尿液核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種尿液核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1的應(yīng)用，具體為尿液核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1在制備用于診斷或檢測(cè)2型糖尿病的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)研究證實(shí)與正常對(duì)照組相比，核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1在2型糖尿病組患者的尿液中特異表達(dá)下調(diào)，從而能夠用于2型糖尿病的診治。本發(fā)明發(fā)揮尿液標(biāo)本獲取無(wú)創(chuàng)、可大規(guī)模重復(fù)取樣、保存方便的優(yōu)勢(shì)，利用隨機(jī)尿標(biāo)本檢測(cè)核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1。
【專利說(shuō)明】尿液核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1的新用途，具體涉及尿液核苷酸三聯(lián)體結(jié)合 蛋白1在2型糖尿病診治中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 2型糖尿?。╠iabetes mellitus type2)是全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，近二十 年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活方式發(fā)生了顯著的改變，2型糖尿病的患病人數(shù)呈 急劇增加趨勢(shì)。由于我國(guó)人口老齡化的趨勢(shì)，60歲以上的2型糖尿病患者已接近50%，并以 每年0. 1%的速度遞增。2型糖尿病已成為威脅我國(guó)居民生命和健康的重要疾病之一，是亟 待解決的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。
[0003] 2型糖尿病主要是由于胰島素分泌和(或）作用缺陷引起的慢性血糖增高，涉及全 身性的糖類、脂類和蛋白質(zhì)代謝紊亂。由于血糖濃度容易受多種因素(例如興奮、勞累、感 冒、發(fā)燒和感染）的影響而產(chǎn)生波動(dòng)，所以2型糖尿病患者需要不斷的監(jiān)測(cè)血糖變化，以相 應(yīng)的調(diào)整藥物劑量。血糖控制不佳以及脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂可導(dǎo)致眼、腎、心臟、血管等組 織器官及神經(jīng)系統(tǒng)的慢性進(jìn)行性病變、功能減退及衰竭。因此對(duì)2型糖尿病進(jìn)行高危人群 的篩查和早期診斷，以便進(jìn)行早期治療，提高患者的生存質(zhì)量，是2型糖尿病研究的重要課 題。
[0004] 核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白 1 (Histidine triad nucleotide-binding proteinl， HINT1)在真核生物和細(xì)菌中廣泛表達(dá)，序列具有高度保守性。它的基本功能是水解腺苷酸 5'單磷酰胺酯的底物，例如AMP-morpholidate。越來(lái)越多的證據(jù)表明HINT1蛋白在基因 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路中起抑制作用。我們首次發(fā)現(xiàn)了 HINT1在2型糖尿病患者的尿液中呈低表 達(dá)。
[0005] 為了 了解疾病進(jìn)展，及時(shí)治療并發(fā)癥，2型糖尿病患者需要監(jiān)測(cè)血糖控制情況。在 現(xiàn)有的臨床檢查中，采集末梢血或靜脈血是作為血糖監(jiān)測(cè)的最佳標(biāo)本，但血液標(biāo)本的獲取 有創(chuàng)，乳糜血或溶血會(huì)影響血糖檢測(cè)的準(zhǔn)確性，并且頻繁采血會(huì)對(duì)患者造成心理負(fù)擔(dān)，尤其 是老年人和肥胖人群。因此，如果能建立一種對(duì)2型糖尿病患者進(jìn)行篩查、監(jiān)測(cè)的無(wú)創(chuàng)性檢 查方法，對(duì)2型糖尿病的早期篩查、診斷、預(yù)防及治療均具有極其重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種尿液核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1 (Histidine triad nucleotide-binding proteinl，HINT1)在制備用于診斷或檢測(cè)2型糖尿病的制劑中的應(yīng) 用。
[0007] 優(yōu)選地，所述尿液核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008] 優(yōu)選地，所述制劑為2型糖尿病患者尿液核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1檢測(cè)試劑盒。所 述試劑盒包括盒體以及設(shè)置在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和試劑。
[0009] 優(yōu)選地，所述酶標(biāo)板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組 成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔。
[0010] 優(yōu)選地，每個(gè)反應(yīng)孔預(yù)包被兔抗人HINT1多克隆抗體。
[0011] 優(yōu)選地，所述試劑為HINT1標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、抗體濃縮液、顯色液A、顯色液 B、終止液、濃縮洗滌液。
[0012] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括蓋板膜、放置試劑的下凹瓶位以及自封袋。
[0013] 優(yōu)選地，所述下凹瓶位共13個(gè)，由塑料泡沫制成。
[0014] 優(yōu)選地，所述酶標(biāo)板由聚苯乙烯制成。
