牡丹PsSVP基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明從牡丹中分離到PsSVP基因序列。該基因所編碼的蛋白能有效解除花芽?jī)?nèi)休眠，該基因可作為功能基因用于人為調(diào)控花期，保證反季節(jié)催花的植物的培育。
【專利說明】牡丹PsSVP基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種來源于牡丹的PsSVP基因，該基因的編碼產(chǎn)物能有效解除芽?jī)?nèi)休目民，從而達(dá)到人為調(diào)控花期，保證反季節(jié)催花的效果。
【背景技術(shù)】
[0002]牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)屬于茍藥科、茍藥屬的落葉灌木,是原產(chǎn)于我國(guó)的特有名貴花卉，原為野生，經(jīng)過世人長(zhǎng)期的人工培育才被馴化為著名的觀賞花卉，不僅得到國(guó)人的推崇和珍愛，而且受到世界各國(guó)人民的關(guān)注和喜愛。牡丹自然花期較短，一朵花期為3~5d，單株花期僅為6~10d，群體花期為7~15d，牡丹獨(dú)特的魅力使其成為觀賞花中的佼佼者，然而花期的短暫和開花季節(jié)的限制卻達(dá)不到人們賞花的要求，因此牡丹的促成栽培已發(fā)展成為盆花和切花生產(chǎn)的重要形式之一。牡丹的生物學(xué)特性決定了牡丹必須經(jīng)歷內(nèi)休眠這一特殊的生命過程才能正常開花展葉，所以解除花芽休眠成為牡丹促成栽培的重要內(nèi)容和關(guān)鍵技術(shù)之一。
[0003]植物芽休眠的解除過程是非常復(fù)雜的，涉及到新陳代謝，激素調(diào)控，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞分裂分化等多個(gè)方面，是多基因共同作用的結(jié)果。牡丹花芽的休眠屬于典型的內(nèi)休眠，迄今為止，對(duì)牡丹內(nèi)休眠調(diào)控的分子機(jī)理還知之甚少。以牡丹為材料，分離芽休眠調(diào)控的相關(guān)基因，研究其分子功能，對(duì)于揭示芽?jī)?nèi)休眠機(jī)理，人為調(diào)控花期，保證反季節(jié)催花的成功，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。植物內(nèi)休眠這一看似靜止的生命過程伴隨著形態(tài)變化和復(fù)雜的代謝變化。近年來，高通量分析技術(shù)的應(yīng)用，使全基因組范圍內(nèi)分析休眠解除相關(guān)基因和相關(guān)代謝活動(dòng)成為可能。科學(xué)家通過SSH、基因芯片、Macroarray,2-D電泳等技術(shù)篩選，克隆了大量差異表達(dá)基因及蛋白，但多集中在功能基因上。近年來的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)一系列與休眠相關(guān)的MADS-box基因家族DAM (DormancyAssociated MADS-box)編碼的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化較明顯，超表達(dá)MADS-box基因擬南芥中開花相關(guān)基因的表達(dá)分析結(jié)果表明，MADS-box基因通過調(diào)控開花促進(jìn)基因和開花抑制基因的表達(dá)顯著的影響開花時(shí)間早晚。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合Macroarray技術(shù),篩選出了 9個(gè)MADS-box基因的EST，其中包含類SVP基因的部分EST，經(jīng)BlastP分析為MIKC型。本研究擬以此為切入點(diǎn)，解析MADS-box基因在低溫處理?xiàng)l件下的表達(dá)規(guī)律和超表達(dá)MADS-box基因擬南芥的春化時(shí)間的調(diào)控，對(duì)于理解內(nèi)休眠解除相關(guān)基因MADS-box家族成員對(duì)開花時(shí)間調(diào)控作用，進(jìn)一步解析MADS-box家族成員的相互作用和篩選下游相關(guān)的未知蛋白，深入理解花芽?jī)?nèi)休眠的分子機(jī)理具有重要的理論價(jià)值。研究結(jié)果也為牡丹冬季反季節(jié)栽培提供理論指導(dǎo)，為牡丹催花品種的分子育種提供候選基因。
[0004]類SVP基因?qū)儆贛ADS-box基因家族中的一種，具有高度保守的MADS-box結(jié)構(gòu)域和半保守的能形成卷曲螺旋的K區(qū)，在植物中廣泛存在，被認(rèn)為是其最重要最基本的功能是參與花器官發(fā)育的調(diào)控， 很多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了 MADS-box通過調(diào)控開花促進(jìn)基因和開花抑制基因的表達(dá)顯著的影響開花時(shí)間早晚。
[0005]本發(fā)明的主要目的是克隆牡丹中的PsSVP基因，使其能夠作為優(yōu)秀的調(diào)控基因轉(zhuǎn)化到植物中，有效解除芽?jī)?nèi)休眠，從而達(dá)到人為調(diào)控花期，保證反季節(jié)催花的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)解除芽?jī)?nèi)休眠、調(diào)控花期的來源于牡丹的PsSVP基因。
[0007]本發(fā)明提供的牡丹PsSVP基因，是下列核苷酸序列之一:
[0008]序列表中的SEQ ID NO:1所示的第I位至1366位的核苷酸序列；
[0009]與序列表中SEQ ID NO:1所示的第I位至1366位的核苷酸序列具有超過90%同源性，并同時(shí)具有相同功能的DNA類似物。
