一種茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法
【專(zhuān)利摘要】一種茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，其步驟如下：（1）從茯磚茶中篩選金花菌菌種；（2）制備改良PDA發(fā)酵液，無(wú)菌操作接種金花菌，培養(yǎng)；（3）制備成金花菌孢子接種液；（4）將茶葉下腳料粉碎，制成培養(yǎng)基質(zhì)；（5）將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內(nèi)；（6）完成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)閉囊殼產(chǎn)生；（7）發(fā)酵；（8）基質(zhì)干燥，篩分，獲得純度較高的金花菌粉。本發(fā)明發(fā)酵步驟一次性完成；對(duì)設(shè)備要求較低，同時(shí)減少了雜菌的污染；降低了雜菌污染概率；成本較低，提高了生長(zhǎng)面積，菌粉產(chǎn)率較高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及菌種培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法。【背景技術(shù)】
[0002]金花菌學(xué)名為冠突散囊菌crisiar應(yīng))，主要存在于黑茶中的獲磚茶內(nèi)，是我國(guó)制茶行業(yè)唯一二級(jí)機(jī)密保護(hù)菌種，其在茶葉上生長(zhǎng)產(chǎn)生的閉囊殼堆積成肉眼可見(jiàn)的金黃色顆粒，人工將其篩分出來(lái)即為金花菌粉，簡(jiǎn)稱(chēng)為金花。近年來(lái)大量研究資料表明金花菌粉對(duì)高血壓、高血脂、糖尿病等疾病具備良好的保健效果，并有提高機(jī)體免疫力的作用。
[0003]隨著金花菌保健功效的發(fā)掘，對(duì)其產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)成為了時(shí)下研究的熱點(diǎn)，這就需要大量的金花菌粉作為研究材料。金花菌生長(zhǎng)條件較為苛刻，對(duì)氧氣、濕度、培養(yǎng)基質(zhì)均有嚴(yán)格的要求，往往只在發(fā)酵良好的茯磚茶內(nèi)部有少量存在，因此從茯磚茶中大量收集金花菌粉的方案是不現(xiàn)實(shí)的。而通過(guò)常規(guī)培養(yǎng)基(如PDA、CZG)培養(yǎng)的金花菌粉，卻不具備茶葉內(nèi)所篩分金花菌粉的品質(zhì)(菌花香較低、顏色較暗淡)。
[0004]中國(guó)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?201210470477.7)提供了一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，但該專(zhuān)利申請(qǐng)存在下述不足:
(1)使用250mL/500mL錐形瓶作為培養(yǎng)容器、麩皮平鋪厚度為1.0~1.3cm，一次培養(yǎng)獲得的曲種較少；
(2)首先需發(fā)酵培養(yǎng)獲得曲種，再以發(fā)酵完成的曲種擴(kuò)大培養(yǎng)，所有操作均需在無(wú)菌條件下進(jìn)行，發(fā)酵容器外需包裹8層紗布，且(T36h時(shí)還需加蓋透氣封口膜，其操作較為繁瑣，不適宜大批量生產(chǎn)。`
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:解決現(xiàn)有茯磚茶金花菌粉產(chǎn)率低的問(wèn)題，而提供一種茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，產(chǎn)率可達(dá)到等重量茯磚茶的6倍以上，對(duì)金花保健產(chǎn)品的研發(fā)具有重要意義。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，其步驟如下:
Cl)從茯磚茶中篩選金花菌菌種；
