一種用于玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度鑒定的ssr引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度鑒定的SSR引物，所述引物包括引物ChQSSR304的上游引物ChQSSR304-F和下游引物ChQSSR304-R，所述上游引物ChQSSR304-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述下游引物ChQSSR304-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。還公開了一種玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度的鑒定方法，該引物和方法可對玲瓏節(jié)瓜雜交種子及其母本、父本種子進(jìn)行有效區(qū)分，快速、準(zhǔn)確檢測出雜交種子純度，同時具有快速、準(zhǔn)確、低成本、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種用于玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度鑒定的SSR引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于雜交種子純度鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度的鑒定的SSR引物及鑒定玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]種子純度是種子質(zhì)量檢驗(yàn)的最主要的質(zhì)量指標(biāo)之一。植物新品種特異性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和穩(wěn)定性(Stability)的測試(簡稱 DSU 測試)是農(nóng)業(yè)部植物新品種保護(hù)辦公室對申請品種授予新品種權(quán)進(jìn)行實(shí)質(zhì)審查最重要的工作內(nèi)容。
[0003]玲瓏節(jié)瓜是雜交一代節(jié)瓜品種。制種時，親本(父本和母本)繁種田、一代雜種制種田與其它品種或類型的節(jié)瓜、冬瓜材料須嚴(yán)格隔離，隔離距離1000米以上。制種時母本和父本按照一定比例分行種植，母本雌花開花前，母本植株逐一去雄。開花期利用昆蟲媒介或者人工輔助的方法將父本的花粉授到母本的雌花柱頭上，從而產(chǎn)生雜交種子。如果母本去雄不徹底，母本的花粉就有可能落到母本的雌花柱頭上產(chǎn)生自交種子，出現(xiàn)假雜種，這是制種過程導(dǎo)致種子不純的最主要原因；此外，如果父本行植株未能及時鏟除，也有可能將父本果實(shí)混入雜交果實(shí)，造成混雜。因此雜交種子在銷售前必須做純度鑒定，符合國家對雜交種子純度標(biāo)準(zhǔn)的才能出售給客戶。
[0004]傳統(tǒng)的節(jié)瓜雜種純度鑒定都是在田間進(jìn)行，根據(jù)植株的形態(tài)特征對雜種群體進(jìn)行純度識別，由于多數(shù)特征性狀需要在結(jié)果期才能識別，雜種純度鑒定通常需要2-3個月方可完成，所需周期長 ，并需占用土地和人力，且鑒定結(jié)果受環(huán)境影響大，不良?xì)夂?、病蟲為害和栽培水平均會使純度鑒定準(zhǔn)確性降低。20世紀(jì)后期，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，使從DNA分子水平上對品種純度進(jìn)行基因鑒定和分析成為可能。采用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種子純度鑒定是一種快速、便捷、準(zhǔn)確、有效的方法。目前，現(xiàn)有技術(shù)中仍未建立對節(jié)瓜雜交種子純度鑒定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一個目的在于提供一種用于玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度鑒定的SSR引物，該引物能產(chǎn)生母本特異性標(biāo)記和父本特異性標(biāo)記，特異性強(qiáng)。
[0006]本發(fā)明的目的還在于提供一種玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度的鑒定方法，該方法利用上述SSR引物，能快速、便捷、準(zhǔn)確、有效的鑒定玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度。
[0007]本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種用于玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度鑒定的SSR引物，所述引物包括引物ChQSSR304的上游引物ChQSSR304_F和下游引物ChQSSR304-R,所述上游引物ChQSSR304_F的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述下游引物ChQSSR304-R的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]引物ChQSSR304的上游引物ChQSSR304_F和下游引物ChQSSR304_R的具體核苷酸序列如下:
[0009]ChQSSR304-F:5，-GGGGCCTGAAAATGAAGTAA-3，(SEQ ID N0.1)；[0010]ChQSSR304-R:5’ -AAAACATGGTCTAGGGCTATGC-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0011]該標(biāo)記帶型清晰、重復(fù)性好，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳時，電泳結(jié)果顯示，弓丨物ChQSSR304能產(chǎn)生185bp的父本特異性標(biāo)記SSR304185 (序列如SEQ ID N0.3中所示)和156bp的母本特異性標(biāo)記SSR304156 (序列如SEQ ID N0.4中所示)。
[0012]本發(fā)明的第二個目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度的鑒定方法，含以下步驟:
[0013](I)提取節(jié)瓜幼苗的基因組DNA ；
[0014](2)以節(jié)瓜基因組DNA為模板，使用上述SSR引物ChQSSR304進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0015](3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；
[0016](4)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，只有同時具有親本特異性條帶的單株才為真正的雜交種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種，計(jì)算種子純度，其中，SSR引物ChQSSR304能產(chǎn)生185bp的父本特異性標(biāo)記ChQSSR304185以及156bp的母本特異性標(biāo)記ChQSSR304156。
[0017]在上述各步驟中:
[0018]本發(fā)明步驟⑵中PCR擴(kuò)增時采用的反應(yīng)體系優(yōu)選為:基因組DNAlOng，10XPCRbuffer (含 Mg2+):2μ L,2.5Mm dNTP:1.5 μ L，SSR 引物 ChQSSR3040.25mmol.?Λ Taq 酶 IU，ddH20 補(bǔ)足至 20 μ L。
[0019]本發(fā)明步驟(2)中PCR擴(kuò)增時擴(kuò)增程序優(yōu)選為:95°C預(yù)變性3min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環(huán)后，72°C終延伸7min，置于4°C保存。
