針對(duì)編碼功能蛋白的變體篩選多核苷酸文庫(kù)的制作方法
【專利說(shuō)明】針對(duì)編碼功能蛋白的變體篩選多核巧酸文庫(kù) 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0001] 本申請(qǐng)要求于2012年9月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/703, 566的權(quán)益，將其 通過(guò)引用W其全部?jī)?nèi)容而特此結(jié)合。 關(guān)于在聯(lián)邦政府資助的研究與開(kāi)發(fā)下完成的發(fā)明的權(quán)利聲明
[0002] 不適用。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及微生物學(xué)、分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)生物化學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明設(shè) 及用于對(duì)多核巧酸文庫(kù)分析和富集編碼功能蛋白的變體的組合物和方法。 發(fā)明背景
[0004] 對(duì)多核巧酸文庫(kù)篩選編碼優(yōu)選蛋白活性的變體在生物技術(shù)中是一項(xiàng)中屯、事 業(yè)（參見(jiàn)例如，雅克爾（化ckel)和希爾韋特化ilved)，生物技術(shù)當(dāng)前述評(píng)（化rr化in Biotechnol) 21，753-759 (2010))。遺憾地，隨著文庫(kù)多樣性增加，在文庫(kù)中活性變體的數(shù)目 呈指數(shù)下降（參見(jiàn)例如，郭佑UO)等人，PNAS(2004);布洛姆炬loom)等人，PNAS(2005))。 該種相反的關(guān)系導(dǎo)致多核巧酸文庫(kù)的篩選無(wú)效且昂貴。由于僅僅文庫(kù)的一小部分編碼功能 蛋白，因此通常必須篩選數(shù)千、數(shù)百萬(wàn)或甚至數(shù)十億的變體，W便鑒定所希望的克隆。篩選 通常是緩慢且昂貴的，因?yàn)樗湫偷匦枰远x的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)表達(dá)和頻繁純化 與定量、與底物或配體進(jìn)行特異反應(yīng)、信號(hào)檢測(cè)與定量。
[0005] 為有助于文庫(kù)篩選嘗試，已經(jīng)研發(fā)了許多方法和大量的機(jī)器人自動(dòng)化（參見(jiàn)例 如，邁爾克（Maerkl)，生物技術(shù)當(dāng)前述評(píng)（QirrOpinBiotechnol)22,59-65(2011);戈達(dá)德 (Goddard)和雷蒙德巧eymond)，生物技術(shù)當(dāng)前述評(píng)15,314-322(2004);瓦勒爾（W址ler) 和雷蒙德，生物技術(shù)當(dāng)前述評(píng)12,535-544(2001))。盡管如此，但是篩選通量是不足的且 仍是昂貴的，因?yàn)楸仨殢凝嫶蟮目赡苄灾需b定有希望的變體。例如，在一個(gè)100-氨基酸 蛋白中突變兩個(gè)隨機(jī)氨基酸形成包含1.98X106個(gè)獨(dú)特成員的文庫(kù)（參見(jiàn)例如，迪特里希 值ietrich)等人，生物化學(xué)年鑒（AnnRevBiochem)79,563-590(2010))。所有篩選途徑的 中屯、局限在于，它們必須針對(duì)祀蛋白與特異反應(yīng)物的活性或相互作用并且針對(duì)檢測(cè)與分離 陽(yáng)性變體的手段兩者進(jìn)行自定義。 發(fā)明概述
[0006] 在不同方面中，在此考慮的本發(fā)明或多個(gè)發(fā)明可W包括但無(wú)需局限于W下實(shí)施例 中的任何一個(gè)或多個(gè)。