(2)制備改良PDA發(fā)酵液，無(wú)菌操作接種金花菌，28°C培養(yǎng)6d；
(3)將發(fā)酵液瓶180rpm振蕩20min，使金花菌孢子與菌絲分離，之后用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾除去菌絲，制成金花菌孢子接種液；
(4)將茶葉下腳料粉碎，加入茶葉下腳料重量30%左右自來(lái)水充分混勻成培養(yǎng)基質(zhì)，將基質(zhì)平鋪在不銹鋼方盤(pán)發(fā)酵容器內(nèi)，調(diào)節(jié)厚度為2.5cm~3.5 cm，蓋上玻璃蓋，100°C烘lh，冷卻24h后重復(fù)烘Ih ；
(5)將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內(nèi)，均勻噴灑到冷卻的培養(yǎng)基質(zhì)表面，Ikg基質(zhì)用接種液15~20mL，蓋上玻璃蓋，67°C預(yù)烘Ih ；
(6)將容器取出置于28°C環(huán)境下持續(xù)發(fā)酵3d，待白色菌絲遍布基質(zhì)表面并開(kāi)始轉(zhuǎn)黃時(shí)，即完成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，此時(shí)提高室溫為3(T32°C并加強(qiáng)室內(nèi)空氣流通，以促進(jìn)閉囊殼產(chǎn)生；
(7)發(fā)酵6d時(shí)取下玻璃蓋，拌勻發(fā)酵底物，控溫為38~42°C干燥；
(8)待基質(zhì)充分干燥后，100目電動(dòng)篩重復(fù)篩分兩次，獲得純度較高的金花菌粉。
[0007]上述技術(shù)方案中，所述步驟(1)從茯磚茶中篩選金花菌菌種，金花菌菌種從湖南益陽(yáng)茶廠有限公司08年產(chǎn)金湘益牌茯磚茶中分離純化獲得，經(jīng)廣東微生物研究所鑒定為冠關(guān)散囊囷。
[0008]上述技術(shù)方案中，所述步驟(2)制備改良PDA發(fā)酵液，每升培養(yǎng)基使用200g馬鈴薯、50g蔗糖，方法為將去皮切碎的馬鈴薯置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入蔗糖并攪拌溶解，定容至1000mL,分裝三角瓶滅菌。
[0009]上述技術(shù)方案中，所述步驟(3)中金花菌孢子接種液，其具體制備方法為，待改良PDA發(fā)酵液滅菌冷卻后，無(wú)菌操作接入金花菌，28°C靜置培養(yǎng)6d至產(chǎn)生大量的金花菌菌體，將三角瓶置搖瓶機(jī)上180rpm振蕩20min使金花菌孢子與菌絲分離，之后用雙層紗布過(guò)濾去除菌絲，即獲得金花菌孢子接種液；所述的金花菌孢子接種液，通過(guò)涂布平板法測(cè)定孢子含量> IO8 個(gè) /mL。
[0010]上述技術(shù)方案中，所述步驟(4)中所述的發(fā)酵容器為不銹鋼方盤(pán)(500cmX350cmX4.5cm),容器蓋為面積略大于方盤(pán)的玻璃，以便于在發(fā)酵過(guò)程中觀察，玻璃蓋上后應(yīng)無(wú)明顯空隙。使用時(shí)將培養(yǎng)基質(zhì)放在方盤(pán)內(nèi)攤平，厚度不超過(guò)3.5cm，每盤(pán)約可容納基質(zhì)500g。該容器蓋上玻璃后為半封閉狀態(tài)，可有效控制培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)的水分緩慢散發(fā)，培養(yǎng)基質(zhì)前期濕度較大利于菌`絲生長(zhǎng)，后期濕度降低則可促使耐干燥的閉囊殼產(chǎn)生。玻璃蓋與方盤(pán)之間的縫隙有利于空氣交換，滿(mǎn)足了金花菌對(duì)氧氣的需求，同時(shí)外界霉菌孢子也不易透過(guò)縫隙對(duì)基質(zhì)造成污染，正確操作下每盤(pán)培養(yǎng)基質(zhì)雜菌污染面積< 2cm2。
[0011]上述技術(shù)方案中，所述步驟(5)中67°C預(yù)烘Ih是金花菌發(fā)酵前的關(guān)鍵步驟，通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，金花菌孢子在67°C條件下可存活2~3h，67°C預(yù)烘Ih即可有效殺死接種過(guò)程中所污染的雜菌，并且不對(duì)金花菌孢子的活性造成影響，使本工藝對(duì)環(huán)境要求較低，無(wú)需使用無(wú)菌操作間等設(shè)施。
