一種鱖傳染性脾腎壞死病毒熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒熒光定量檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。該檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法是根據(jù)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ORF007基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異引物和探針。本發(fā)明采用熒光定量PCR技術(shù)，簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可運(yùn)用于鱖魚的傳染性脾腎壞死病毒病毒監(jiān)測(cè)，也可以對(duì)鱖魚中病毒的含量和病毒滴度進(jìn)行檢測(cè)。
【專利說明】—種鱖傳染性脾腎壞死病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，具體涉及一種鱖傳染性脾腎壞死病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鱖魚(Siniperca chuatsi)是我國(guó)重要的淡水魚特色養(yǎng)殖種類之一，由傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)引起的績(jī)魚虹彩病毒病是鱖魚養(yǎng)殖的主要疫病，導(dǎo)致鱖魚死亡率接近100%，成為制約鱖魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要瓶頸。1997年，吳淑勤等首先在患病鱖魚中發(fā)現(xiàn)了直徑150nm的球形病毒，并認(rèn)為是鱖魚暴發(fā)性傳染病的病原。何建國(guó)等通過回歸感染進(jìn)一步證明了該病毒的病原性，通過組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鱖魚脾臟和腎臟是其感染的主要器官，將其命名為傳染性脾腎壞死病毒，通過主衣殼蛋白(MCP)基因等序列分析確定其為一種虹彩病毒。
[0003]虹彩病毒是二十面體的胞質(zhì)DNA病毒，直徑一般在120_200nm之間，可以感染節(jié)肢動(dòng)物等無脊椎動(dòng)物和魚類、兩棲、爬行等冷血脊椎動(dòng)物。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)第八次報(bào)告，虹彩病毒科(Iridoviridae)下設(shè)虹彩病毒屬(Iridovirus)、綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus)、娃病毒屬(Ranavirus)、淋巴囊腫病毒屬(LympHocystivirus)和腫大細(xì)胞病毒屬(Megalocytivirus)五個(gè)屬，其中傳染性脾腎壞死病毒是腫大細(xì)胞病毒屬的代表種。由于腫大細(xì)胞病毒屬病毒對(duì)魚類養(yǎng)殖業(yè)的巨大危害，這個(gè)屬的病毒受到越來越多的重視，目前已有數(shù)十種腫大細(xì)胞病毒屬 病毒被發(fā)現(xiàn)。但還未見熒光定量PCR應(yīng)用于鱖魚傳染性脾腎壞死病毒檢測(cè)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種鱖傳染性脾腎壞死病毒的突光定量PCR檢測(cè)試劑盒。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一組用于檢測(cè)鱖傳染性脾腎壞死病毒的熒光定量PCR特異性引物及探針。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種鱖傳染性脾腎壞死病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種鱖傳染性脾腎壞死病毒滴度的熒光定量PCR檢測(cè)方法。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種鱖傳染性脾腎壞死病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括如下組分:針對(duì)鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的特異性引物及探針、熒光定量反應(yīng)液、Tap酶。
[0009]所述針對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的特異性引物及探針是根據(jù)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒0RF007基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的。
[0010]作為優(yōu)選的，所述針對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的特異性引物及探針的序列如下所示:
ISKNV-F: 5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);
ISKNV-R: 5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2);
ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT- Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3)。
[0011]所述試劑盒中還含有陽性標(biāo)準(zhǔn)品，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為含有鱖傳染性脾腎壞死病毒DNA的質(zhì)粒。
[0012]一組用于檢測(cè)鱖傳染性脾腎壞死病毒的熒光定量PCR特異性引物及探針，序列如下所述
ISKNV -F: 5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);
ISKNV-R: 5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2);
ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT- Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3)。
[0013]一種鱖傳染性脾腎壞死病毒滴度的熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟:
(O以鱖魚傳染性脾腎壞死病毒0RF007基因保守區(qū)序列作為PCR擴(kuò)增的靶序列，設(shè)計(jì)合成特異性引物和探針；
(2)建立質(zhì)?？截悢?shù)與CT值對(duì)應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(3)利用步驟(1)的特異性引物和探針對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死壞死病毒滴度進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)CT值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出鱖傳染性脾腎壞死病毒滴度與拷貝數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
[0014]所述特異性引物和探針的序列如下所示:
ISKNV - F:5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);
ISKNV-R:5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2);
ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT-Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3)。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的有益效果在于可對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病進(jìn)行快速檢測(cè)，可以做到對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病定量分析，而且可以簡(jiǎn)化操作程序、節(jié)約成本，對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病的流行病學(xué)調(diào)查、病原監(jiān)測(cè)及早期預(yù)警都具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明的熒光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病的靈敏度實(shí)驗(yàn)圖，從左到右依次為 I X 108、I X 107、I X IO6、I X 105、I X IO4、I X 103、I X IO2、1X10 拷貝/μ L的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果；
圖2為本發(fā)明熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性實(shí)驗(yàn)圖；
圖3為本發(fā)明熒光定量PCR檢測(cè)方法中質(zhì)?？截悢?shù)與CT值對(duì)應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖4為本發(fā)明熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)圖；
圖5為本發(fā)明熒光定量PCR檢測(cè)方法中的樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)圖；
圖6為本發(fā)明熒光定量PCR檢測(cè)方法中拷貝數(shù)與病毒滴度關(guān)系圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
實(shí)施例
[0018]1、特異性引物及探針的設(shè)計(jì)
根據(jù)從Genbank上檢索到的鱖傳染性脾腎壞死病毒0RF007蛋白核酸序列(NC_003494)，通過blast比對(duì)，在基因保守片段設(shè)計(jì)用于檢測(cè)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的引物和探針，其序列如下:
ISKNV -F:5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);
ISKNV - R:5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2);
ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT- Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3);
熒光探針報(bào)告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為Eclipse。
[0019]2、陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備
提取鱖魚傳染性脾腎 壞死病毒0RF007蛋白核酸序列，利用常規(guī)方法將其接入T載體中，即為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。
[0020]3、病毒DNA的提取
按照Qiagen血液組織DNA提取試劑盒(購自Qiagen公司，貨號(hào):69504)的說明書步驟，從感染相應(yīng)病毒的魚體內(nèi)臟組織中提取DNA，作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板。
[0021]4.熒光定量PCR擴(kuò)增
每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系為20yL，配制如下:待檢測(cè)樣品的DNA模板2yL、上、下游引物和突光探針各2 μ M, 2 X Tapman universal PCR Master Mix 10 μ L、無菌去離子水補(bǔ)足至15yL。同樣按照上述體系設(shè)置陽性和陰性對(duì)照，加入陽性標(biāo)準(zhǔn)品或無菌去離子水2μ L進(jìn)行擴(kuò)增。
[0022]將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置各檢測(cè)的名稱設(shè)定反應(yīng)條件為950C預(yù)變性10s，然后經(jīng)95°C，5s和60°C，30s ,40個(gè)循環(huán)，于60°C采集熒光信號(hào)。
[0023]5、結(jié)果分析和判定
反應(yīng)結(jié)束后，熒光曲線呈S型曲線且Ct值< 35.0，判定為鱖魚傳染性脾腎壞死病毒陽性；若無典型S型曲線或Ct值> 35.0，判定為鱖魚傳染性脾腎壞死病毒陰性。
[0024]6、靈敏度實(shí)驗(yàn)
提取鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的DNA IXlO8拷貝/yL，10倍等比稀釋為1X107、I X IO6,1 X IO5,1 X 10\ I X IO3,1 X IO2U X 10拷貝/μ L，進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，從左到右依次為 I X 108、1X 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X 102、1X 10 拷貝 / μ L的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。
[0025]檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)1.0X 10拷貝/μ L，并且Ct值隨濃度減少呈梯度改變，精確性優(yōu)于普通PCR方法，表明本發(fā)明試劑盒和檢測(cè)方法對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的診斷具有高度的靈敏性。
[0026]7、特異性實(shí)驗(yàn)
為了檢測(cè)本發(fā)明試劑盒的特異性，用本發(fā)明的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒來檢測(cè)錦鯉皰疹病毒3型KHV、傳染性造血器官壞死病毒IHNV、大口黑鱸虹彩病毒LMBV、鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ISKNV、淋巴囊腫病毒IXDV、大鯢虹彩病毒STIV和陰性對(duì)照組(無菌離子水)，分析本試劑盒對(duì)魚類其它常見病毒和鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的檢測(cè)情況。
[0027]檢測(cè)結(jié)果表明:
僅對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ISKNV進(jìn)行擴(kuò)增(如圖2所示)，從圖2中可以看出，KHV, IHNV, LMBV, LCDV、STIV和陰性對(duì)照組均為陰性。
[0028]上述結(jié)果說明，本發(fā)明檢測(cè)試劑盒能特異性擴(kuò)增出鱖魚傳染性脾腎壞死病毒，而不與其它病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。說明本發(fā)明方法及試劑盒特異性好，未出現(xiàn)假陽性。
[0029]8、標(biāo)準(zhǔn)曲線