[0015] 發(fā)明人首先收集了無(wú)并發(fā)癥及其他合并癥的2型糖尿病患者和正常對(duì)照的隨機(jī) 尿液標(biāo)本，尚心后取上清，利用弱陽(yáng)尚子交換磁珠純化和分尚尿液標(biāo)本。將1 μ 1標(biāo)本與 1〇μ1基質(zhì)（0.3%的α-氰基-4-羥基肉桂酸，HCCA)混勻后，取Ιμ?點(diǎn)在Anchorchip (Autoflex MALDI TOF，Bruker-Dalton)祀板上，標(biāo)本離子化后進(jìn)行質(zhì)譜分析，采集 1000-10000Da范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)，獲得由不同質(zhì)荷比的蛋白峰構(gòu)成的質(zhì)譜多肽圖。應(yīng)用 ClinPr〇T〇〇ls2. 1分析軟件對(duì)2型糖尿病組和正常對(duì)照組的所有質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，篩選 差異性多肽。然后發(fā)明人對(duì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異性多肽進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛 行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)鑒定，在 International Protein Index (IPI human v3. 45fasta with71983entries)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到2型糖尿病組與正常對(duì)照組間差異表達(dá) 的HINT1 (Histidine triad nucleotide-binding proteinl，蛋白號(hào)：IPI00239077.5，m/ z:1056. 1)蛋白，并且與正常對(duì)照相比，HINT1蛋白在2型糖尿病患者的尿液中呈低表達(dá)。
[0016] 本發(fā)明通過(guò)研究證實(shí)與正常對(duì)照組相比，核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1 (HINT1)在2 型糖尿病組患者的尿液中特異表達(dá)下調(diào)，從而提出檢測(cè)尿液核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1可用 于2型糖尿病的診治。
[0017] 本發(fā)明發(fā)揮尿液標(biāo)本獲取無(wú)創(chuàng)、可大規(guī)模重復(fù)取樣、保存方便的優(yōu)勢(shì)，利用隨機(jī)尿 標(biāo)本檢測(cè)核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1。
[0018] 為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例， 并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是2型糖尿病組和正常對(duì)照組所有標(biāo)本的尿液多肽譜。紅色(箭頭1)代表2 型糖尿病組，綠色(箭頭2)代表正常對(duì)照組，X軸表示m/z，y軸表示相對(duì)強(qiáng)度。
[0020] 圖2和圖3是HINT1在所有尿液標(biāo)本中的表達(dá)。紅色(箭頭1)代表2型糖尿病組， 綠色(箭頭2)代表正常對(duì)照組。
[0021] 圖4和圖5是HINT1在正常對(duì)照和2型糖尿病組中的平均峰面積。紅色(箭頭1) 代表2型糖尿病組，綠色(箭頭2)代表正常對(duì)照組。
[0022] 圖6是設(shè)置在本發(fā)明所述的試劑盒的盒體內(nèi)的酶標(biāo)板的示意圖，其中1為酶標(biāo)反 應(yīng)微孔條，2為酶標(biāo)板的外框支撐架，3為包被有HINT1融合蛋白多克隆抗體的孔。
[0023] 圖7是Western Blot檢測(cè)HINT1在正常對(duì)照和糖尿病患者尿液中的表達(dá)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1尿液標(biāo)本的收集與處理
[0025] 收集無(wú)并發(fā)癥及其他合并癥的病史5年以上的2型糖尿病患者28例（首都醫(yī)科大 學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院內(nèi)分泌門診)隨機(jī)清潔中段尿液標(biāo)本，此內(nèi)離心（1500rpm，5min)，保 留上清。分裝后_80°C冰箱凍存。正常對(duì)照組為29例正常人(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì) 壇醫(yī)院體檢中心)。具體請(qǐng)參照下表1 :
[0026] 表1 :2型糖尿病組和正常對(duì)照組的臨床資料
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 尿液核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1在制備用于診斷或檢測(cè)2型糖尿病的制劑中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述尿液核苷酸三聯(lián)體結(jié)合蛋白1的氨基 酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制劑為2型糖尿病患者尿液核苷酸三 聯(lián)體結(jié)合蛋白1檢測(cè)試劑盒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒包括盒體以及設(shè)置在盒體內(nèi) 的酶標(biāo)板和試劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述酶標(biāo)板由外框支撐架及放置其上的 可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，每個(gè)反應(yīng)孔預(yù)包被兔抗人HINT1多克隆抗 體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑為HINT1標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、 抗體濃縮液、顯色液A、顯色液B、終止液和濃縮洗滌液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒還包括蓋板膜、放置試劑的下 凹瓶位以及自封袋。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述下凹瓶位共13個(gè)，由塑料泡沫制成。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述酶標(biāo)板由聚苯乙烯制成。
【文檔編號(hào)】G01N33/545GK104297487SQ201310303649
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月18日
【發(fā)明者】張曼, 初麗娜, 雷婷 申請(qǐng)人:張曼