一種茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝的制作方法
【專利摘要】一種茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其步驟如下：（1）從茯磚茶中篩選金花菌菌種；（2）制備改良PDA發(fā)酵液，無菌操作接種金花菌,培養(yǎng)；（3）制備金花菌孢子接種液；（4）制備金花菌生長營養(yǎng)液；（5）將干茶渣粉碎制成培養(yǎng)基質(zhì)；（6）將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內(nèi)；（7）完成營養(yǎng)生長，促進閉囊殼產(chǎn)生；（8）發(fā)酵，干燥；（9）基質(zhì)干燥，篩分兩次，獲得純度較高的金花。本發(fā)明發(fā)酵步驟一次性完成，成本較為低廉，同時減少了雜菌的污染，解決了發(fā)酵過程中培養(yǎng)基質(zhì)受雜菌如青霉、黑曲霉等污染較為嚴重的問題。
【專利說明】一種茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及菌種培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用茶渣循環(huán)制備金花工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]金花菌學名為冠突散囊菌crisiar應)，主要存在于黑茶中的獲磚茶內(nèi)，是我國制茶行業(yè)唯一二級機密保護菌種，其在茶葉上生長產(chǎn)生的閉囊殼堆積成肉眼可見的金黃色顆粒狀，俗稱金花，金花的多少歷來是評價茯磚茶品質(zhì)好壞的重要指標。近年來大量研究資料表明“金花”對高血壓、高血脂、糖尿病等疾病具備良好的保健效果，并有提高機體免疫力的作用。
[0003]隨著金花保健功效的發(fā)掘，對其產(chǎn)品的開發(fā)成為了時下研究的熱點，這就需要大量的金花作為提取材料。金花菌生長條件較為苛刻，往往只在發(fā)酵良好的茯磚茶內(nèi)部有少量存在，因此從茯磚茶中大量收集金花的方案是不現(xiàn)實的，而利用散茶或其他植物原料培養(yǎng)金花成本亦較高。本發(fā)明是為了實現(xiàn)金花產(chǎn)品的開發(fā)利用而研制的一種茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝。
[0004]中國專利(申請?zhí)?201210470477.7)提供了 “一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法”，該專利不足之處在于:
(1)使用250mL/500mL錐形瓶作為培養(yǎng)容器、麩皮平鋪厚度為1.0~1.3cm，一次培養(yǎng)獲得的曲種較少；
(2)首先需發(fā)酵培養(yǎng)獲得曲種，再以發(fā)酵完成的曲種擴大培養(yǎng)，所有操作均需在無菌條件下進行，發(fā)酵容器外需包裹8層紗布，且(T36h時還需加蓋透氣封口膜，其操作較為繁瑣，不適宜大批量生產(chǎn)；`
(3)所用培養(yǎng)基質(zhì)不可重復利用，原料的消耗量較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:解決現(xiàn)有金花生產(chǎn)工藝原材料消耗大，成本高的問題，而提供一種茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，實現(xiàn)了對發(fā)酵原料的重復利用，并且生產(chǎn)周期較短，能為金花研究與產(chǎn)品開發(fā)提供大量的原料。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其步驟如下:
Cl)從茯磚茶中篩選金花菌菌種；
