一種防治褐飛虱的混合配方制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種防治褐飛虱的混合配方制劑的制備方法。本發(fā)明所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes)，定名為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2007年5月25日，保藏登記號CGMCC?No.2060。本發(fā)明所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D，經(jīng)發(fā)酵提取可獲得對褐飛虱類酵母共生菌具有抑制作用的代謝產(chǎn)物。本發(fā)明最顯著的特征是將淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和常規(guī)殺蟲劑吡蟲啉按照一定的比例混合制備成新的配方，用這混合配方防治褐飛虱可以明顯減少殺蟲劑的使用量，有效提高褐飛虱的防治效果，延緩褐飛虱抗藥性的發(fā)展。
【專利說明】一種防治褐飛虱的混合配方制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和吡蟲啉混合配方制劑。
【背景技術(shù)】
[0002]褐飛風(Nilaparvata lugens Stal )是水稻的重要害蟲之一,主要以刺吸韌皮部汁液和傳播水稻病毒的方式為害水稻植株。蟲害大發(fā)生時會出現(xiàn)大面積的稻株枯死倒伏，造成糧食減產(chǎn)，甚至絕收。生產(chǎn)上，化學農(nóng)藥是防治褐飛虱的主要手段。但是，由于化學殺蟲劑的大量頻繁使用，褐飛虱對許多化學殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，導(dǎo)致防治效果明顯下降。因此，研究和應(yīng)用減少水稻褐飛虱發(fā)生和為害的新手段已迫在眉睫。
[0003]昆蟲與微生物的共生是一種普遍存在的現(xiàn)象，在進化過程中兩者形成了密不可分的關(guān)系。昆蟲為共生菌提供了穩(wěn)定的小生境和營養(yǎng)，而昆蟲依靠共生菌合成食物中缺乏的某些重要營養(yǎng)成分，同時共生菌對昆蟲的代謝解毒也有一定作用，如為昆蟲合成重要的營養(yǎng)成分，參與氮素循環(huán)，降解昆蟲體內(nèi)外源物質(zhì)等。缺失共生菌會直接造成昆蟲生長繁殖受阻、死亡率上升等。研究表明，褐飛虱體內(nèi)腹部脂肪體中也存在多種類酵母共生菌，類酵母菌屬子囊菌亞門(Ascomycotina),核菌綱(Pyrenomycetes), Candida屬。褐飛風類酵母共生菌可為寄主合成提供必需氨基酸、固醇類物質(zhì)以及蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，彌補了褐飛虱取食營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的不平衡，保證了褐飛虱的正常生長和繁殖；酵母類共生菌缺失會導(dǎo)致褐飛虱生長受阻、發(fā)育停滯、甚至死亡。既然褐飛虱與類酵母共生菌在生長繁殖中關(guān)系如此緊密，通過“抑制類酵母共生菌從而間接防治褐飛虱”的手段來控制褐飛虱發(fā)生以及減少其為害必將是今后防治褐 飛虱的一種重要手段。因為抑制褐飛虱體內(nèi)的共生菌不但可直接或間接的達到控制褐飛虱的目的，而且還可有效提高目前殺蟲劑的防治效果、延緩褐飛虱抗藥性的發(fā)展。
[0004]本發(fā)明將淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和常規(guī)殺蟲劑吡蟲啉按照一定的比例混合制備成新的配方，并研究了該配方對褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的抑制作用和對褐飛虱的殺蟲效果。該發(fā)明為水稻褐飛虱的防治提供了新的更為有效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對褐飛虱對常規(guī)化學殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致化學防治效果明顯下降的不足，提供一種利用淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物抑制褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌生長，進而引起褐飛虱衰弱甚至死亡的新思路；本發(fā)明的另一目的是提供了一種防治褐飛虱的新方法和新藥劑。
[0006]本發(fā)明淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes),定名為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期2007年5月25日，保藏登記號CGMCCN0.2060。本發(fā)明所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D，經(jīng)發(fā)酵提取可獲得對褐飛虱類酵母共生菌具有抑制作用的代謝產(chǎn)物。
[0007]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0008]一種防治褐飛虱的混合配方制劑，按以下步驟進行:
[0009](I)菌種的活化培養(yǎng):將分離保存的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D菌種移至試管內(nèi)高氏一號斜面上，在28 °C ± I °C條件下，培養(yǎng)至試管斜面長滿孢子；
