目標(biāo)多肽可天然地不含有蛋白酶識別序列，或分泌多肽或SFP或其片段或衍生物和/或目標(biāo)多肽可以經(jīng)過修飾而不含有被肽連接子的蛋白酶識別的序列識別的序列。
[0112]在另一個實施方案中，連接DNA編碼親和標(biāo)簽，如GST、MBP、NusA、硫氧還蛋白、泛素、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD 或 S_tag.[0113]在進(jìn)一步的實施方案中，連接DNA編碼限制性內(nèi)切酶識別位點和蛋白酶識別序列(如kex2p樣蛋白酶或kex-2p_識別序列)。[0114]原核生物中多肽表達(dá)的實施，可使用含有指導(dǎo)目標(biāo)蛋白-報告蛋白融合的表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體。適合的大腸桿菌表達(dá)載體的實例包括P Tr C (Amrann等，Gene69:301-315 (1988))和 pET (Studier 等，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODSIN ENZYM0L0GY185, Academic Press,San Diego, Calif.(1990)60-89)。
[0115]為了在酵母細(xì)胞中表達(dá),合適的酵母表達(dá)載體包括,但不限于pYepSecl (Baldari等，EMB0 J.6:229-234 (1987)), pMFa(Kurjan 等，細(xì)胞 30:933-943 (1982))、pJRY88 (Schultz 等，Gene54:113-123(1987))，pYES2(Invitrogen Corporation, SanDiego, Calif.)和 picZ(Invitrogen Corp, San Diego, Cal.)。
[0116]為了在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，可使用桿狀病毒表達(dá)載體?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如SF9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等，Mol.Cell.Biol.3:2156-2165 (1983))和 pVL 系列(Lucklow 等，Virologyl70:31-39 (1989))。
[0117]在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞而載體是哺乳動物表達(dá)載體。哺乳動物表達(dá)載體的實例包括 PCDM8 (Seed, Nature329:840 (1987))和 pMT2PC (Kaufman等，EMBO J.6:187-195 (1987))。當(dāng)用于哺乳動物細(xì)胞時，表達(dá)載體的調(diào)控功能常常由病毒調(diào)控元件提供。例如，通常使用的啟動子來源于多瘤腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。其它適合的用于原核和真核細(xì)胞兩者的表達(dá)系統(tǒng)參見例如Sambrook等人，MOLE⑶LARCLONING:A LABORATORY MANUAL.2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，1989。
[0118]優(yōu)選的載體包括但不限于:質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、游離基因、病毒顆?；虿《竞驼系腄NA片段(例如通過同源重組可整合至宿主基因組的片段)。優(yōu)選的病毒顆粒包括但不限于腺病毒、桿狀病毒、細(xì)小病毒、皰疫病毒、痘病毒、腺相關(guān)病毒、塞姆利基森林病毒、痘苗病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。優(yōu)選的表達(dá)載體包括但不限于:pcDNA3 (Invitrogen)和pSVL (PharmaciaBiotech)。其它表達(dá)載體包括但不限于:pSP0RTTM載體、pGEMTM載體(Promega)、pPROEX載體 TM (LT1、Besda、MD)、BluescriptTM 載體(Strata 基因)、pQETM 載體(Qiagen)、pSE420TM(Invitrogen)和 pYES2TM(Invitrogen)。
[0119]在一個實施方案中，表達(dá)載體是復(fù)制型DNA構(gòu)建體，其中編碼目標(biāo)多肽的DNA序列可操作性地連接或結(jié)合至能夠影響目標(biāo)多肽在合適宿主中表達(dá)的合適調(diào)控序列中。當(dāng)它們的功能彼此相關(guān)時，DNA區(qū)域可操作性地連接或結(jié)合。例如，如果啟動子能調(diào)控該編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則將該啟動子可操作性地連接或結(jié)合于編碼序列。擴增載體不需要表達(dá)調(diào)控域，而相反，僅需要由復(fù)制起始區(qū)賦予的在宿主中進(jìn)行復(fù)制的能力和幫助識別轉(zhuǎn)化體的選擇基因。表達(dá)載體對調(diào)控序列的需要取決于選擇的宿主和選擇的轉(zhuǎn)化方法。一般來說，調(diào)控序列包括但不限于:轉(zhuǎn)錄啟動子、增強子、控制轉(zhuǎn)錄的可選操縱子序列、多腺苷酸化信號、編碼適合的結(jié)合核糖體的mRNA的序列和調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。這些調(diào)控序列描述于例如，Goeddel,GENR EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYM0L0GY185, Academic Press, SanDiego，Calif.( 1990)。調(diào)控序列包括那些在多種類型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達(dá)和那些僅在特定宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)(如組織特異性調(diào)控序列)的調(diào)控序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解表達(dá)載體的設(shè)計取決于所選擇的要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、預(yù)期的蛋白質(zhì)表達(dá)的水平等等這些因素。