[0007] 實(shí)施例1 ; 一種針對(duì)可能編碼功能多膚的多核巧酸而對(duì)多個(gè)多核巧酸進(jìn)行富集并 對(duì)該富集的多個(gè)多核巧酸進(jìn)行篩選的方法，該方法包括；(a)提供編碼一種多膚的變體的 多個(gè)多核巧酸，其中該些多核巧酸中的至少一些編碼一種具有至少一種活性的多膚；化） 從該些多核巧酸產(chǎn)生多膚；（C)確定該些多膚是否可溶；（d)選擇編碼可溶性多膚的多核巧 酸，W形成富集的多個(gè)多核巧酸；并且（e)針對(duì)編碼具有該活性的多膚的多核巧酸篩選該 富集的多個(gè)多核巧酸。
[000引實(shí)施例2 ;如實(shí)施例1所述的方法，其中所述選擇產(chǎn)生編碼一種具有該活性的多膚 的多核巧酸的至少2倍富集。
[0009] 實(shí)施例3 ;如實(shí)施例2所述的方法，其中所述選擇產(chǎn)生編碼一種具有該活性的多膚 的多核巧酸的至少選自下組的富集程度的富集，該組由W下各項(xiàng)組成；5倍、10倍、15倍、20 倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90 倍、95 倍、100 倍、1〇3倍、10 4倍、10 5倍、10 6倍、10 8倍W及 10 9倍。
[0010] 實(shí)施例4 ;一種關(guān)于可能編碼功能多膚的多核巧酸的水平來(lái)比較至少兩個(gè)多核巧 酸文庫(kù)的方法，該方法包括；(a)提供編碼相同多膚的變體的多核巧酸的至少兩個(gè)不同文 庫(kù)；化）針對(duì)每一多個(gè)多核巧酸；（i)從該些多核巧酸產(chǎn)生多膚；并且（ii)確定該些多膚是 否可溶；并且（C)將具有最高水平的可溶性多膚的多個(gè)多核巧酸鑒定為包含最高水平的可 能編碼功能多膚的多核巧酸的多個(gè)多核巧酸。
[0011] 實(shí)施例5 ;如實(shí)施例4所述的方法，其中每一多個(gè)多核巧酸都包括至少一些編碼一 種具有至少一種活性的多膚的多核巧酸，并且該方法另外包括針對(duì)編碼具有該活性的多膚 的多核巧酸篩選該鑒定的多個(gè)多核巧酸。
[0012] 實(shí)施例6 ;如任何W上實(shí)施例所述的方法，其中該方法另外包括針對(duì)編碼具有高 于預(yù)定水平的活性的多膚的多核巧酸篩選該富集或鑒定的多個(gè)多核巧酸。
[0013] 實(shí)施例7 ;如任何W上實(shí)施例所述的方法，其中化）的產(chǎn)生包括在宿主細(xì)胞中表達(dá) 該些多膚。
[0014] 實(shí)施例8 ;如實(shí)施例7所述的方法，其中將該些多膚在宿主細(xì)胞中表達(dá)為融合蛋 白，其中該融合蛋白還包括一個(gè)溶解度報(bào)告部分。
[0015] 實(shí)施例9 ;如實(shí)施例8所述的方法，其中該宿主細(xì)胞表達(dá)一種互補(bǔ)多膚，該互補(bǔ)多 膚能夠結(jié)合至融合蛋白的溶解度報(bào)告部分，W產(chǎn)生一種可檢測(cè)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0016] 實(shí)施例10 ;如實(shí)施例9所述的方法，其中化）的產(chǎn)生包括；在該宿主細(xì)胞中從一種 表達(dá)載體表達(dá)該些融合蛋白，該表達(dá)載體包括誘導(dǎo)型或阻抑型啟動(dòng)子；終止該些融合蛋白 的表達(dá)并且允許該些宿主細(xì)胞休眠一段時(shí)間足W允許降解或加工錯(cuò)誤折疊的融合蛋白；所 述休眠期后，從誘導(dǎo)型或阻抑型啟動(dòng)子表達(dá)該互補(bǔ)多膚。
[0017] 實(shí)施例11 ;如實(shí)施例10所述的方法，其中確定該些多膚是否可溶包括針對(duì)該可檢 測(cè)的蛋白質(zhì)復(fù)合物篩選該些宿主細(xì)胞。
[0018] 實(shí)施例12 ;如實(shí)施例11所述的方法，其中選擇該些編碼可溶性多膚的多核巧酸W 形成富集的多個(gè)多核巧酸包括：裂解包括該可檢測(cè)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的任何一個(gè)或多個(gè)宿主 細(xì)胞；并且回收編碼該融合蛋白的該多核巧酸。
[0019] 實(shí)施例13 ;如實(shí)施例12所述的方法，其中通過(guò)核酸擴(kuò)增回收編碼該融合蛋白的該 多核巧酸。