(2)制備改良PDA發(fā)酵液，無菌操作接種金花菌，28°C培養(yǎng)6d；
(3)將發(fā)酵液瓶180rpm振蕩20min，使金花菌孢子與菌絲分離，之后用雙層無菌紗布過濾除去菌絲，得到金花菌孢子接種液；
(4)制備金花菌生長營養(yǎng)液；
(5)將干茶渣粉碎(或是之前制備金花工藝中回收的茶渣)，加入30%左右營養(yǎng)液充分混勻，即為培養(yǎng)基質(zhì)，將基質(zhì)平鋪在不銹鋼方盤發(fā)酵容器內(nèi)，調(diào)節(jié)厚度為2.5cm左右，蓋上玻璃蓋，100°C烘lh，冷卻24h后重復烘Ih ；
(6)將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內(nèi)，均勻噴灑到冷卻的培養(yǎng)基質(zhì)表面，Ikg基質(zhì)用接種液15~20mL，蓋上玻璃蓋，67°C預烘Ih ；
(7)將容器取出置于28°C環(huán)境下持續(xù)發(fā)酵3d，待白色菌絲遍布基質(zhì)表面并開始轉(zhuǎn)黃時，即完成營養(yǎng)生長，此時提高室溫為3(T32°C并加強室內(nèi)空氣流通，以促進閉囊殼產(chǎn)生；
(8)發(fā)酵6d時取下玻璃蓋，拌勻發(fā)酵底物，控溫為38~42°C干燥；
(9)待基質(zhì)充分干燥后，100目電動篩重復篩分兩次，獲得純度較高的金花，并收集茶渣以備下次重復利用。
[0007]所述的步驟(1)中金花菌菌種從湖南益陽茶廠有限公司08年產(chǎn)金湘益牌茯磚茶中分離純化獲得，經(jīng)廣東微生物研究所鑒定為冠突散囊菌；
所述的步驟(2)中改良PDA發(fā)酵液，其特征在于，每升培養(yǎng)基使用200g馬鈴薯、50g蔗糖，方法為將去皮切碎的馬鈴薯置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入蔗糖并攪拌溶解，定容至1000mL,分裝三角瓶滅菌；
所述的步驟(2)和步驟(3)金花 菌孢子接種液，其具體制備方法為，待改良PDA發(fā)酵液滅菌冷卻后，無菌操作接入金花菌，28°C靜置培養(yǎng)6d至產(chǎn)生大量的金花菌菌體，將三角瓶置搖瓶機上ISOrpm振蕩20min使孢子與菌絲分離，雙層紗布過濾去除菌絲，即獲得金花菌孢子接種液；
所述的步驟(3)金花菌孢子接種液，通過涂布平板法測定孢子含量> 108個/mL ；
所述的步驟(4)金花菌生長營養(yǎng)液能提供金花菌生長所需的氮源、碳源等生長素，其中含馬鈴薯30%、蔗糖20%、NaCl 5%，具體制備方法為:將去皮切碎的馬鈴薯300g置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入200g蔗糖、50gNaCl并攪拌溶解，定容至10OOmT,；
所述的步驟(5)發(fā)酵容器為不銹鋼方盤(500cmX350cmX4.5cm)，容器蓋為面積略大于方盤的玻璃，以便于在發(fā)酵過程中觀察，玻璃蓋上后應無明顯空隙。使用時將培養(yǎng)基質(zhì)放在方盤內(nèi)攤平，厚度不超過3.5cm,每盤約可容納基質(zhì)500g ;該容器蓋上玻璃后為半封閉狀態(tài)，可有效控制培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)的水分緩慢散發(fā)，培養(yǎng)基質(zhì)前期濕度較大利于菌絲生長，后期濕度降低則可促使耐干燥的閉囊殼產(chǎn)生。玻璃蓋與方盤之間的縫隙有利于空氣交換，滿足了金花菌對氧氣的需求，同時外界霉菌孢子也不易透過縫隙對基質(zhì)造成污染，正確操作下每盤培養(yǎng)基質(zhì)雜菌污染面積< 2cm2。
[0008]所述的步驟(6)中67°C預烘Ih是金花菌發(fā)酵前的關(guān)鍵步驟，通過實驗可知，金花菌孢子在67°C條件下可存活2~3h，67°C預烘Ih即可有效殺死接種過程中所污染的雜菌，并且不對金花菌孢子的活性造成影響，使本工藝對環(huán)境要求較低，無需使用無菌操作間等設(shè)施。