[0020]本發(fā)明步驟(3)中凝膠電泳時優(yōu)選采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0021]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0022](I)本發(fā)明中的SSR引物ChQSSR304能產(chǎn)生父本特異性標(biāo)記和母本特異性標(biāo)記，特異性強(qiáng)；
[0023](2)本發(fā)明的方法可將玲瓏節(jié)瓜雜交種子與其父母本區(qū)分開來，快速檢測出雜交種子的純度；
[0024](3)本發(fā)明方法具有快速、準(zhǔn)確、低成本，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為是實(shí)施例1中玲瓏節(jié)瓜種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜(M: marker I分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:父本江心節(jié)6號；2:母本強(qiáng)雌系4號；3:商品種玲瓏節(jié)瓜；圓圈內(nèi)的條帶為SEQ ID NO: 3，長方形內(nèi)的條帶為SEQ ID NO: 4)；
[0026]圖2為實(shí)施例2中實(shí)驗(yàn)室內(nèi)種植小苗種子純度抽樣鑒定的部分結(jié)果(M:markerl分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:父本江心節(jié)6號；2:母本強(qiáng)雌系4號；21，31:假雜種；3-20，22-30, 32:抽樣商品種玲瓏節(jié)瓜)；
[0027]圖3為實(shí)施例3中大豐基地玲瓏節(jié)瓜種子純度抽樣的部分結(jié)果(M:markerl分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:父本江心節(jié)6號；2:母本強(qiáng)雌系4號；3-30:抽樣商品種玲瓏節(jié)瓜)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1雜交種玲瓏節(jié)瓜種子純度檢測方法的建立[0029]1、篩選純度鑒定的SSR引物
[0030]根據(jù)冬瓜轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計(jì)的引物若干對在親本(父本江心節(jié)6號，母本強(qiáng)雌系4號)及子代間進(jìn)行篩選，選出共顯性差異標(biāo)記條帶的引物ChQSSR304，該標(biāo)記帶型清晰、重復(fù)性好，序列如下所示:
[0031 ] ChQSSR304-F: 5，-GGGGCCTGAAAATGAAGTAA-3，(SEQ ID NO:1)
[0032]ChQSSR304-R:5，-AAAACATGGTCTAGGGCTATGC-3’ (SEQ ID NO:2) ?
[0033]以節(jié)瓜基因組DNA為模板，使用上述SSR引物ChQSSR304進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示，SSR引物ChQSSR304能產(chǎn)生185bp的父本特異性標(biāo)記ChQSSR304185以及156bp的母本特異性標(biāo)記ChQSSR304156。
[0034]2、利用上述特異性引物對雜交節(jié)瓜玲瓏節(jié)瓜種子進(jìn)行純度鑒定
[0035]2.1節(jié)瓜DNA的提取
[0036]實(shí)驗(yàn)材料為節(jié)瓜玲瓏節(jié)瓜實(shí)驗(yàn)種及其父本(江心節(jié)6號)、母本(強(qiáng)雌系4號)子葉DNA，步驟如下:
[0037]①取一片子葉放入2mL離心管中，加入液氮用研磨杵研磨，在液氮快蒸干時迅速加入1000 μ L2% CTAB提取液，混勻后置于65°C水浴50min (每隔IOmin搖勻一次)；
[0038]②靜置至室溫 后離心，12000rmp, IOmin,取上清(約800 μ L)轉(zhuǎn)移至新的2mL離心管；
[0039]③加入與步驟2中上清液等體積的酚:氯仿:異戊醇混合物，該混合物中各組分的體積比為25:24:1 ;劇烈震蕩，靜置5min，12000rmp，10min，取上清液(約SlOyL)轉(zhuǎn)入
1.5mL離心管中；
[0040]④加入2/3體積340 μ L預(yù)冷的異丙醇，緩慢搖勻(緩慢顛倒20次)，置于_20°C下培養(yǎng)Ih ；
[0041]⑤離心，4°C, 13000rmp, IOmin,棄上清，用預(yù)冷的75%乙醇(體積百分比)洗漆DNA1-2次，放在超凈工作臺上吹干；
[0042]⑥加入100 μ L TE溶解。
[0043]2.2SSR-PCR 擴(kuò)增
[0044]PCR 體系(20 μ L)
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種用于玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度鑒定的SSR引物，其特征是:所述引物包括引物ChQSSR304的上游引物ChQSSR304-F和下游引物ChQSSR304_R，所述上游引物ChQSSR304_F的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述下游引物ChQSSR304-R的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.—種玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度的鑒定方法，其特征是:含以下步驟: (1)提取節(jié)瓜幼苗的基因組DNA； (2)以節(jié)瓜基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求1中的引物ChQSSR304進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳； (4)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，只有同時具有親本特異性條帶的單株才為真正的雜交種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種，計(jì)算種子純度，其中，引物ChQSSR304能產(chǎn)生185bp的父本特異性標(biāo)記ChQSSR304185以及156bp的母本特異性標(biāo)記ChQSSR304156。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度的鑒定方法，其特征是:步驟(2)中PCR擴(kuò)增時采用的反應(yīng)體系為:基因組DNAIOng，10XPCR buffer (含Mg2+) 2 μ L，2.5Mm dNTP:1.5 μ L，SSR 引物 ChQSSR3040.25mmol.?Λ Taq 酶 IU，ddH20 補(bǔ)足至 20 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度的鑒定方法，其特征是:步驟(2)中PCR擴(kuò)增時擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性3min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環(huán)后，72°C終延伸7min，置于4°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玲瓏節(jié)瓜雜交種子純度的鑒定方法，其特征是:步驟(3)中凝膠電泳時采用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
【文檔編號】C12Q1/68GK103993070SQ201410119286
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】何曉明, 彭慶務(wù), 郭明鑫, 謝大森, 江彪, 羅少波, 黃智文, 劉文睿, 林毓娥, 劉洪彪 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 廣東科農(nóng)蔬菜種業(yè)有限公司