磁驅(qū)固定化酶、制備方法及其在大水體催化中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】磁驅(qū)固定化酶、制備方法及其在大水體催化中的應(yīng)用，屬于酶固定化載體合成及酶固定化【技術(shù)領(lǐng)域】。該磁驅(qū)固定化酶是以納米尺度的順磁性鐵粒子為磁驅(qū)動(dòng)核心，以氨基、羧基或巰基基團(tuán)化試劑修飾的硅基材料為外殼；目標(biāo)酶或基因工程改造酶通過基團(tuán)化試劑引入的官能化基團(tuán)固定化在硅基材料的外殼上，進(jìn)而形成的單一酶單層磁驅(qū)固定化酶、單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶、多種酶單層定比例磁驅(qū)固定化酶或多種酶單層定取向定比例磁驅(qū)固定化酶。本發(fā)明利用硅基化外殼包埋鐵粒子，一方面延長(zhǎng)酶使用時(shí)間；一方面利用硅基材料的大比表面積和表面可進(jìn)行官能團(tuán)修飾的性質(zhì)賦予酶制劑以磁釋放、驅(qū)動(dòng)和回收能力，可以在大水體催化反應(yīng)中得到應(yīng)用。
【專利說明】磁驅(qū)固定化酶、制備方法及其在大水體催化中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶固定化載體合成及酶固定化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有高穩(wěn)定性、磁釋放、磁回收、磁驅(qū)動(dòng)、高可重復(fù)利用率的磁驅(qū)固定化酶、制備方法以及其在大水體催化反應(yīng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物催化劑，例如酶，具有催化的高效性、反應(yīng)的專一性、反應(yīng)條件的溫和性等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的被用于工業(yè)生產(chǎn)。但是由于天然的酶往往存在著穩(wěn)定性差、不能重復(fù)利用以及難于從反應(yīng)體系中分離等缺點(diǎn)極大的限制了酶制劑的應(yīng)用。為解決上述問題，拓寬生物催化材料的應(yīng)用范圍，酶固定化技術(shù)得以產(chǎn)生和發(fā)展。通過酶固定化技術(shù)，賦予了酶高穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，使得酶固定化技術(shù)在催化領(lǐng)域和環(huán)境友好綠色化學(xué)研究中有較好的發(fā)展前景。
[0003]傳統(tǒng)的酶固定化技術(shù)，諸如共價(jià)聯(lián)接、物理吸附、微囊包封以及半透膜或者凝膠包埋，存在著改變酶的構(gòu)象或者結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(共價(jià)聯(lián)接)、酶由于固定化材料的穩(wěn)定性不佳而在使用的過程中出現(xiàn)從固定化材料中逃逸(物理吸附、微囊包封和凝膠包埋)、反應(yīng)底物或者產(chǎn)物的理化性質(zhì)限制酶固定化后的反應(yīng)能力(微囊包封、凝膠包埋、半透膜)等缺點(diǎn)，同時(shí)上述酶固定化方法及技術(shù)除了難于解決大水體反應(yīng)體系(如:污水處理)中酶制劑與反應(yīng)體系的均勻混合、釋放及回收難題外，在酶的固定化時(shí)還易于出現(xiàn)因酶固載量過高造成的酶分子之間的堆積，酶分子間的堆積將影響酶的結(jié)構(gòu)和功能，降低單位有效酶活性，使得酶制劑的活性低于理論值。本發(fā)明的磁驅(qū)酶固定化載體制備技術(shù)可以同步解決上述問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一 種具有高穩(wěn)定性、磁釋放、磁回收、磁驅(qū)動(dòng)、高可重復(fù)利用率的磁驅(qū)固定化酶、制備方法以及磁驅(qū)固定化酶在大水體催化反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明是通過構(gòu)建一種磁驅(qū)酶固定化載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的單層固定化，該磁驅(qū)固定化酶適用于大水體催化反應(yīng)，屬于無(wú)機(jī)化學(xué)、物理化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。