[0010]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種牡丹PsSVP基因編碼的具有解除芽?jī)?nèi)休眠功能的蛋白質(zhì)，是具有序列SEQ ID NO: 2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì),或?qū)EQ ID NO: 2的氣基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)、幾個(gè)或一些氨基酸殘基的取代、缺失或添加，具有與SEQ ID N0:2的氨基酸序列相同活性且同源性超過90%的由序列SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)。
[0011]含有上述核苷酸序列的表達(dá)載體、重組宿主菌，及將表達(dá)載體或重組宿主菌導(dǎo)入植物細(xì)胞核植物所獲得的重組植物細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因植株，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]可以將本發(fā)明提供的牡丹PsSVP基因或同源性超過90%并具有相同功能的DNA類似物導(dǎo)入觀賞性花期 植物，以期達(dá)到人為調(diào)控花期，保證反季節(jié)催花的效果。為冬季反季節(jié)栽培提供前提，促進(jìn)花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1EASYspin法提取牡丹總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
[0014]圖2PsSVP 的 5’ -RACE PCR 產(chǎn)物電泳圖；
[0015]圖3PsSVP推定的氨基酸序列與其它來源的PsSVP蛋白的同源性比對(duì)(clustalW)，*號(hào)代表相同的氨基酸位點(diǎn)；
[0016]圖4PsSVP與其它物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；
[0017]圖5PsSVP基因?qū)崟r(shí)定量引物PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0018]圖6PsSVP基因在低溫處理不同時(shí)間的牡丹花芽中的表達(dá)；
[0019]圖7PsSVP基因在牡丹不同組織中的表達(dá)；
[0020]圖8PsSVP PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0021]圖9PsSVP3’ UTR目的片段菌落PCR檢測(cè)電泳圖；
[0022]圖1OPsSVP基因編碼區(qū)分析；
[0023]圖1 IPsSVP基因氨基酸序列分析；
[0024]圖12PsSVP 基因 3’ UTR 分析；
[0025]圖13PsSVP_pBI121表達(dá)載體構(gòu)建流程圖；
[0026]圖HPsSVP完整開放閱讀框的PCR產(chǎn)物電泳圖；
[0027]圖15PsSVP目的片段的菌液PCR檢測(cè)電泳圖；
[0028]圖16pMD_PsSVP重組質(zhì)粒的Xbal/SacI雙酶切檢測(cè)電泳圖；
[0029]圖17pBI121質(zhì)粒載體的XbaI和SacI雙酶切電泳圖；
[0030]圖18轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗生素篩選對(duì)比圖；[0031]圖19轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定電泳圖；
[0032]圖20轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型觀察圖。
[0033]圖21下游開花基因FT、S0CULFY的表達(dá)電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下文通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0035]實(shí)施例1
[0036]牡丹PsSVP基因全長(zhǎng)cDNA的獲得，表達(dá)分析及家族成員的確定
[0037]試驗(yàn)材料來自山東省菏澤市的牡丹研究所，一般為4-5年生的牡丹品種“魯荷紅”(Paeonia suffruticosa)的健壯植株?；ㄑ啃螒B(tài)大小要求在(縱徑X橫徑)1.60cmX0.6cm以上，每株有6-8枝，每個(gè)枝條上都有1-2個(gè)正常發(fā)育的花芽。
[0038]大腸桿菌菌株為DH5 α ,載體為 pMD18_T simple (TaKaRa)0
[0039]材料處理與取樣
[0040]2011年9月28日‘魯荷紅’起苗，單株栽植于直徑33厘米、高22厘米盆內(nèi)，澆足水，將盆埋入大田。
[0041]第一組處理:根據(jù)(Uath)模型，待日最低氣溫達(dá)10°C時(shí)(大約為11月10日)，此時(shí)低溫處理0d，作為對(duì)照TC，取樣，選取一定數(shù)量剛剛進(jìn)入休眠期的4-5年生‘魯荷紅’健壯植株轉(zhuǎn)移至18_25°C的溫室中，直至12月18日，期間每隔7d取樣，將幾盆植株轉(zhuǎn)溫室，一共5個(gè)不同低溫處理。
[0042](I)對(duì)照(TO ):4°C 下處理 OcL
[0043](2)處理一(Tl):4°C條件下處理7d后轉(zhuǎn)至18_22°C條件下生長(zhǎng)。
[0044](3)處理二(T2):4°C條件下處理14d后轉(zhuǎn)至18_22°C條件下生長(zhǎng)。
[0045](4)處理三(T3):4°C條件下處理21d后轉(zhuǎn)至18_22°C條件下生長(zhǎng)。
[0046](5)處理四(T4):4°C條件下處理28d后轉(zhuǎn)至18_22°C條件下生長(zhǎng)。
[0047]各處理入溫室前，隨機(jī)選取健壯頂芽64個(gè)，剝?nèi)[片后，液氮速凍，-80°C保存，其余搬入溫室。
[0048]第二組處理:低溫處理后在室溫下處理。