[0120]本發(fā)明的表達(dá)載體可導(dǎo)入宿主細(xì)胞從而制備蛋白質(zhì)或肽，包括本文描述的由核酸編碼的融合蛋白或肽。優(yōu)選載體含有可被宿主生物體識別的啟動子。
[0121]在一個實施方案中，本發(fā)明的啟動子是強異源啟動子，其用于重組制備外源多肽。異源啟動子可以是誘導(dǎo)型或組成型啟動子。優(yōu)選異源啟動子為那些用于常規(guī)制備蛋白質(zhì)的啟動子，如上文所述的那些。本發(fā)明的異源啟動子可分為天然或野生型SFP啟動子。
[0122]本發(fā)明的啟動子序列可以是原核、真核或病毒的序列。合適的原核序列實例包括 λ 嗤菌體的 PR 和 PL 啟動子(The bacteriophage Lambda, Hershey, A.D., Ed., ColdSpring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1973)其以參閱的方式全文并入本申請;λ II, Hendrix, R.ff., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1980),其以參閱的方式全文并入本申請)；大腸桿菌的trp、recA、熱休克和IacZ啟動子以及SV40早期啟動子(Benoist等，Nature, 290:304-310 (1981)，其以參閱的方式全文并入本申請)。對于酵母，合適的啟動子的實例包括但不限于:GAPDH、PGK、ADH、PHOS, GALI和GAL10。其它啟動子包括但不限于:小鼠乳腺瘤病毒、人免疫缺陷癥病毒長末端復(fù)制、maloney病毒、巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子、EB病毒(Epstein Bar virus)、勞氏肉瘤病毒、人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌Ife和人金屬硫蛋白。
[0123]其它調(diào)控序列也可包括在優(yōu)選的載體中。合適的調(diào)控序列的實例以噬菌體MS-2的復(fù)制酶基因和λ噬菌體的cll基因的夏因-達(dá)爾加諾序列為代表。
[0124]此外，合適的表達(dá)載體可包括允許篩選轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的適當(dāng)標(biāo)記。所選宿主的轉(zhuǎn)化使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知和先前Sambrook等人描述的各種技術(shù)中的任意一種來進(jìn)行。
[0125]復(fù)制起始區(qū) 還可通過構(gòu)建載體以包括外源的起始區(qū)來提供或通過宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機制提供，如果將載體整合入宿主細(xì)胞染色體，后者就足夠了?；蛘?，相比使用含有病毒復(fù)制起始區(qū)的載體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用用選擇性標(biāo)記和目標(biāo)蛋白DNA共轉(zhuǎn)化的方法來轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞。合適標(biāo)記的一個實例是二氫葉酸還原酶(DHFR)或胸苷激酶(參見美國專利4，399,216)。
[0126]編碼目標(biāo)蛋白的核苷酸序列可用載體DNA利用常規(guī)技術(shù)重組，包括平末端或粘末端(staggered)連接、限制性酶消化來提供適當(dāng)?shù)哪┒?、適當(dāng)補平粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免非預(yù)期的連接以及用適當(dāng)?shù)倪B接酶連接。這些操作的技術(shù)先前由Sambrook等人公開且在本領(lǐng)域內(nèi)公知。構(gòu)建哺乳動物表達(dá)載體的方法公開于例如Okayama等人，Mol.Cel1.Biol.3: 280 (1983), Cosman 等，Mol.1mmunol.23: 935 (1986), Cosman等，Nature312:768 (1984)、EP_A_0367566和W091/18982，它們各自均以參閱的方式全文并入本申請。
[0127]本發(fā)明所用的宿主細(xì)胞可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、真菌、(例如酵母)、植物或動物(例如哺乳動物或昆蟲)細(xì)胞。合適的酵母細(xì)胞包括念珠菌屬、德巴利酵母屬、漢森酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬、耶羅威亞酵母屬、酵母菌屬、許旺酵母屬和Arxula。具體實例包括產(chǎn)朊假絲酵母、博伊丁假絲酵母、白色念珠菌、產(chǎn)乳糖酶酵母、巴斯德畢赤酵母、樹干畢赤酵母、粟酒裂殖酵母、釀酒酵母、多形漢森酵母、解脂耶氏酵母、西方許旺酵母和Arxula adeninivorans。其它合適的真菌包括曲霉屬、青霉屬、根霉屬和木霉屬?？捎米魉拗骷?xì)胞的細(xì)菌包括埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬和桿菌屬。合適的植物宿主細(xì)胞包括擬南芥、玉米、煙草和馬鈴薯。動物細(xì)胞包括人、小鼠、大鼠、兔、狗、貓、猴和昆蟲。實例包括CHO、COSl、C0S7、BSCl、BSC40、BMTlO和Sf9
細(xì)胞。在一個具體的實施方案中，宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞。
[0128]本發(fā)明的多核苷酸可導(dǎo)入宿主細(xì)胞作為環(huán)狀質(zhì)粒的部分或作為包含分離蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的線性DNA或病毒載體。本領(lǐng)域公知且常規(guī)進(jìn)行的將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔法、核注射或與載體如脂質(zhì)體、膠束、血影細(xì)胞和原生質(zhì)體融合。
[0129]任何可快速有效檢測的報告蛋白可用于本發(fā)明。在一個實施方案中，為了使篩選過程自動化，報告蛋白具有可被積極選擇的活性。在另一個實施方案中，報告蛋白是分泌至細(xì)胞外間隙的蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)化酶、蔗糖酶、纖維素酶、木聚糖酶、麥芽糖酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、蜜二糖酶)、磷酸酶(例如ΡΗ05)、β -內(nèi)酰胺酶、脂肪酶或蛋白酶。在一個具體的實施方案中，分泌蛋白允許細(xì)胞在特定底物上生長。作為哺乳動物細(xì)胞中報告基因系統(tǒng)的實例，CD2/新霉素-磷酸轉(zhuǎn)移酶(Ceo)基因可用作含有抗生素G418的培養(yǎng)基中的分泌報告基因以捕獲在小鼠胚胎干細(xì)胞中的分泌通路基因(De-Zolt 等，Nucleic Acid Res.34: e25 (2006))。