該酶固定化載體是以納米尺度鐵粒子為磁驅(qū)核心，利用硅基材料對(duì)鐵核心進(jìn)行包埋，以具有能夠載入材料表面官能團(tuán)的三甲氧基烷為基團(tuán)化試劑，構(gòu)建磁驅(qū)酶固定化載體；利用酶與硅基載體表面修飾基團(tuán)間特定相互作用和雙功能交聯(lián)劑構(gòu)建單層磁驅(qū)固定化酶。利用該方法可以合成多種多功能磁驅(qū)固定化酶制劑，其特征在于，具有磁驅(qū)核心，硅基中間殼層，可選擇官能團(tuán)化載體表面，利用雙功能交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)多種酶的固定化。該磁驅(qū)固定化酶具有高穩(wěn)定性、高可重復(fù)利用率等優(yōu)點(diǎn)，在脈沖磁場(chǎng)作用下可以實(shí)現(xiàn)酶制劑的釋放、驅(qū)動(dòng)和回收。本發(fā)明可用于制備針對(duì)大水體催化反應(yīng)的酶制劑制備和應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明所述的磁驅(qū)固定化酶，是以納米尺度的順磁性鐵粒子為磁驅(qū)動(dòng)核心，以氨基、羧基或巰基基團(tuán)化試劑修飾的硅基材料為外殼；目標(biāo)酶或基因工程改造酶通過基團(tuán)化試劑引入的官能化基團(tuán)固定化在硅基材料的外殼上，進(jìn)而形成的單一酶單層磁驅(qū)固定化酶、單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶、多種酶單層定比例磁驅(qū)固定化酶或多種酶單層定取向定比例磁驅(qū)固定化酶。
[0007]本發(fā)明采用納米尺度(直徑20納米以內(nèi))的順磁性鐵粒子作為磁驅(qū)動(dòng)核心，利用在水溶液中具有高穩(wěn)定性的硅基材料在鐵粒子表面形成硅基外殼(厚度20~100納米)，以基團(tuán)化試劑對(duì)硅基外殼進(jìn)行修飾，從而在硅基外殼表面引入官能化基團(tuán)(如:氨基、羧基、巰基等)，利用目標(biāo)酶分子與官能化基團(tuán)間相互作用進(jìn)行目標(biāo)酶蛋白的固定，從而得到單一酶單層磁驅(qū)固定化酶、單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶、多種酶單層定比例磁驅(qū)固定化酶和多種酶單層定取向定比例磁驅(qū)固定化酶。該磁驅(qū)固定化酶能夠在脈沖磁場(chǎng)作用下進(jìn)行釋放、驅(qū)動(dòng)和回收，適用于大水體催化反應(yīng)。
[0008]與【背景技術(shù)】相比:
[0009]1)利用納米尺度順磁性鐵粒子作為磁驅(qū)動(dòng)核心，解決酶制劑處理大水體樣本(如:污水)時(shí)的酶制劑的釋放、驅(qū)動(dòng)和回收；
[0010]2)利用硅基化外殼包埋鐵粒子，一方面利用硅基材料的水溶劑中的穩(wěn)定性對(duì)鐵核心進(jìn)行保護(hù)，延長(zhǎng)其使用時(shí)間；一方面利用硅基材料的大比表面積和表面可進(jìn)行官能團(tuán)修飾的性質(zhì)，使得該材料可以進(jìn)行酶的固定化，同時(shí)賦予固定化后制備的酶制劑以磁釋放、驅(qū)動(dòng)和回收能力；
[0011]3)利用硅基表面的官能團(tuán)與酶分子的相互作用實(shí)現(xiàn)酶的定量、定比例、定取向、單層固定化，解決【背景技術(shù)】中的酶分子過度固定化和堆積造成的單位有效酶活性下降的問題，實(shí)現(xiàn)酶固定化后的最大活性保持；
[0012]4)由于酶進(jìn)行了定取向、定量的磁驅(qū)載體表面固定化，與【背景技術(shù)】相比，磁驅(qū)固定化酶制劑的催化不受產(chǎn)物及底物理化性質(zhì)局限，與游離酶在溶劑中反應(yīng)時(shí)的底物接觸和產(chǎn)物釋放能力相似；
[0013]5)由于對(duì)酶進(jìn)行了單層固定化，磁驅(qū)固定化載體與酶分子之間的距離進(jìn)行了有效調(diào)控，降低了環(huán)境pH、溫度、離子強(qiáng)度、蛋白水解酶等物理、化學(xué)以及生物因素對(duì)固定化酶制劑的穩(wěn)定性和生物利用度的影響；
[0014]6)該固定化酶需要在脈沖磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行釋放、驅(qū)動(dòng)和回收，磁場(chǎng)脈沖頻率與脈沖寬度與水體體積和面積有關(guān)，磁場(chǎng)強(qiáng)度與酶在磁場(chǎng)下的活性變化能力及水體溶劑條件有關(guān)。