[0010](2)發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每1000mL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，麩皮10g, NH4N033g, (NH4) 2S045g, CaC035g, MgSO4Ig,滅菌，待冷卻至40°C，在無菌條件下接種至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在28°C ±1°C條件下，培養(yǎng)5天；
[0011](3)發(fā)酵物提取:發(fā)酵完畢，離心收集發(fā)酵上清液，用常規(guī)有機溶劑萃取經(jīng)真空濃縮后獲得浸膏；
[0012](4)藥液配制:將步驟(3)獲得的浸膏和常規(guī)殺蟲劑配比，用于褐飛虱的防治。
[0013]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供了一種利用淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和吡蟲啉混合配方防治褐飛虱的新方法。
【具體實施方式】
[0014]實施例1:( 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物的制備方法)
[0015]按以下步驟進行:
[0016](I)菌種的活化培養(yǎng):將分離保存的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D菌種移至試管內(nèi)高氏一號斜面上，在28 °C ± I °C條件下，培養(yǎng)至試管斜面長滿孢子；
[0017](2)發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每1000mL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，麩皮10g, NH4N033g, (NH4) 2S045g, CaC035g, MgSO4Ig,滅菌，待冷卻至 40°C，在無菌條件下接種一金屬鉬絲環(huán)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D孢子至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在28°C ±1°C條件下，培養(yǎng)5天；
[0018](3)發(fā)酵物提取:發(fā)酵完畢后離心收集發(fā)酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層，再用等體積正丁醇萃取，取上層，在真空條件下濃縮至浸膏，該浸膏即為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物，供防治褐飛虱用。
[0019]以下實施例2中所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物均為實施例1所制產(chǎn)品。
[0020]實施例2:(淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和吡蟲啉混合配方的制備)
[0021]吡蟲啉水分散粒劑(有效成分質(zhì)量百分比為70% )由拜耳公司生產(chǎn)，將吡蟲啉水分散粒劑和淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物分別用自來水溶解，混合，配成終濃度為0.2g/L淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和0.0I g/L吡蟲啉混合配方。
[0022]實施例3:(淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和吡蟲啉混合配方在防治褐飛虱若蟲中的應(yīng)用)
[0023]按以下步驟進行:
[0024](I)分蘗拔節(jié)期TNl水稻，清除部分根和基部葉鞘后洗凈，自然晾干；
[0025](2)以清水作對照，噴施終濃度為0.2g/L淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和0.01g/L吡蟲啉混合藥劑，要求藥劑霧滴分布均勻，覆蓋率高，藥劑量適當，以濕潤目標物表面不產(chǎn)生流失為宜，自然晾干；
[0026](3)經(jīng)步驟(2)處理后的稻苗放入事先注入20ml水稻培養(yǎng)液的大試管中，每管3根稻苗，接入3齡褐飛虱若蟲30頭，以噴施清水后的水稻苗處理作為陰性對照，噴施0.04g/L吡蟲啉藥液處理為陽性對照，每個處理3次重復(fù)；
[0027](4) 分別在處理后I天、2天和4天測定褐飛虱體內(nèi)共生菌數(shù)量，并統(tǒng)計褐飛虱死亡率。其中褐飛虱體內(nèi)共生菌數(shù)量測定方法為:分別取各處理中存活的褐飛虱3頭，用75%的酒精消毒，無菌水漂洗，去掉翅膀、頭部和胸部，將腹部放入1.5ml離心管中，加入0.9%的生理鹽水50 μ 1，勻漿，然后取2 μ I勻漿液滴于血細胞計數(shù)板上，蓋上蓋破片，在顯微鏡(16X40)下統(tǒng)計共生菌數(shù)量。
[0028]實施例4:(淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和吡蟲啉混合配方在防治褐飛虱雌成蟲中的應(yīng)用)
[0029]按以下步驟進行:
[0030](I)分蘗拔節(jié)期TNl水稻，清除部分根和基部葉鞘后洗凈，自然晾干；
[0031](2)以清水作對照，噴施終濃度為0.2g/L淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和0.01g/L吡蟲啉混合藥劑，要求藥劑霧滴分布均勻，覆蓋率高，藥劑量適當，以濕潤目標物表面不產(chǎn)生流失為宜，自然晾干；
[0032](3)經(jīng)步驟(2)處理后的稻苗放入事先注入20ml培養(yǎng)液的大試管中，每管4根稻苗，接入剛羽化的短翅雌成蟲30頭，以噴施清后的水稻苗處理作為陰性對照，噴施0.04g/L吡蟲啉藥液處理為陽性對照,每個處理3次重復(fù)；