[0130]在一個實施方案中，宿主細(xì)胞是酵母，報告蛋白是轉(zhuǎn)化酶，轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞根據(jù)它們在蔗糖或蜜三糖上生長的能力來選擇。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是酵母，報告蛋白是蜜二糖酶；轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞根據(jù)它們在蜜二糖上生長的能力來選擇。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是酵母，報告蛋白是淀粉酶(例如內(nèi)淀粉酶、外淀粉酶、β_淀粉酶或葡萄糖淀粉酶)，酵母細(xì)胞是非淀粉分解的，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞根據(jù)它們降解淀粉的能力來篩選。在另一個實施方案中，鑒定具有報告蛋白活性的細(xì)胞的步驟通過使用具有生長抑制因子抗性的報告蛋白來進(jìn)行，例如抗生素。在另一個實施方案中，報告蛋白是能夠目測的蛋白質(zhì)，例如綠色熒光蛋白或熒光素酶。在一個實施方案中，鑒定顯示報告蛋白活性的細(xì)胞的步驟通過使用兩個或多個報告蛋白 例如脂肪酶和轉(zhuǎn)化酶來進(jìn)行。
[0131]本發(fā)明的宿主細(xì)胞不顯示報告蛋白活性。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞不天然表達(dá)報告蛋白。在其它實施方案中，編碼報告蛋白的基因已被全部或部分缺失或已突變以使得報告蛋白不表達(dá)或以無活性形式表達(dá)。使一個細(xì)胞缺乏一種特定蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)公知；并且任何此種方法可用來制備本發(fā)明的宿主細(xì)胞(前述Sambrook等人)。對于酵母來說，報告蛋白缺乏可使用公知的基因置換技術(shù)來引入(Rothstein’Meth.Enzymol.194:281(1991))。
[0132]可使用本領(lǐng)域技術(shù)公知的技術(shù)從任何來源獲得編碼目標(biāo)多肽的核酸，包括從基因組或cDNA中分離、通過PCR擴增或化學(xué)合成。
[0133]可從任何形式的DNA，包括基因組DNA、cDNA、合成的DNA和重組DNA獲得核酸或其片段的文庫。除DNA外，還可使用核酸，包括RNA和非天然存在的核酸?？赏ㄟ^多樣化預(yù)先鑒定核酸片段，如單一缺失、突變、功能性序列的增加(如糖基化位點)或核酸片段之間的前和后信號序列的交換獲得預(yù)先選定的核酸片段文庫。在一個實施方案中，核酸片段大小小于1000堿基對，如小于700、500或300個堿基對。核酸片段的文庫可通過DNA酶切割、DNA合成或重組DNA技術(shù)(如單一缺失、突變)構(gòu)建。
[0134]核酸片段可源自生物的整個基因組，如整個基因組或cDNA文庫。片段還可源自整個基因組的子集，如扣除文庫或一定大小的文庫(sized library)。
[0135]下列實施例用于說明而非限制本發(fā)明的方法和組合物。其它對在臨床治療中經(jīng)常遇到的各種條件和參數(shù)的合適的修飾和調(diào)節(jié)對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，也在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
[0136]實施例
[0137]實施例1確定胞外分泌用YGR106C基因的最佳大小
[0138]本實施例闡釋了胞外分泌所需的YGR106的最佳區(qū)域。如圖1A所示，YGR106C(下稱分泌融合配偶體1，SFP1)蛋白(SEQ ID NO:1)由包含信號肽的256個氨基酸殘基、三個糖基化位點、一個親水性結(jié)構(gòu)域(HL)和一個跨膜結(jié)構(gòu)域組成。
[0139]在GALlO啟動子 的調(diào)控下過量表達(dá)完整的YGR106C基因在培養(yǎng)基中沒有產(chǎn)生YGR106C蛋白。然而，在酵母GALlO啟動子的調(diào)控下，使用C-末端截短形式的YGR106C，在培養(yǎng)基中高水平地分泌出截短的SFPl (SEQ ID NO:1的氨基酸1-213)。
[0140]確定用于分泌的SFPl基因最佳區(qū)域進(jìn)一步鑒定。通過Kyte-Doolittle親水性分析(圖1A)確定幾種SFPl蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，如分泌信號(SEQ ID NO:1的氨基酸1_19)、親水結(jié)構(gòu)域(HL) (SEQ ID NO:1的氨基酸176-213)和跨膜結(jié)構(gòu)域(TM) (SEQ ID NO:1的氨基酸 220-247)。
[0141]構(gòu)建含有具有連續(xù)缺失的SFPl基因的不同載體的重組釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 2805 菌株(Mat a ura3INV2pep4::HIS3canl)并比較各個載體分泌的 SFPl 相關(guān)蛋白(圖1B)。起初，為表達(dá)完整的SFPl蛋白，用PCR引物、含有BamHI位點的正向引物T9F(SEQ ID N0:2)和含有Sail位點的反向引物H159(SEQ ID NO: 3),從釀酒酵母2805基因組DNA擴增出SFPl的開放閱讀框(ORF)。用Pfu聚合酶(Stratagene, USA)或Ex-TaqDNA聚合酶(TaKaRa Korea Biomedical Inc.,韓國首爾)進(jìn)行PCR擴增。PCR條件包括:94°C 變性 5min，94°C 進(jìn)行 25 個擴增循環(huán) 30sec,55°C 30sec 和 72 °C lmin，最后 72°C 延伸7min。擴增出的 SFP10RF 用 BamH1-SalI 酶切，再亞克隆到 YEGa -HIR525 的 BamH1-SalI 位點(Sohn 等，Process Biochem.30:653 (1995))，生成的質(zhì)粒命名為 YGaT91。