[0012]上述技術(shù)方案中，所述步驟(6)菌絲開(kāi)始轉(zhuǎn)黃并產(chǎn)生少量閉囊殼時(shí)，應(yīng)及時(shí)升溫以促進(jìn)閉囊殼產(chǎn)生。
[0013]上述技術(shù)方案中，所述步驟(7)所述的發(fā)酵6d時(shí)基質(zhì)應(yīng)布滿(mǎn)金花菌閉囊殼且顆粒飽滿(mǎn)豐富，干燥過(guò)程中溫度不應(yīng)超過(guò)42°C，此過(guò)程可進(jìn)一步促使金花菌閉囊殼產(chǎn)生。
[0014]上述技術(shù)方案中，所述步驟(8)產(chǎn)品金花菌粉為金黃色粉末狀，輕嗅有菌花香，在潮濕處易結(jié)塊且顏色加深，置于密封清潔容器干燥處保存。
[0015]本發(fā)明和現(xiàn)有的專(zhuān)利與文獻(xiàn)相比，具備以下顯著優(yōu)點(diǎn):
(O由孢子懸液直接接種至培養(yǎng)基質(zhì)，發(fā)酵步驟一次性完成；
(2)對(duì)設(shè)備要求較低，全過(guò)程中除接種液制備外均不需要無(wú)菌環(huán)境；
(3)利用改良發(fā)酵容器，發(fā)酵量較大，半封閉式發(fā)酵滿(mǎn)足了金花菌生長(zhǎng)所需的氧氣與濕度，同時(shí)減少了雜菌的污染；
(4 )接種之后控溫預(yù)烘，殺死雜菌而保存了金花菌孢子活力，進(jìn)一步降低了雜菌污染概率；
(5)利用茶葉下腳料作為培養(yǎng)基質(zhì)，成本較低，所產(chǎn)金花菌粉與茯茶內(nèi)金花菌粉品質(zhì)一致(培養(yǎng)基質(zhì)化學(xué)成分相似);
(6)培養(yǎng)基質(zhì)經(jīng)粉碎，提高了生長(zhǎng)面積，菌粉產(chǎn)率較高，每公斤茶葉渣可收獲純金花菌粉50g以上(傳統(tǒng)工藝從粉碎茯磚茶內(nèi)提取金花菌粉的產(chǎn)率為0.6%~0.8%)0
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為金花菌菌種CZG培養(yǎng)基生長(zhǎng)7d照片；
圖2為金花菌孢子接種液照片；
圖3為黑茶下腳料培養(yǎng)金花6d照片；
圖4為二次過(guò)篩的金花照片；
圖5為不同預(yù)烘溫度與發(fā)酵狀況之間的關(guān)系表；
圖6為本發(fā)明工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]從茯磚茶中篩選金花菌菌種，金花菌的分離純化:金花菌來(lái)源為湖南省益陽(yáng)茶廠有限公司08年產(chǎn)金湘益牌茯磚茶。具體分離純化步驟為:用鑷子取茯磚茶磚心處長(zhǎng)有金花的茶葉IOg,加入到裝有90mL 無(wú)菌水的三角瓶?jī)?nèi)，蓋上無(wú)菌封口膜,置搖床上180rpm振搖20min,制成10-2倍樣品稀釋液，梯度稀釋至10_6，取ImL稀釋液涂布于CZG平板上，28°C培養(yǎng)5飛d，用接種針挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的金花菌菌落進(jìn)行劃線分離，重復(fù)劃線2~3次后獲得純培養(yǎng)金花菌菌種。
[0018]純培養(yǎng)的金花菌菌種見(jiàn)附圖1。
[0019]金花菌孢子接種液的制作:馬鈴薯200g洗凈去皮，加1000mL水煮沸20min后過(guò)濾，濾液加入50g鹿糖,攪拌至溶解后,分裝滅菌。接種金花菌，28°C培養(yǎng)6d后,置于搖瓶機(jī)上180rpm振搖20min,雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾即為金花菌孢子接種液。
[0020]金花菌孢子接種液見(jiàn)附圖2。