[0033](4)分別在處理后I天、2天和4天測定短翅雌蟲褐飛虱體內(nèi)共生菌數(shù)量，并統(tǒng)計褐飛虱死亡率。其中褐飛虱體內(nèi)共生菌數(shù)量測定方法為:分別取各處理中存活的短翅雌蟲3頭，用75%的酒精消毒，無菌水漂洗，去掉翅膀、頭部和胸部，將腹部放入1.5ml離心管中，加入0.9%的生理鹽水50 μ I,勻楽:,然后取2 μ I勻楽:液滴于血細胞計數(shù)板上,蓋上蓋破片，在顯微鏡(16X40)下統(tǒng)計共生菌數(shù)量。
[0034]試驗例:(本發(fā)明的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和吡蟲啉混合配方與常規(guī)化學農(nóng)藥防治效果對比試驗)
[0035]試驗結(jié)果見表1和表2。從表1和表2看出，利用淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和吡蟲啉混合配方明顯抑制了褐飛虱體內(nèi)共生菌的數(shù)量，從而引起褐飛虱死亡率上升。
[0036]表1淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和吡蟲啉混合藥劑對褐飛虱若蟲的防治效果
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種防治褐飛虱的混合配方制劑的制備方法，這種混合配方制劑包含淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和吡蟲啉。
2.權(quán)利要求1所述的混合配方制劑，其中所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物由菌種活化培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵物提取方法制得。
3.權(quán)利要求1所述的混合配方制劑，其中所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和吡蟲啉的重量百分比為10: 1-20: I。
4.權(quán)利要求1所述的混合配方制劑，由以下方法獲得: (1)菌種的活化培養(yǎng):將分離保存的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D菌種移至試管內(nèi)培養(yǎng)至試管斜面長滿孢子，所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏登記號為CGMCC N0.2060 ；
(2)發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基為黃豆餅粉，玉米粉，麩皮，NH4N033g,(NH4)2SO4, CaCO3,MgSO4，滅菌，待冷，在無菌條件下接種淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D孢子至發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)； (3)發(fā)酵物提取:發(fā)酵完畢，離心收集發(fā)酵上清液，萃取，取下層，再萃取，取上層，在真空條件下濃縮至浸膏，此浸膏即為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物； (4)混合配方配制:將吡蟲啉水分散粒劑和淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物分別用自來水溶解，混合。
5.權(quán)利要求4所述的混合配方制劑，由以下方法獲得: (1)菌種的活化培養(yǎng):將分離保存的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D菌種移至試管內(nèi)高氏一號斜面上，在28°C ±1°C條件下，培養(yǎng)至試管斜面長滿孢子，所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏登記號為CGMCC N0.2060 ； (2)發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每1000mL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，麩皮10g，NH4N033g, (NH4) 2S045g, CaC035g, MgSO4Ig,滅菌，待冷卻至40°C，在無菌條件下接種一金屬鉬絲環(huán)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D孢子至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在28°C ±1°C條件下，培養(yǎng)5天； (3)發(fā)酵物提取:發(fā)酵完畢，離心收集發(fā)酵上清液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層，再用等體積正丁醇萃取，取上層，在真空條件下濃縮至浸膏，此浸膏即為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物； (4)混合配方配制:吡蟲啉水分散粒劑(有效成分質(zhì)量百分比為70%)由拜耳公司生產(chǎn)，將吡蟲啉水分散粒劑和淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物分別用自來水溶解，混合，配成終濃度為0.2g/L淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D代謝產(chǎn)物和0.0I g/L吡蟲啉混合配方。
【文檔編號】C12R1/525GK103960289SQ201410128675
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】俞曉平, 申屠旭萍, 李丹婷 申請人:中國計量學院