[0142]為表達(dá)C末端缺失TM結(jié)構(gòu)域的截短SFPl蛋白，用正向引物T9F(SEQ ID NO:2)和反向引物H160(SEQ ID N0:4)，從YGaT91載體中擴增出SFPl的基因片段。按照構(gòu)建YGaT91的相同的方法將擴增出的SFPl的基因片段克隆到Y(jié)EG a -HIR525，生成的質(zhì)粒命名為 YGaT92。
[0143]為表達(dá)C末端缺失一半HL結(jié)構(gòu)域的截短的SFPl蛋白，用正向引物T9F(SEQ IDNO: 2)和反向引物H161(SEQ ID NO: 5)，從YGaT91載體中擴增出SFPl的基因片段。按照構(gòu)建YGaT91的相同的方法將擴增出的SFPl的基因片段克隆到Y(jié)EG a -HIR525，生成的質(zhì)粒命名為 YGaT93。
[0144]為表達(dá)C末端缺失HL結(jié)構(gòu)域的截短的SFPl蛋白，用正向引物T9F(SEQ ID NO:2)和反向引物H162(SEQ ID N0:6)，從YGaT91載體中擴增出SFPl的基因片段。按照構(gòu)建YGaT91的相同的方法將擴增出的SFPl的基因片段克隆到Y(jié)EG a -HIR525，生成的質(zhì)粒命名為 YGaT94。
[0145]為表達(dá)C末端缺失第三個糖基化位點的截短的SFPl蛋白，用正向引物T9F(SEQ IDNO: 2)和反向引物H205(SEQ ID NO: 7)，從YGaT91載體中擴增出SFPl的基因片段。按照構(gòu)建YGaT91的相同的方法將擴增出的SFPl的基因片段克隆到Y(jié)EG a -HIR525，生成的質(zhì)粒命名為 YGaT95。[0146]為表達(dá)C末端缺失第二個糖基化位點的截短的SFPl蛋白，用正向引物T9F(SEQ IDNO:2)和反向引物H204(SEQ ID NO:8)，從YGaT91載體中擴增出SFPl的基因片段。按照構(gòu)建YGaT91的相同的方法將擴增出的SFPl的基因片段克隆到Y(jié)EG a -HIR525，生成的質(zhì)粒命名為 YGaT96。
[0147]為表達(dá)C末端缺失第一個糖基化位點的截短的SFPl蛋白，用正向引物T9F(SEQ IDNO: 2)和反向引物H203(SEQ ID NO: 9)，從YGaT91載體中擴增出SFPl的基因片段。按照構(gòu)建YGaT91的相同的方法將擴增出的SFPl的基因片段克隆到Y(jié)EG a -HIR525，生成的質(zhì)粒命名為 YGaT97。
[0148]用構(gòu)建的載體(YGaT91、YGaT92、YGaT93、YGaT94、YGaT95、YGaT96和 YGaT97)轉(zhuǎn)化釀酒酵母2805菌株。從UD平板(0.67%無氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)上選擇的單菌落于YPDG肉湯培養(yǎng)基(I %酵母提取物、2%細(xì)菌蛋白胨、I %葡萄糖、I %半乳糖)中30°C培養(yǎng)40小時。每個0.6mL的肉湯培養(yǎng)基中分泌的蛋白用0.4mL丙酮濃縮，并通過SDS-PAGE分離。如圖1C所示，只在攜帶YGaT92、YGaT93和YGaT94的細(xì)胞中檢測到SFPl相關(guān)蛋白(分別為泳道2、3和4)。在所有的三個陽性菌株中均檢測到兩條帶，一條為糖基化形式，另一條為非糖基化形式。但其它細(xì)胞，YGaT91、YGaT95、YGaT96和YGaT97沒有這些條帶(分別為泳道1、5、6和7)。該結(jié)果表明去除TM結(jié)構(gòu)域并保留所含的所有三個糖基化位點使SFPl可進(jìn)行胞外分泌。
[0149]實施例2確定作為融合配偶體用于分泌目標(biāo)蛋白的SFPl基因的最佳大小
[0150]本實施例闡釋了 SFPl衍生物作為融合配偶體的應(yīng)用。為測試SFPl衍生物作為融合配偶體用于示例性目標(biāo)蛋白人白介素-2(hIL-2)的分泌，分別用YGaT92、YGaT93和 YGaT94 的三個 SFPl 衍生物(SFP1_92(SEQ ID NO: 39)、SFP1-93 (SEQ ID NO:40)和SFP1-94(SEQ ID NO: 41))，構(gòu)建了三個載體以表達(dá)融合蛋白hIL_2 (圖2A)。還生成了hIL-2和SFP1-91(SEQ ID NO:38)的融合蛋白，數(shù)據(jù)未示出。為了用YGaT92的SFP1-92融合hIL2基因，用識別GALlO啟動子的正向引物GAL100(SEQ ID NO:10)和反向引物H121(SEQ ID NO: 11)從YGaT92載體擴增出SFPl基因片段。為方便與hIL2基因融合從而誘導(dǎo)酵母二肽蛋白酶Kex2p體內(nèi)裂解hIL2融合蛋白(Mizuno K等，Biochem.Biophys.Res.Commun.156:246(1988))，設(shè)計了 H121 引物(SEQ ID NO: 11)以含有 Kex2p 裂解序列和N-末端hIL2序列。用含有與H121引物(SEQ ID NO: 11)互補的部分SFPl序列的正向引物IL2F(SEQ ID NO: 12)和反向引物IL2R(SEQ ID NO: 13)擴增人IL-2基因。IL2R引物含有部分GAL7終止子序列。使用GALlOO和GT50R(SEQ ID NO: 14)引物，使擴增得到的含有SFP1-92和hIL-2基因的PCR片段通過重疊-衍生PCR進(jìn)行融合。GT50R引物為識別GAL7終止子的反向引物。生成的PCR產(chǎn)物含有IOObp的GALlO啟動子和50bp的GAL7終止子側(cè)翼序列。釀酒酵母作為表達(dá)宿主的一個優(yōu)點在于可以使用有效和正確的同源重組策略。本領(lǐng)域公知的是線性化載體和在片段末端每一側(cè)共有DNA序列重疊的的DNA片段可進(jìn)行重組，恢復(fù)質(zhì)粒的環(huán)狀拓?fù)?Kunes等，Genetics.115:73(1987))。釀酒酵母的這一特性被用來構(gòu)建表達(dá)宿主系統(tǒng)。
[0151] 為使用YGaT92載體作為體內(nèi)重組的骨架，將YGaT92載體用BamHI/Sall酶切。用凝膠回收試劑盒(Bioneer，韓國)從瓊脂糖凝膠中回收線性化載體。用GAL100/GT50R引物擴增獲得的PCR產(chǎn)物與線性化載體有50個共有的核苷酸。體內(nèi)重組最小的要求為約30個核昔酸的重疊(Oldenberg等，Nucleic Acids Res.25:451 (1997)。50個核昔酸的重疊足以在釀酒酵母中進(jìn)行質(zhì)粒的重新構(gòu)建。通過共轉(zhuǎn)化上述的PCR產(chǎn)物和載體片段直接構(gòu)建釀酒酵母2805的重組子。通過重組構(gòu)建的質(zhì)粒命名為YGaT92-1L2(圖24)。為構(gòu)建轉(zhuǎn)化YGaT93-1L2載體的釀酒酵母2805菌株，除了使用(SEQ ID NO: 15)代替H121引物(SEQID NO: 11),我們使用與YGaT92-1L2質(zhì)粒構(gòu)建中相同的方法。H120引物為識別YGaT93載體的SFPl基因的3’末端并含有Kex2p裂解序列和hIL2的N-末端序列的反向引物。為用YGaT94-1L2載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母2805株，除了使用H119引物(SEQ ID NO: 16)代替H121引物(SEQ ID勵:11)，使用如￥6&了92-幾2質(zhì)粒構(gòu)建中相同的方法。H119引物為識別YGaT9載體的SFPl基因的3’末端并含有hIL2的N-末端序列的反向引物。