[0021]培養(yǎng)基質(zhì)制備:將茶葉下腳料用植物粉碎機(jī)粉碎，稱(chēng)量1000g加入300g自來(lái)水，攪拌均勻后平鋪到不銹鋼方盤(pán)內(nèi)，厚度調(diào)節(jié)為2.5cm左右，最厚處不超過(guò)3.5cm,基質(zhì)無(wú)需壓緊，蓋上玻璃蓋并確認(rèn)四周無(wú)孔隙。將準(zhǔn)備好的方盤(pán)放入烘箱，調(diào)節(jié)溫度為100°C維持lh，冷卻24h后，重復(fù)升溫至100 C維持lh，取出冷卻備用。
[0022]接種與培養(yǎng):將金花菌孢子接種液倒入用70%酒精消過(guò)毒的噴壺內(nèi)，揭開(kāi)玻璃蓋，將接種液均勻噴灑到冷卻的培養(yǎng)基質(zhì)上。蓋上玻璃蓋，將方盤(pán)置烘箱67°C烘lh，取出置于28°C環(huán)境下發(fā)酵3d，待白色的營(yíng)養(yǎng)菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)基質(zhì)表明并開(kāi)始轉(zhuǎn)黃時(shí)，將室溫升高至3(T32°C，并每日打開(kāi)門(mén)窗透氣半小時(shí)，以促進(jìn)子囊果大量產(chǎn)生。
[0023]不同預(yù)烘溫度與發(fā)酵狀況之間的關(guān)系見(jiàn)附表圖5。
[0024]干燥與金花收集:發(fā)酵6d左右，此時(shí)金花布滿(mǎn)了培養(yǎng)基質(zhì)，將玻璃蓋揭去，拌勻基質(zhì)，提高室溫為38°C~42°C，48h 左右即可干燥充分，將干燥基質(zhì)置于100目電動(dòng)振搖篩中振搖3min，便將大部分金花篩下，再次過(guò)100目篩即獲得純度較高的金花，用自封袋將金花包裝好放置在陰涼干燥處儲(chǔ)存。[0025]發(fā)酵6d的培養(yǎng)基質(zhì)見(jiàn)附圖3。 [0026]二次過(guò)篩的金花見(jiàn)附圖。
【權(quán)利要求】
1.一種茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，其特征在于，其步驟如下: (1)從茯磚茶中篩選金花菌菌種； (2)制備改良PDA發(fā)酵液，無(wú)菌操作接種金花菌，28°C培養(yǎng)6d； (3)將發(fā)酵液瓶180rpm振蕩20min，使金花菌孢子與菌絲分離，之后用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾除去菌絲，制成金花菌孢子接種液； (4)將茶葉下腳料粉碎，加入茶葉下腳料重量30%左右自來(lái)水充分混勻成培養(yǎng)基質(zhì)，將基質(zhì)平鋪在不銹鋼方盤(pán)發(fā)酵容器內(nèi)，調(diào)節(jié)厚度為2.5cm~3.5 cm，蓋上玻璃蓋，100°C烘lh，冷卻24h后重復(fù)烘Ih ； (5)將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內(nèi)，均勻噴灑到冷卻的培養(yǎng)基質(zhì)表面，Ikg基質(zhì)用接種液15~20mL，蓋上玻璃蓋，67°C預(yù)烘Ih ； (6)將容器取出置于28°C環(huán)境下持續(xù)發(fā)酵3d，待白色菌絲遍布基質(zhì)表面并開(kāi)始轉(zhuǎn)黃時(shí)，即完成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，此時(shí)提高室溫為30~32°C并加強(qiáng)室內(nèi)空氣流通，以促進(jìn)閉囊殼產(chǎn)生； (7)發(fā)酵6d時(shí)取下玻璃蓋，拌勻發(fā)酵底物，控溫為38~42°C干燥； (8)待基質(zhì)充分干燥后，100目電動(dòng)篩重復(fù)篩分兩次，獲得純度較高的金花菌粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，其特征在于，所述步驟(1)從茯磚茶中篩選金花菌菌種，金花 