[0009]所述的步驟(7)中菌絲開始轉(zhuǎn)黃并產(chǎn)生少量閉囊殼時，應及時升溫以促進閉囊殼產(chǎn)生；
所述的步驟(8)中發(fā)酵6d時基質(zhì)應布滿金花菌閉囊殼且顆粒飽滿豐富，干燥過程中溫度不應超過42°C，此過程可進一步促使金花菌閉囊殼產(chǎn)生；
所述的步驟(9)中產(chǎn)品金花為金黃色粉末狀，輕嗅有菌花香，在潮濕處易結(jié)塊且顏色加深，置于密封清潔容器干燥處保存；所述的步驟(9)中回收的培養(yǎng)基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)已基本耗盡，但物理特性基本穩(wěn)定，較為適宜金花菌菌絲生長，通過加入營養(yǎng)液便可作為發(fā)酵底物重復利用。
[0010]本發(fā)明和現(xiàn)有的專利與文獻相比，具備以下顯著優(yōu)點:
(1)由孢子懸液直接接種至培養(yǎng)基質(zhì)，發(fā)酵步驟一次性完成；
(2)所用茶渣可以是通過浸提之后的茶葉洛，也可以是茶葉加工中的邊角料，成本較為低廉，通過粉碎進一步提高了金花菌的生長面積，且干燥后金花與茶渣較易分離；
(3)通過加入適宜金花菌生長的營養(yǎng)液，解決了一次發(fā)酵后茶渣中營養(yǎng)成分耗盡的問題，實現(xiàn)了對發(fā)酵基質(zhì)的循環(huán)利用；
(4)利用改良發(fā)酵容器，半封閉式發(fā)酵滿足了金花菌生長所需的氧氣與一定濕度，同時減少了雜菌的污染；
(5)通過發(fā)酵容器改良與接種后預烘工藝，殺死了雜菌而保留金花菌孢子活力，解決了發(fā)酵過程中培養(yǎng)基質(zhì)受雜菌如青霉、黑曲霉等污染較為嚴重的問題。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為金花囷接種液照片；
圖2為發(fā)酵過程中的茶渣照片；
圖3為茶渣培育金花6d照片；
圖4為二次過篩的金花照片；
圖5為本發(fā)明工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0012]步驟1.金花菌的分離純化:金花菌來源為湖南省益陽茶廠有限公司08年產(chǎn)金湘益牌茯磚茶。具體分離純化步驟為:用鑷子取茯磚茶磚心處長有金花的茶葉10g，加入到裝有90mL無菌水的三角瓶內(nèi)，蓋上無菌封口膜，置搖床上180rpm振搖20min，制成10_2倍樣品稀釋液，梯度稀釋至10-6，取ImL稀釋液涂布于CZG平板上，28°C培養(yǎng)5~6d，用接種針挑取長勢較好的金花菌菌落進行劃線分離，重復劃線2~3次后獲得純培養(yǎng)金花菌菌株。
[0013]步驟2.金花菌孢子接種液的制作:馬鈴薯200g洗凈去皮，加1000mL水煮沸15min后過濾，濾液加入50g蔗糖，攪拌至溶解后，分裝三角瓶滅菌。在超凈工作臺下用接種環(huán)挑取斜面保存的金花菌菌體，接種至發(fā)酵液中，28°C培養(yǎng)6d。
[0014]步驟3.將上述發(fā)酵液瓶SOrpm振搖20min，雙層無菌紗布過濾即為金花菌孢子接種液。
[0015]金花菌孢子接種液見附圖1。
[0016]步驟4.制備金花菌生長營養(yǎng)液:將馬鈴薯去皮洗凈，取300g切碎放入燒杯中，加1000mL水，煮沸后維持20min左右，用雙層紗布過濾去除馬鈴薯渣，濾液加入200g蔗糖、50gNaCl，攪拌至溶解，即為金花菌生長營養(yǎng)液`。
[0017]步驟5.培養(yǎng)基質(zhì)制備:將干茶渣置于植物粉碎機內(nèi)粉碎并挑去雜質(zhì)，選取Ikg茶葉渣放在盤內(nèi)，加入300mL營養(yǎng)液并攪拌均勻，制成金花培養(yǎng)基質(zhì)。