[0152]從UD平板(0.67%無氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)上選擇的單菌落于YPDG肉湯培養(yǎng)基(I %酵母提取物、2%細(xì)菌蛋白胨、I %葡萄糖、I %半乳糖)中30°C培養(yǎng)40小時。每個0.6mL的肉湯培養(yǎng)基中分泌的蛋白用0.4mL丙酮濃縮，并通過 SDS-PAGE 分離。如圖 2B 所示，攜帶有 YGaT92-1L2(SEQ ID NO: 58)和 YGaT93_IL2的細(xì)胞分泌出SFPl衍生蛋白和hIL2(分別為泳道I和2)，但攜帶YGaT94_IL2的細(xì)胞沒有分泌(泳道3)。結(jié)果表明以融合形式表達(dá)時，HL結(jié)構(gòu)域?qū)τ赟FPl衍生蛋白的分泌是非常重要的。
[0153]實施例3融合有SFPl衍生物的目標(biāo)蛋白的表達(dá)
[0154]實施例2中從YGaT92構(gòu)建的SFP1_92(SEQ ID NO:39)用于分泌制備Exendin-4(EXD4)，一種胰高糖素樣肽I (GLPl)的39個氨基酸的肽類似物。為簡單和有效地純化完整的EXD4蛋白，將6-組氨酸標(biāo)簽和腸激酶裂解位點(DDDDK(SEQ ID N0:79)，D:天冬氨酸，K:賴氨酸)加入到SFPl的C-末端。因而，N-末端至C-末端的融合蛋白包括SFPl片段、6-組氨酸標(biāo)簽、腸激酶裂解位點和EXD4序列。為構(gòu)建表達(dá)SFP1-92EXD4融合蛋白的YGaT92-EXD4 載體， 用 GAL100 引物(SEQ ID NO: 10)和反向引物 HDK-R(SEQ ID NO: 17)從YGaT92載體擴增出SFP1-92基因，所述的反向引物HDK-R識別HL序列并含有6個組氨酸密碼子。用含有18個與HDK-R引物和DDDDK密碼子互補的正向引物HDK-F(SEQ ID NO: 18)和含有18個GT50R(SEQ ID NO: 14)引物序列的反向引物EXD-R(SEQ ID NO: 19)擴增出EXD4基因。擴增出的SFP1-92和EXD4基因用GAL100/GT50R引物對通過重疊-延伸PCR進(jìn)行融合。如實施例2所述，通過共轉(zhuǎn)化融合的片段和BamHI/Sall酶切的YGaT92載體片段在體內(nèi)重組直接構(gòu)建攜帶YGaT92-EXD4載體的釀酒酵母2805菌株的重組子。
[0155]將用YGaT92_EXD4轉(zhuǎn)化的重組酵母通過分批補料培養(yǎng)的方式培養(yǎng)于5L的發(fā)酵罐，評價其誘導(dǎo)分泌制備SFP1-92-EXD4融合蛋白的能力。使用種子培養(yǎng)基(6.7%不含氨基酸的酵母氮源、0.5%酪蛋白水解物和2%葡萄糖)在搖瓶中培養(yǎng)待接種于發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)物。當(dāng)使用發(fā)酵培養(yǎng)基(4%酵母提取物、1%蛋白胨、2%葡萄糖)作為初始發(fā)酵培養(yǎng)物0D600達(dá)到約15時，根據(jù)細(xì)胞生長速率提供不同用量的補料培養(yǎng)基(15%酵母提取物、30%葡萄糖、30%半乳糖)。培養(yǎng)48小時后，培養(yǎng)物0D600達(dá)到約160。在指定的時間點收集10μ I的培養(yǎng)液并通過SDS-PAGE評價分泌蛋白(圖3Α-Β)。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶相比，分泌的SFP1-EXD4估算約為500mg/L。離心去除酵母細(xì)胞，收集上清液，濃縮并超濾脫鹽(Quickstand, Amersham)。
[0156]融合蛋白，SFP1-92-EXD4用N1-NTA親和層析柱(QIAGEN, USA)純化(圖4，泳道I)。為了從SFP1-92融合蛋白中回收EXD-4，純化的融合蛋白用不同濃度的腸激酶(Invitrogen, USA)進(jìn)行消化。將樣品溶于腸激酶緩沖液[20mM Tris-HCl (ρΗ8.0)、50mMNaCl、2mM CaC12]中。將等量的蛋白樣品用0.1,0.2和0.3 μ I的腸激酶于37°C消化I小時。生成的蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行分析(圖4，分別為泳道2、3和4)。
[0157]產(chǎn)生了數(shù)條小的蛋白條帶，而不是兩個條帶。那些小的片段有可能是腸激酶非特異性消化SFPl的結(jié)果。SFPl蛋白含有DDK(第137個氨基酸)和EDK(第168個氨基酸)殘基，其有可能是腸激酶的底物。
[0158]為進(jìn)一步分析從SFP1-92-EXD4分離的EXD-4，通過HPLC分離腸激酶處理后的樣品(圖4，泳道3)(圖5A)。HPLC譜圖中檢測到的蛋白峰用SDS-PAGE進(jìn)行分析(圖5B)。HPLC流分號41顯示出預(yù)期為EXD-4的單個條帶。通過MALD1-TOF(Korea Basic ScienceInstitute, Daejeon,韓國)(圖6)進(jìn)一步分析該蛋白用于確定其分子量(MW)。從SFP1-92融合蛋白中制備的EXD-4的MW為4187.8Da，這與通過其氨基酸序列計算得到的MW相符。
[0159]為構(gòu)建抗腸激酶的強SFP1-92融合配偶體，將DDK和EDK殘基分別變?yōu)镈GK和EGK殘基(圖7A)。為將DDK殘基變成DGK殘基，用GAL100引物(SEQ ID NO:8)和含有甘氨酸密碼子而不是DDK殘基的天冬氨酸密碼子的反向突變引物H307 (SEQ ID NO: 20)，從YGaT92-EXD4 中擴增 5’SFPl-92 片段。用與 H307(SEQ ID NO: 20)互補的正向引物 H306 (SEQID N0:21)和 GT50R 引物(SEQ ID NO: 14)，從 YGaT92_EXD4 載體中擴增 3’SFP1-92-EXD4 片段。用GAL100/GT50R引物對通過重疊延伸PCR融合這些片段。用BamHI/Sall消化后，將這些融合片段克隆到Y(jié)GaT92-EXD4載體的BamHI/Sall位點處。確認(rèn)所生成質(zhì)粒的核苷酸序列，并命名為含有 SFP1-921 的 YGaT921-EXD4(SEQ ID NO:42) ?