菌菌種從湖南益陽(yáng)茶廠有限公司08年產(chǎn)金湘益牌茯磚茶中分離純化獲得，經(jīng)廣東微生物研究所鑒定為冠突散囊菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，其特征在于，所述步驟(2)制備改良PDA發(fā)酵液，每升培養(yǎng)基使用200g馬鈴薯、50g蔗糖，方法為將去皮切碎的馬鈴薯置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入蔗糖并攪拌溶解，定容至1000mL,分裝三角瓶滅菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，其特征在于，所述步驟(3)中金花菌孢子接種液，其具體制備方法為，待改良PDA發(fā)酵液滅菌冷卻后，無(wú)菌操作接入金花菌，28°C靜置培養(yǎng)6d至產(chǎn)生大量的金花菌菌體，將三角瓶置搖瓶機(jī)上180rpm振蕩20min使金花菌孢子與菌絲分離，之后用雙層紗布過(guò)濾去除菌絲，即獲得金花菌孢子接種液；所述的金花菌孢子接種液，通過(guò)涂布平板法測(cè)定孢子含量> IO8個(gè)/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，其特征在于，所述步驟(4)中所述的發(fā)酵容器為不銹鋼方盤(pán)(500cmX 350cmX 4.5cm),容器蓋為面積略大于方盤(pán)的玻璃，以便于在發(fā)酵過(guò)程中觀察，玻璃蓋上后應(yīng)無(wú)明顯空隙；使用時(shí)將培養(yǎng)基質(zhì)放在方盤(pán)內(nèi)攤平，厚度不超過(guò)3.5cm,每盤(pán)約可容納基質(zhì)500g ;該容器蓋上玻璃后為半封閉狀態(tài),可有效控制培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)的水分緩慢散發(fā)，培養(yǎng)基質(zhì)前期濕度較大利于菌絲生長(zhǎng)，后期濕度降低則可促使耐干燥的閉囊殼產(chǎn)生；玻璃蓋與方盤(pán)之間的縫隙有利于空氣交換，滿(mǎn)足了金花菌對(duì)氧氣的需求，同時(shí)外界霉菌孢子也不易透過(guò)縫隙對(duì)基質(zhì)造成污染，正確操作下每盤(pán)培養(yǎng)基質(zhì)雜菌污染面積< 2cm2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，其特征在于，所述步驟(5)中67°C預(yù)烘Ih是金花菌發(fā)酵前的關(guān)鍵步驟，通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，金花菌孢子在67°C條件下可存活2~3h，67°C預(yù)烘Ih即可有效殺死接種過(guò)程中所污染的雜菌，并且不對(duì)金花菌孢子的活性造成影響，使本工藝對(duì)環(huán)境要求較低，無(wú)需使用無(wú)菌操作間等設(shè)施。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，其特征在于，所述步驟(6)菌絲開(kāi)始轉(zhuǎn)黃并產(chǎn)生少量閉囊殼時(shí)，應(yīng)及時(shí)升溫以促進(jìn)閉囊殼產(chǎn)生。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，其特征在于，所述步驟(7)所述的發(fā)酵6d時(shí)基質(zhì)應(yīng)布滿(mǎn)金花菌閉囊殼且顆粒飽滿(mǎn)豐富，干燥過(guò)程中溫度不應(yīng)超過(guò)42°C，此過(guò)程可進(jìn)一步促使金花菌閉囊殼產(chǎn)生。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述茶葉下腳料培養(yǎng)金花菌粉的方法，其特征在于，所述步驟(8)產(chǎn)品金花菌粉為金黃色粉末狀，輕嗅有菌花香，在潮濕處易結(jié)塊且顏色加深，置于密封清潔容器干燥 處保存。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103865810SQ201410114977
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】趙運(yùn)林, 胡治遠(yuǎn), 劉石泉, 龍立平, 彭雨軒 申請(qǐng)人:湖南城市學(xué)院