[0020] 實(shí)施例14 ;如實(shí)施例1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中化）的產(chǎn)生包括在一種反應(yīng) 混合物中表達(dá)該些多膚，該反應(yīng)混合物包括用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的組分。
[0021] 實(shí)施例15 ;如實(shí)施例14所述的方法，其中在分開(kāi)的反應(yīng)混合物中表達(dá)不同多膚， 該些分開(kāi)的反應(yīng)混合物包括用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的組分，其中至少約20%的該些反應(yīng)混合 物中每反應(yīng)混合物表達(dá)一種或更少的所述多膚（即，一種多膚或沒(méi)有多膚）。
[0022] 實(shí)施例16 ;如實(shí)施例15所述的方法，其中該些分開(kāi)的反應(yīng)混合物包括油包水乳液 中的水相液滴。
[0023] 實(shí)施例17 ;如實(shí)施例16所述的方法，其中將該些多膚表達(dá)為融合蛋白，其中每種 融合蛋白都包括一個(gè)或多個(gè)溶解度報(bào)告部分，該一個(gè)或多個(gè)溶解度報(bào)告部分包括；多膚附 接標(biāo)簽，該標(biāo)簽?zāi)軌蚺c該多個(gè)多核巧酸中的多核巧酸形成共價(jià)鍵，或W其他方式結(jié)合至其 上；W及多膚親和標(biāo)簽。
[0024] 實(shí)施例18 ;如實(shí)施例17所述的方法，其中化）的產(chǎn)生包括；在該些水相液滴中表 達(dá)該些融合蛋白；并且允許每種融合蛋白都被表達(dá)，該每種融合蛋白都能夠與多核巧酸在 該水相液滴中形成共價(jià)鍵，或W其他方式結(jié)合至其上。
[0025] 實(shí)施例19 ;如實(shí)施例18所述的方法，其中確定該些多膚是否可溶，并且選擇該些 編碼可溶性多膚的多核巧酸W形成富集的多個(gè)多核巧酸包括通過(guò)親和捕獲而回收結(jié)合至 融合蛋白的多核巧酸。
[0026] 實(shí)施例20 ;如任何W上實(shí)施例所述的方法，其中該多個(gè)多核巧酸包括來(lái)源于來(lái)自 植物或動(dòng)物的樣品或來(lái)源于環(huán)境樣品的多核巧酸集。
[0027] 實(shí)施例21 ;-種篩選有助于蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶的方法，該方法包括；(a)在宿 主細(xì)胞中或在體外反應(yīng)混合物中表達(dá)一種融合蛋白，其中該融合蛋白包括一個(gè)趨于錯(cuò)誤折 疊或凝集的部分，其中該部分被連接至一個(gè)或多個(gè)溶解度報(bào)告部分，并且其中該宿主細(xì)胞 或體外反應(yīng)混合物還包括或產(chǎn)生一種潛在的分子伴侶；化）確定該融合蛋白是否可溶；（C) 如果該融合蛋白是可溶的，則將該潛在的分子伴侶鑒定為有助于該融合蛋白的折疊的分子 伴侶。
[002引實(shí)施例22 ;如實(shí)施例21所述的方法，其中在多個(gè)宿主細(xì)胞或體外反應(yīng)混合物中表 達(dá)該融合蛋白，并且不同宿主細(xì)胞或反應(yīng)混合物分別包括或產(chǎn)生不同的潛在的分子伴侶， 并且其中，當(dāng)在體外反應(yīng)混合物中表達(dá)該融合蛋白時(shí)，至少約20%的該些反應(yīng)混合物中每 反應(yīng)混合物包括或產(chǎn)生一種或更少的所述潛在的分子伴侶。
[0029] 實(shí)施例23;如實(shí)施例22所述的方法，其中該些潛在的分子伴侶表達(dá)自選自W下各 項(xiàng)的多核巧酸集：編碼已知的分子伴侶多膚的集，編碼一種或多種已知的分子伴侶多膚的 變體的集，編碼膚的集，來(lái)源于來(lái)自植物或動(dòng)物的樣品或來(lái)源于環(huán)境樣品的集，或者該些潛 在的分子伴侶包括選自W下各項(xiàng)的小分子集；多個(gè)已知的小分子分子伴侶，一種或多種已 知的小分子分子伴侶的多個(gè)變體，和多個(gè)小分子，其中在該小分子集中的每個(gè)小分子都被 連接至獨(dú)特的多核巧酸條碼。