[0160]為將EDK殘基變成EGK殘基，用GAL100引物(SEQ ID NO: 10)和含有甘氨酸密碼子而不是EDK的天冬氨酸密 碼子的反向突變引物H309 (SEQ ID NO: 22)，從YGaT92_EXD4中擴增 5’ SFPl 片段。用與 H309(SEQ ID NO: 22)互補的正向引物 H308 (SEQ ID NO: 23)GT50R 引物(SEQ ID NO: 14)，從 YGaT92_EXD4 中擴增 3，SFP1-92-EXD4 片段。用 GAL100/GT50R引物對進(jìn)行重疊延伸PCR融合這些片段。用BamHI/Sall消化后，將這些融合片段克隆到Y(jié)GaT92-EXD4載體的BamHI/Sall位點處。確認(rèn)所生成質(zhì)粒的核苷酸序列，并命名為含有 SFP1-922 的 YGaT922-EXD4(SEQ ID NO:43)。
[0161]為了分別將DDK和EDK殘基都變成DGK和EGK，用GALlOO引物(SEQ ID NO: 10)和含有甘氨酸密碼子而不是EDK的天冬氨酸密碼子的反向突變引物H309 (SEQ ID N0:22)，從YGaT91-EXD4中擴增5’ SFPl片段。用與H309(SEQ ID NO: 22)互補的正向引物H308 (SEQID NO: 23)和 GT50R 引物(SEQ ID NO: 14)，從 YGaT92_EXD4 中擴增 3’ SFP1-EXD4 片段。用GAL100/GT50R引物對通過重疊延伸PCR融合這些片段。用BamHI/Sall消化后，將這些融合片段克隆到Y(jié)GaT92-EXD4載體的BamHI/Sall位點處。確認(rèn)所生成質(zhì)粒的核苷酸序列，并命名為含有 SFP1-923 的 YGaT922-EXD4(圖 25) (SEQ ID NO:44)。
[0162]用載體YGaT92-EXD4、YGaT921_EXD4、YGaT922_EXD4 和 YGaT923_EXD4 轉(zhuǎn)化釀酒酵母2805菌株。從UD平板(0.67%無氨基酸酵母氮源、0.77g/l氨基酸混合物、2%葡萄糖和2%瓊脂)上選擇的單菌落于YPDG肉湯培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%細(xì)菌蛋白胨、1%葡萄糖、I %半乳糖)中30°C培養(yǎng)40小時。用0.4mL的丙酮沉淀含有蛋白的0.6mL培養(yǎng)物上清液，并溶于腸激酶緩沖液[20mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM NaCl、2mM CaC12]中。將等量的蛋白樣品用0.1 μ I的腸激酶37°C消化I小時，并用SDS-PAGE進(jìn)行分離。
[0163]如圖7B所示，由YGaT92_EXD4轉(zhuǎn)化子制備的SFPl被消化成大約15kDa的片段(圖7B,泳道I)，但由YGaT921-EXD4和YGaT922_EXD4轉(zhuǎn)化子制備的SFPl (圖7B,分別為泳道2和3)比來自于YGaT92-EXD4的SFPl更抗內(nèi)源腸激酶的消化。最終，由YGaT923_EXD4 (SEQID NO:59)轉(zhuǎn)化子制備的絕大多數(shù)的SFPl片段是完整的(圖7B，泳道4)。因此，結(jié)果表明，YGaT923-EXD4的SFPl變體可成功應(yīng)用于表達(dá)和純化目標(biāo)蛋白。
[0164]實施例4與SFPl的HL結(jié)構(gòu)域融合的目標(biāo)蛋白的分泌
[0165]如實施例2所示，HL結(jié)構(gòu)域在目標(biāo)蛋白的分泌中發(fā)揮著重要作用。HL在目標(biāo)蛋白分泌中的功能可能是由于HL結(jié)構(gòu)域內(nèi)帶電荷的酸性氨基酸，因為蛋白的可溶性與蛋白的凈電荷緊密相關(guān)。為研究HL結(jié)構(gòu)域作為融合配偶體的功能，我們使用HL結(jié)構(gòu)域用于EXD4的分泌。
[0166]HL結(jié)構(gòu)域融合到目標(biāo)蛋白的N-末端。用H221(SEQ ID NO: 24) /GT50R(SEQ IDNO: 14)引物對從 YGaT923-EXD4 載體中擴增 HL-EXD4 基因，并用 GAL100/LNK-R(SEQ IDNO: 25)引物對 擴增交配因子a (MFa)的pre-pro前導(dǎo)肽。由于H221和LNK-R引物(SEQ IDNO: 25)含有互補的連接序列，這兩個片段用GAL100 (SEQ ID N0:8)/GT50R(SEQ ID NO: 14)引物對通過重疊延伸PCR方法進(jìn)行融合。通過共轉(zhuǎn)化所述的融合片段和實施例2所述的BamHI/Sall消化的YGaT92載體片段直接構(gòu)建YGaMKH_EXD4 (圖26)轉(zhuǎn)化子。YGaMKH_EXD4質(zhì)粒在MF α的prθ-ρι.0前導(dǎo)肽和HL肽之間含有連接肽(AASASAGLALDKR)，用于體內(nèi)被Kex2p加工。用YGaMKH-EXD4轉(zhuǎn)化的重組酵母通過分批補料培養(yǎng)的方式培養(yǎng)于5L的發(fā)酵罐，用于測定誘導(dǎo)分泌制備SFP1-92-EXD4融合蛋白的能力。使用種子培養(yǎng)基(6.7%不含氨基酸的酵母氮源、0.5%酪蛋白水解物和2%葡萄糖e)在搖瓶中培養(yǎng)待接種于發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)物。當(dāng)使用發(fā)酵培養(yǎng)基(4%酵母提取物、1%蛋白胨、2%葡萄糖)作為初始發(fā)酵培養(yǎng)物0D600達(dá)到約15時，根據(jù)細(xì)胞生長速率使用不同用量的補料培養(yǎng)基(15%酵母提取物、30%葡萄糖、30%半乳糖)。培養(yǎng)48小時后，培養(yǎng)物0D600達(dá)到約150。在指定的時間點收集10 μ I的培養(yǎng)液并通過SDS-PAGE評價分泌蛋白(圖8)。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶相比，分泌的HL-EXD4經(jīng)估算約為200mg/L。