用雙蒸水對(duì)陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行IOX倍比稀釋，采用上述反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，建立質(zhì)?？截悢?shù)與CT值對(duì)應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0030]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線在8.75X IO1 copy/μ L—8.75X IO8Copy/μ L之間有較好的線性關(guān)系，如圖3所示，相關(guān)系數(shù):R2 =0.999，斜率:Slope = — 3.314，截距:Y-lnter=41.48，擴(kuò)增效率疋€0/。=99%。得出質(zhì)?？截悢?shù)CO與CT值之間的線性方程為-.CT= -3.314Ig J +41.48。 [0031]9、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
取鱖魚傳染性脾腎壞死病毒DNA在一次實(shí)驗(yàn)中重復(fù)30次，結(jié)果表明(圖4)，同一次實(shí)驗(yàn)內(nèi)的30個(gè)平行樣的擴(kuò)增曲線在閾值線附近基本上重合，說明本實(shí)驗(yàn)所建立的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒熒光定量PCR快速檢測(cè)方法重復(fù)性好。
[0032]10、樣品檢測(cè)
根據(jù)上述檢測(cè)方法，取15份樣品進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)結(jié)果見圖5，從圖5中可以看出，15份樣品中，檢測(cè)到陽性樣品為8份，檢測(cè)到陰性為7份。所有參與檢測(cè)的臨床樣品同時(shí)結(jié)合細(xì)胞分離和常規(guī)的PCR檢測(cè)來相互驗(yàn)證，其檢測(cè)結(jié)果和本專利申請(qǐng)的檢測(cè)方法一致。
[0033]11、病毒滴度確定
病毒原液梯度稀釋后，提取處理樣品中的病毒DNA，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR確定病毒DNA的濃度，10°、10-1、10_2、10_3、10_4病毒液的拷貝數(shù)依次為2X IO6個(gè)拷貝/ml、2X IO5個(gè)拷貝/ml、IXlO4個(gè)拷貝/ml、9X102個(gè)拷貝/ml、7X10個(gè)拷貝/ml。通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化，取第14天記錄結(jié)果確定病毒滴度。依Karber法計(jì)算得10°、10'10_2、10_3、10_4病毒液的滴度分別為:ΙΟ5 25、104_25、ΙΟ3.25、102 25、IO150將ISKNV不同稀釋度的病毒滴度對(duì)數(shù)與病毒拷貝數(shù)對(duì)數(shù)進(jìn)行線性相關(guān)回歸分析，由圖6可見，定量PCR測(cè)得的病毒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與CPE法測(cè)得的病毒滴度TCID50的對(duì)數(shù)呈顯著的線性回歸關(guān)系，病毒拷貝數(shù)(y)與病毒滴度(X)線性回歸方程為:y = 1.1748x + 0.187，相關(guān)系數(shù)為0.9966，說明兩者間存在較好的相關(guān)性。綜合比較傳統(tǒng)病毒滴度的測(cè)定方法，本發(fā)明專利更加快捷、靈敏。
【權(quán)利要求】
1.一種鱖傳染性脾腎壞死病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括如下組分:針對(duì)鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的特異性引物及探針、熒光定量反應(yīng)液、Tap酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述針對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的特異性引物及探針是根據(jù)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒0RF007基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述針對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的特異性引物及探針的序列如下所示:
ISKNV-F: 5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);
ISKNV-R: 5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2);
ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT- Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還含有陽性標(biāo)準(zhǔn)品，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為含有鱖傳染性脾腎壞死病毒DNA的質(zhì)粒。
5.一組用于檢測(cè)鱖傳染性脾腎壞死病毒的熒光定量PCR特異性引物及探針，序列如下所述
ISKNV -F: 5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);
ISKNV-R: 5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2);
ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT- Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3)。
6.一種鱖傳染性脾腎壞死病毒滴度的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟: (O以鱖魚傳染性脾腎壞死病毒0RF007基因保守區(qū)序列作為PCR擴(kuò)增的靶序列，設(shè)計(jì)合成特異性引物和探針； (2)建立質(zhì)?？截悢?shù)與CT值對(duì)應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)利用步驟(1)的特異性引物和探針對(duì)鱖魚傳染性脾腎壞死壞死病毒滴度進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)CT值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出鱖傳染性脾腎壞死病毒滴度與拷貝數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述特異性引物和探針的序列如下所示:
ISKNV - F:5’-CGAGGCCACATCCAACATC-3’ (SEQ ID NO:1);
ISKNV-R:5’-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ (SEQ ID NO:2);
ISKNV-P:5’-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT-Eclipse-3’ (SEQ ID NO:3)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103966358SQ201410166595
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】林強(qiáng), 付小哲, 李寧求, 吳淑勤, 石存斌 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所