[0049](1)4°C下處理7d，移入溫室后ld，3d，5d后，分別隨機(jī)選取健壯頂芽若干個(gè)，剝?nèi)[片后，液氮速凍，_80°C保存。
[0050](2)4°C下處理21d，移入溫室后ld，3d，5d后，分別隨機(jī)選取健壯頂芽若干個(gè)，剝?nèi)[片后，液氮速凍，_80°C保存。
[0051]第三組處理:GA3激素處理。
[0052](I) 4°C下處理0d，移入溫室后注射GA3激素，待12h，24h，48h，5d后，分別隨機(jī)選取健壯頂芽若干個(gè)，剝?nèi)[片后，液氮速凍，-80°C保存。
[0053](2) 4°C下處理7d，移入溫室后注射GA3激素，待12h，24h，48h，5d后，分別隨機(jī)選取健壯頂芽若干個(gè)，剝?nèi)[片后，液氮速凍，-80°C保存。
[0054]第四組處理:未經(jīng)低溫處理萌動(dòng)后始花期的牡丹各組織:根、莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊和心皮,液氮速凍，-80°C保存。
[0055]實(shí)驗(yàn)用試劑=EASYspin植物RNA快速提取試劑盒、RNaseA (50 μ g/ μ L)(上海生工)、Taq DNA聚合酶(TaKaRa)、SMART RACE cDNA合成試劑盒(Clontech)、限制性內(nèi)切酶BamH 1、Hind II1、EcoR 1、EcoR V、Kpn 1、Xba I (NEB，北京)、SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒、DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche)、Agarose Gel DNA Purification (TaKaRa)、無水乙醇、苯酹/氯仿/異戍醇、瓊脂糖、LBMedium、DEPC。
[0056]1、牡丹花芽總RNA的提取及檢測(cè)
[0057]EASYspin植物RNA快速提取按原平皓生物公司的試劑盒說明書進(jìn)行。
[0058](1)室溫下，研缽中加入 2mL RLT, 100 μ L PLANTaid，20 μ L β -巰基乙醇。
[0059](2)稱取200mg牡丹花芽放入研缽，室溫下研磨成勻漿，注意應(yīng)該迅速研磨讓花芽和裂解液RLT完全混合從而抑制RNA酶的活性。
[0060](3)將裂解物轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，劇烈搖晃振蕩15s, 13000rpm離心5_10min,沉淀一些無法裂解碎片及PLANTaid (結(jié)合有多糖多酚)，取450 μ L裂解物上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。
[0061](4)加入二分之一上清體積的無水乙醇，沉淀有可能會(huì)出現(xiàn)，但其不影響此實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，立即用槍吹打、混勻，不要離心。
[0062](5)將混合物分兩次加入到一個(gè)提前放好收集管的吸附柱RA中，13000rpm離心
60s，棄掉廢液。
[0063](6)加700 μ L去蛋白液RWl，室溫放置5min，12000rpm離心30s，棄掉廢液。
[0064](7)加500 μ L漂洗液RW (RW:無水乙醇=1:4)，12000rpm離心30s，棄掉廢液。重
復(fù)一次。
[0065](8)將吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。
[0066](9)取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜中間部位加IOOyL RNase free water (事先在70_90°C水浴中加熱效果更好),室溫放置lmin, 12000rpm 離心 lmin。
[0067](10)使用第一次的洗脫液加到吸附柱重復(fù)步驟一遍。
[0068](11)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0069]總RNA中基因組DNA的酶解
[0070](I)每100 μ LRNA溶液中加入如表1中的試劑:
[0071]表1
【權(quán)利要求】
1.一種來源于牡丹的解除花芽?jī)?nèi)休眠基因PsSVP的DNA序列或具有與之相同功能和相似結(jié)構(gòu)的DNA類似物，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因的編碼產(chǎn)物，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示，或?qū)EQID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)、幾個(gè)或一些氨基酸殘基的取代、缺失或添加，具有與SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同活性且同源性超過90%的由序列SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)。
3.解除花芽?jī)?nèi)休眠基因PsSVP基因的超表達(dá)載體，其特征在于帶有權(quán)利要求1所述的解除花芽?jī)?nèi)休眠基因的SEQ ID NO:1核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要 求1所述解除花芽?jī)?nèi)休眠宿主菌。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103937811SQ201410128359
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】張玉喜, 蓋樹鵬, 張揚(yáng) 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)