[0167]為測試HL肽的C-末端融合到目標(biāo)蛋白的效果，構(gòu)建質(zhì)粒YGaST6-EXD-HL (圖27)。用正向引物 H412(SEQ ID NO: 26)和反向引物 H413 (SEQ ID NO: 27)從 YGaMKH_EXD4 中擴增出 EXD4 基因，并用 HL-F(SEQ ID NO:28)和 HL_GT50R(SEQ ID NO:29)從 YGaMKH_EXD4中擴增出HL肽。由于H413引物(SEQ ID NO: 27)含有與HL-F引物互補的序列，因此這兩個片段用H412(SEQ ID NO:26)/GT50R引物對通過段重疊延伸PCR的方法進(jìn)行融合。H412引物(SEQ ID NO: 26)含有連接序列，并可以通過 GAL100 (SEQ ID NO: 10)/LNK-R(SEQ IDNO:25)引物對融合到MFa的pre-pro前導(dǎo)肽中。每個擴增的片段以MFa的pre-pro前導(dǎo)序列、EXD4和HL結(jié)構(gòu)域基因的順序用GAL100/GT50R引物通過重疊延伸PCR進(jìn)行融合。通過共轉(zhuǎn)化所述的融合片段和實施例2所述的BamHI/Sall消化的YGaT92載體片段直接構(gòu)建YGaST6-EXD-HL轉(zhuǎn)化子。用YGaST6_EXD4_HL轉(zhuǎn)化的重組酵母株通過分批補料培養(yǎng)的方式培養(yǎng)于5L的發(fā)酵罐，用于測定誘導(dǎo)分泌制備EXD4-HL融合蛋白的能力。培養(yǎng)48小時后，培養(yǎng)物0D600達(dá)到約160。在指定的時間點收集10 μ I的培養(yǎng)液并通過SDS-PAGE評價分泌蛋白(圖9Α和B)。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶相比，分泌的EXD4-HL估算約為500mg/L。在HL融合到EXD4這種情況下，C-末端融合表現(xiàn)出比N-末端融合更高的EXD4分泌水平。因此，結(jié)果表明HL結(jié)構(gòu)域無論是在目標(biāo)蛋白的N-末端還是C-末端均有助于融合蛋白的分泌。然而，C-末端表現(xiàn)出更高的目標(biāo)蛋白的分泌。
[0168]為進(jìn)一步測試作為融合配偶體的HL結(jié)構(gòu)域，將HL結(jié)構(gòu)域用于表達(dá)人表皮生長因子(hEGF)。構(gòu)建YGaMKH-EGF質(zhì)粒(圖28)。在YGaMKH-EGF中，HL結(jié)構(gòu)域融合到hEGF的N-末端，用 GAL100 (SEQ ID NO: 10)/DDK-R(SEQ ID NO: 30)引物對從 YGaMKH_EXD4 載體中擴增MF a pre-pro肽-HL融合肽基因，并用含有與DDK-R引物互補的序列的正向引物H410 (SEQID N0:31)和含有與GT50R(SEQ ID NO: 14)相同的序列的反向引物H411 (SEQ ID NO:32) T增hEGF基因。每個擴增片段用GAL100/GT50R引物對通過重疊延伸PCR進(jìn)行融合。用所述的融合片段和實施例2所述的BamHI/Sall消化的YGaT92載體片段共轉(zhuǎn)化YGaMKH-EGF轉(zhuǎn)化子。
[0169]用YGaMKH-EGF轉(zhuǎn)化的重組酵母株通過分批補料培養(yǎng)的方式培養(yǎng)于5L的發(fā)酵罐，用于測定誘導(dǎo)分泌制備HL-EGF融合蛋白的能力。培養(yǎng)48小時后，培養(yǎng)物0D600達(dá)到約155。在指定的時間點收集10 μ I的培養(yǎng)液并通過SDS-PAGE評價分泌蛋白(圖1OA和B)。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶相比，分泌的HL-EGF估算約為400mg/L。[0170]通過N1-NTA親和層析對HL-hEGF融合蛋白直接進(jìn)行純化(圖11A)。為分離hEGF和HL肽，純化后的融合蛋白用腸激酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生的片段再次用N1-NTA親和層析進(jìn)行分離。如圖1lB所示，完整的純hEGF(6kD)被有效地純化出來。
[0171]HL結(jié)構(gòu)域還用于分泌制備人甲狀旁腺素(hPTH)。通過將HL結(jié)構(gòu)域融合到hPTH的N-末端構(gòu)建YGaMKH-PTH載體(圖29)。用含有與DDK-R引物(SEQ ID NO: 30)互補的序列的正向引物H310(SEQ ID NO:33)和含有與GT50R(SEQ ID NO: 14)相同的序列的反向引物 H311(SEQ ID NO: 34)擴增 hPTH基因。M GAL100 (SEQ ID NO: 10)/GT50R(SEQ ID NO: 14)引物對通過重疊延伸PCR將這個片段和MFa pre-pro肽-HL融合肽基因進(jìn)行融合。通過共轉(zhuǎn)化所述的融合片段和實施例2所述的BamHI/Sall消化的YGaT92載體片段直接構(gòu)建YGaMKH-PTH轉(zhuǎn)化子。用YGaMKH-PTH轉(zhuǎn)化的重組酵母菌株通過分批補料培養(yǎng)的方式培養(yǎng)于5L的發(fā)酵罐，用于測定誘導(dǎo)分泌制備HL-PTH融合蛋白的能力。培養(yǎng)48小時后，培養(yǎng)物0D600達(dá)到約120。在指定的時間點收集10 μ I的培養(yǎng)液并通過SDS-PAGE評價分泌蛋白(圖12Α和B)。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶相比，分泌的HL-PTH估算約為400 mg/L。檢測到與HL-PTH相關(guān)的兩條主要的條帶。大部分的hPTH是以60kD的MF a pro-HL-PTH融合形式被檢測到，這是由于其在體內(nèi)被Kex2p不完全裂解。也同樣檢測到了顯示Kex2p裂解的HL-PTH條帶。與PTH相關(guān)的所有分泌蛋白估計大于500mg/L。發(fā)酵液上清液中的His標(biāo)記蛋白通過N1-NTA親和層析直接進(jìn)行純化。純化的蛋白在SDS-PAGE中分離出預(yù)期的兩種條帶(圖13，泳道I)。比較大的條帶(Pro-HL-PTH)通過體外Kex2p加工后消失了(圖13，泳道2)。通過腸激酶的消化，融合蛋白(HL-PTH)被正確分離成HL肽和hPTH肽(泳道3)。
[0172]實施例1-4表明鑒定和修飾YGR106C基因的最佳區(qū)域?qū)е铝搜苌許FPl的有效多功能融合配偶體的構(gòu)建，用于重組蛋白分泌制備和分離。