[0018]濕熱滅菌:將培養(yǎng)基質(zhì)平鋪在不銹鋼方盤內(nèi)，調(diào)節(jié)厚度為2.5cm左右，最厚處不超過3.5cm。蓋上一塊略大于方盤的玻璃蓋并確認無明顯縫隙，置烘箱內(nèi)100°C烘lh，冷卻24h后重復烘lh，取出冷卻；
步驟6:接種與預烘:將金花菌接種液裝入已消毒的噴壺內(nèi)，揭起玻璃蓋，將懸液均勻噴灑到培養(yǎng)基質(zhì)上，保證基質(zhì)表面被接種液完全覆蓋即可。蓋上玻璃蓋，將方盤置烘箱67°C烘Ih。
[0019]金花菌發(fā)酵中的茶渣見附圖2。
[0020]步驟7:金花菌發(fā)酵:將方盤取出置于28°C環(huán)境下發(fā)酵3d，待白色的營養(yǎng)菌絲長滿基質(zhì)表明并開始轉(zhuǎn)黃時，將室溫升高至3(T32°C，并每日打開門窗透氣半小時，以促進金花
大量產(chǎn)生。
[0021]發(fā)酵6d的基質(zhì)見附圖3。
[0022]步驟8:干燥與金花收集:發(fā)酵6d左右，此時金花布滿了培養(yǎng)基質(zhì)，將玻璃蓋揭去，拌勻基質(zhì)，提高室溫為38°C~42°C，48h左右即可充分干燥。
步驟9:將上述干燥的基質(zhì)置于100目電動振搖篩中振搖3min，便可將大部分金花篩下，再次過100目篩即獲得純度較高的金花，用自封袋將金花包裝好放置在陰涼干燥處儲存，茶渣收集以重復利用。
[0023]二次過篩的金花見 附圖4。
【權(quán)利要求】
1.一種茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其特征在于，其步驟如下: (1)從茯磚茶中篩選金花菌菌種； (2)制備改良PDA發(fā)酵液，無菌操作接種金花菌，28°C培養(yǎng)6d； (3)將發(fā)酵液瓶180rpm振蕩20min，使金花菌孢子與菌絲分離，之后用雙層無菌紗布過濾除去菌絲，得到金花菌孢子接種液； (4)制備金花菌生長營養(yǎng)液； (5)將干茶渣粉碎(或是之前制備金花工藝中回收的茶渣)，加入30%左右營養(yǎng)液充分混勻，即為培養(yǎng)基質(zhì)，將基質(zhì)平鋪在不銹鋼方盤發(fā)酵容器內(nèi)，調(diào)節(jié)厚度為2.5cm左右，蓋上玻璃蓋，100°C烘lh，冷卻24h后重復烘Ih ； (6)將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內(nèi)，均勻噴灑到冷卻的培養(yǎng)基質(zhì)表面，Ikg基質(zhì)用接種液15~20mL，蓋上玻璃蓋，67°C預烘Ih ； (7)將容器取出置于28°C環(huán)境下持續(xù)發(fā)酵3d，待白色菌絲遍布基質(zhì)表面并開始轉(zhuǎn)黃時，即完成營養(yǎng)生長，此時提高室溫為30~32°C并加強室內(nèi)空氣流通，以促進閉囊殼產(chǎn)生； (8)發(fā)酵6d時取下玻璃蓋，拌勻發(fā)酵底物，控溫為38~42°C干燥； (9)待基質(zhì)充分干燥后，100目電動篩重復篩分兩次，獲得純度較高的金花，并收集茶渣以備下次重復利用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其特征在于，所述的步驟(I)中金花菌菌種從湖南益陽茶廠有限公司08年產(chǎn)金湘益牌茯磚茶中分離純化獲得，經(jīng)廣東微生物研究所鑒定為冠突散囊菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其特征在于，所述的步驟(2)中改良PDA發(fā)酵液，其特征在于，每升培養(yǎng)基使用200g馬鈴薯、50g蔗糖，方法為將去皮切碎的馬鈴薯置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入蔗糖并攪拌溶解，定容至1000mL,分裝三角瓶滅菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其特征在于，所述的步驟(2)和步驟(3