[0030] 實(shí)施例24 ;如實(shí)施例23所述的方法，其中一種給定的潛在的分子伴侶是一種通過(guò) 表達(dá)編碼該潛在的分子伴侶的多核巧酸而產(chǎn)生于該宿主細(xì)胞或體外反應(yīng)混合物中的多膚 或膚。
[0031] 實(shí)施例25 ;如實(shí)施例22-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中在表達(dá)一種互補(bǔ)多膚的宿 主細(xì)胞中表達(dá)該融合蛋白，該互補(bǔ)多膚能夠結(jié)合至融合蛋白的溶解度報(bào)告部分，W產(chǎn)生一 種可檢測(cè)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0032] 實(shí)施例26 ;如實(shí)施例25所述的方法，其中確定該些融合蛋白是否可溶包括針對(duì)該 可檢測(cè)的蛋白質(zhì)復(fù)合物篩選該些宿主細(xì)胞。
[003引實(shí)施例27 ;如實(shí)施例24所述的方法，其中鑒定該潛在的分子伴侶包括：裂解包括 該可檢測(cè)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的任何一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞；并且回收編碼該潛在的分子伴侶的 多核巧酸。
[0034] 實(shí)施例28 ;如實(shí)施例27所述的方法，其中通過(guò)核酸擴(kuò)增回收編碼該潛在的分子伴 侶的該多核巧酸。
[003引實(shí)施例29 ;如實(shí)施例22-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中在分開(kāi)的反應(yīng)混合物中表 達(dá)該些融合蛋白，該些分開(kāi)的反應(yīng)混合物包括油包水乳液中的水相液滴。
[0036] 實(shí)施例30 ;如實(shí)施例29所述的方法，其中每種融合蛋白都包括一個(gè)或多個(gè)溶解度 報(bào)告部分，該一個(gè)或多個(gè)溶解度報(bào)告部分包括；多膚附接標(biāo)簽，該標(biāo)簽?zāi)軌蚺c多核巧酸形成 共價(jià)鍵，或W其他方式結(jié)合至其上；W及多膚親和標(biāo)簽。
[0037] 實(shí)施例31 ;如實(shí)施例30所述的方法，其中該方法包括允許每種融合蛋白都該樣， 該每種融合蛋白都能夠與多核巧酸在該水相液滴中形成共價(jià)鍵，或W其他方式結(jié)合至其 上，該多核巧酸編碼潛在的分子伴侶，或結(jié)合至其上。
[003引實(shí)施例32 ;如實(shí)施例31所述的方法，其中確定該融合蛋白是否可溶包括通過(guò)親和 捕獲而回收結(jié)合至融合蛋白的多核巧酸。
[0039] 實(shí)施例33 ;-種用于鑒定一個(gè)或多個(gè)可溶和/或功能結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域作 圖方法，該方法包括；(a)在宿主細(xì)胞中或在體外反應(yīng)混合物中表達(dá)一種融合蛋白，其中該 融合蛋白包括有待作圖的蛋白質(zhì)的一部分，其中該部分被連接至一個(gè)或多個(gè)溶解度報(bào)告部 分；化）確定該融合蛋白是否可溶；（C)如果該融合蛋白是可溶的，則將該部分鑒定為作為 可溶和/或功能結(jié)構(gòu)域的部分。
[0040] 實(shí)施例34 ;如實(shí)施例33所述的方法，其中在多個(gè)宿主細(xì)胞或體外反應(yīng)混合物中表 達(dá)多個(gè)不同的融合蛋白，并且其中，當(dāng)在體外反應(yīng)混合物中表達(dá)該融合蛋白時(shí)，至少約20% 的該些反應(yīng)混合物中每反應(yīng)混合物包括或產(chǎn)生一種或更少的所述潛在的分子伴侶。
[0041] 實(shí)施例35 ;如實(shí)施例34所述的方法，其中該多個(gè)不同的融合蛋白包括有待被作圖 繪的蛋白質(zhì)的多個(gè)不同部分，每個(gè)部分都被連接至一個(gè)或多個(gè)溶