[0173]實施例5從酵母分泌蛋白質(zhì)組中篩選分泌融合配偶體
[0174]本實施例闡明了用于鑒定作為融合配偶體的大量分泌蛋白的技術(shù)。
[0175]首先，分析正常酵母生長過程中，制備的總酵母分泌蛋白(酵母分泌蛋白質(zhì)組)。為分離酵母分泌蛋白質(zhì)組，將釀酒酵母2805菌株培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基中(0.67%不含氨基酸的酵母氮源、0.5%酪蛋白水解物、2%葡萄糖和0.002%尿嘧啶)20小時(Ml)和40小時(M2)。500mL的培養(yǎng)物上清液通過膜過濾進(jìn)行濃縮，獲得總分泌蛋白。用熒光染料hochest將酵母細(xì)胞染色后，用共焦激光掃描顯微鏡證實酵母細(xì)胞的完整性(圖14A和B)。
[0176]M2分泌蛋白質(zhì)組樣品通過雙向凝膠電泳進(jìn)行分析(圖15)。除了用于去除總蛋白樣品中的核糖核酸污染而加入的RNase A，分泌蛋白質(zhì)組的大多數(shù)蛋白在酸性區(qū)進(jìn)行鑒定。如圖15所示，雙向凝膠電泳不足以鑒定所有M2樣品中存在的分泌蛋白。因此，還使用1-DE/MudPIT(多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù))方法來更加完整地鑒定酵母的分泌蛋白質(zhì)組(圖16)。結(jié)果表明，分別從Ml和M2中鑒定出57個和83個蛋白。綜合起來，鑒定出98個特異的蛋白。這中間，有42個蛋白是Ml和M2樣品中普遍檢測到的。為證實該蛋白最有可能是分泌蛋白，使用兩個程序WoLF PSORT和pTARGET進(jìn)行蛋白的定位預(yù)測和信號預(yù)測。在42個蛋白中，預(yù)測有35個蛋白(80%)為分泌蛋白(表1)。
[0177]表1通過酵母分泌蛋白質(zhì)組分析鑒定出的35個基因以及通過MASS分析確定的其蛋白豐富指數(shù)(PAI)。
[0178]
【權(quán)利要求】
1.一種重組產(chǎn)生毒蜥外泌肽-4的方法，包括: a)制備表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含:(i)編碼所述毒蜥外泌肽-4的多核苷酸，其連接至(ii)編碼分泌融合配偶體(SFP)的多核苷酸； b)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞； c)在從所述宿主細(xì)胞中產(chǎn)生并分泌出可操作地連接至所述SFP的毒蜥外泌肽-4的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；以及 d)將所述SFP與所述毒蜥外泌肽-4分離， 其中所述分泌融合配偶體選自 SPF1(SEQ ID N0:1)、BGL2(SEQ ID N0:80)、GAS3(SEQID N0:81)，GAS5(SEQ ID NO: 82)、PSTl (SEQ ID NO: 83)、SCW4 (SEQ ID NO: 84)、SCWlO (SEQID NO:85),SIMl(SEQ ID NO:86)、UTHl(SEQ ID NO:87)、YGPI(SEQ ID NO:88)、YPSI(SEQ IDNO:89), ZPSI (SEQ ID NO:90)及其片段。
2.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的方法，其中所述SFP選自GAS3(SEQ ID NO: 81)、GAS5 (SEQ IDNO:82), PSTl (SEQ ID NO:83)、SCW4 (SEQ ID NO:84)、YGPl (SEQ ID NO:88)、YPSl (SEQ IDNO:89)及其片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述SFP包含親水(HL)結(jié)構(gòu)域，其含有SEQIDNO:1或其片段或其衍生物的氨基酸176-213，其中所述SFP缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述SFP由包含選自以下的核苷酸序列的多核苷酸編碼:SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和 EQ ID NO:72。
5.分泌融合配偶體(SFP)在用于誘導(dǎo)毒蜥外泌肽-4分泌中的用途，其中所述SFP選自 SPFl(SEQ ID NO:l)、BGL2(SEQ ID NO:80)、GAS3(SEQ ID NO:81)、GAS5(SEQ ID NO:82)、PSTl(SEQ ID NO:83)、SCW4(SEQ ID NO:84)、SCWlO(SEQ ID NO:85)、S頂I(SEQ ID NO:86)、UTHl(SEQ ID N0:87)、YGP1(SEQ ID NO:88)、YPSI(SEQ ID NO:89)、ZPSI(SEQ ID NO:90)及其片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述SFP選自GAS3(SEQ ID NO: 81)、GAS5 (SEQ IDNO:82), PSTl (SEQ ID NO:83)、SCW4 (SEQ ID NO:84)、YGPl (SEQ ID NO:88)、YPSl (SEQ IDNO:89)及其片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述SFP包含親水(HL)結(jié)構(gòu)域，其含有SEQIDNO:1或其片段或其衍生物的氨基酸176-213，其中所述SFP缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述SFP由包含選自以下的核苷酸序列的多核苷酸編碼:SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQID NO:62、SEQ ID NO:63，、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和 EQ ID NO:72。
【文檔編號】C12N15/63GK103952425SQ201410174695
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2008年12月4日
【發(fā)明者】孫廷薰, 裴貞勛, 金炫辰, 林光默 申請人:韓國生命工學(xué)研究院