)金花菌孢子接種液，其具體制備方法為，待改良PDA發(fā)酵液滅菌冷卻后，無菌操作接入金花菌，28°C靜置培養(yǎng)6d至產(chǎn)生大量的金花菌菌體，將三角瓶置搖瓶機上180rpm振蕩20min使孢子與菌絲分離,雙層紗布過濾去除菌絲，即獲得金花菌孢子接種液；所述的步驟(3)金花菌孢子接種液，通過涂布平板法測定孢子含量> IO8個/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其特征在于，所述的步驟(4)金花菌生長營養(yǎng)液能提供金花菌生長所需的氮源、碳源等生長素，其中含馬鈴薯30%、蔗糖20%、NaCl 5%，具體制備方法為:將去皮切碎的馬鈴薯300g置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入200g蔗糖、50gNaCl并攪拌溶解，定容至1000mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其特征在于，所述的步驟(5)發(fā)酵容器為不銹鋼方盤(500cmX350cmX4.5cm)，容器蓋為面積略大于方盤的玻璃，以便于在發(fā)酵過程中觀察，玻璃蓋上后應無明顯空隙；使用時將培養(yǎng)基質(zhì)放在方盤內(nèi)攤平，厚度不超過3.5cm,每盤約可容納基質(zhì)500g ;該容器蓋上玻璃后為半封閉狀態(tài),可有效控制培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)的水分緩慢散發(fā)，培養(yǎng)基質(zhì)前期濕度較大利于菌絲生長，后期濕度降低則可促使耐干燥的閉囊殼產(chǎn)生；玻璃蓋與方盤之間的縫隙有利于空氣交換，滿足了金花菌對氧氣的需求，同時外界霉菌孢子也不易透過縫隙對基質(zhì)造成污染，正確操作下每盤培養(yǎng)基質(zhì)雜菌污染面積< 2cm2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其特征在于，所述的步驟(6)中67°C預烘Ih是金花菌發(fā)酵前的關(guān)鍵步驟，通過實驗可知，金花菌孢子在67°C條件下可存活2~3h，67°C預烘Ih即可有效殺死接種過程中所污染的雜菌，并且不對金花菌孢子的活性造成影響，使本工藝對環(huán)境要求較低，無需使用無菌操作間等設(shè)施。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其特征在于，所述的步驟(7)中菌絲開始轉(zhuǎn)黃并產(chǎn)生少量閉囊殼時，應及時升溫以促進閉囊殼產(chǎn)生。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其特征在于，所述的步驟(8)中發(fā)酵6d時基質(zhì)應布滿金花菌閉囊殼且顆粒飽滿豐富，干燥過程中溫度不應超過42V,此過程可進一步促使金花菌閉囊殼產(chǎn)生。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶渣添加營養(yǎng)液循環(huán)制備金花工藝，其特征在于，所述的步驟(9)中產(chǎn)品金花為金黃色粉末狀， 輕嗅有菌花香，在潮濕處易結(jié)塊且顏色加深，置于密封清潔容器干燥處保存；所述的步驟9中回收的培養(yǎng)基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)已基本耗盡，但物理特性基本穩(wěn)定，較為適宜金花菌菌絲生長，通過加入營養(yǎng)液便可作為發(fā)酵底物重復利用。
【文檔編號】C12R1/645GK103865811SQ201410114978
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】趙運林, 胡治遠, 劉石泉, 龍立平, 彭雨軒 申請人:湖南城市學院