[0015]本發(fā)明涉及一種磁驅(qū)固定化酶及其制備方法，酶固定化進(jìn)程中存在三個(gè)層次，SP(a)酶催化小分子底物反應(yīng)，其特征在于，固定在載體表面的酶分子取向不影響酶的生物功能，即，單一酶單層磁驅(qū)固定化酶；(b)酶催化大分子底物或者產(chǎn)物反應(yīng)，其特征在于，酶固定時(shí)在固定化載體表面的取向影響酶的生物活性，即，單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶；(C)在執(zhí)行目的反應(yīng)時(shí)，需要一種以上的酶共同存在于同一個(gè)固定化酶載體上，根據(jù)這些酶的反應(yīng)效率，需要控制固定化酶載體上多種酶分子之間的比例需要進(jìn)行定比例固定化，即，多種酶單層定比例磁驅(qū)固定化酶，根據(jù)這些酶在酶固定化載體表面固定時(shí)的取向和活動(dòng)的關(guān)系即，多種酶單層定取向定比例磁驅(qū)固定化酶。
[0016]對(duì)于單一酶單層磁驅(qū)固定化酶由步驟I)~步驟4)所述方法制備；對(duì)于單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶，包括利用步驟I)~步驟2)制備鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)酶固定化載體，利用步驟5)進(jìn)行目標(biāo)酶的分子改造，利用步驟6)實(shí)現(xiàn)單一酶單層定取向磁驅(qū)酶固定化載體及單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶制備制備；對(duì)于多種酶單層定比例固定化磁驅(qū)固定化酶和多種酶單層定取向定比例磁驅(qū)固定化酶，包括利用步驟I)~步驟2)制備鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)酶固定化載體，利用步驟6a)實(shí)現(xiàn)單一酶單層定比例磁驅(qū)固定化載體制備，按照步驟7)實(shí)現(xiàn)多種酶單層定比例固定化磁驅(qū)固定化酶制備和多種酶單層定取向定比例磁驅(qū)固定化酶制備。
[0017]本發(fā)明的具體操作步驟如下:
[0018]I)制備作為磁驅(qū)動(dòng)核心的納米尺度鐵粒子:將摩爾比為1:1的二價(jià)鐵鹽與三價(jià)鐵鹽在pH=4.0~6.0的去離子水中混合，其中二價(jià)鐵鹽可以是硫酸亞鐵、硝酸亞鐵以及氯化亞鐵等，三價(jià)鐵鹽為硫酸鐵、硝酸鐵、氯化鐵等，然后將上述鐵鹽的酸性反應(yīng)體系在50~70°C水浴條件下溫和振蕩(利用懸垂臂攪拌器進(jìn)行攪拌混合，轉(zhuǎn)速為150~300轉(zhuǎn)每分鐘)20~50分鐘，再加入質(zhì)量體積百分比為25%的濃氨水使得反應(yīng)體系的pH=10~11，繼續(xù)在50~70°C水浴條件下溫和振動(dòng)20~40分鐘；再加入15~30毫升油酸，繼續(xù)在50~70°C水浴條件下溫和振動(dòng)20~40分鐘，反應(yīng)體系中形成的納米尺度的鐵粒子進(jìn)入油酸層；最后磁選法收集鐵粒子(磁場(chǎng)方向垂直于地磁場(chǎng)方向)，丙酮洗滌后晾干，鐵粒子的直徑在20nm以內(nèi)(圖O ;
[0019]2)以在水溶劑中高穩(wěn)定性的硅基材料作為包覆磁驅(qū)核心的外殼，制備鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體:將上述步驟合成的鐵粒子加到乙醇中，濃度為0.15~
0.3毫克/毫升，室溫下超聲0.5~2小時(shí)，使得鐵粒子充分分散在乙醇溶液內(nèi)，移除不能懸浮在乙醇中的固體物質(zhì)，然后在得到的鐵粒子乙醇懸濁液中緩慢加入硅基化試劑，鐵粒子與加入的硅基化試劑的質(zhì)量比為1:10~15，硅基化試劑可以是正硅酸乙酯、正硅酸甲酯、水玻璃等，溫和攪拌 過夜；用磁選法收集鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體，乙醇洗滌后晾干，鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體的直徑在20~100納米(圖2)；
[0020]3)通過基團(tuán)化試劑在硅基外殼上引入適當(dāng)含量和組成的修飾基團(tuán)(如:氨基、羧基、巰基等)，制備基團(tuán)修飾的磁驅(qū)酶固定化載體:將步驟2)制備得到的鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體在室溫下超聲分散到乙醇溶液中形成濃度為0.2~0.4毫克每毫升的乙醇懸濁液，將基團(tuán)化試劑加入到上述懸濁液中，室溫下溫和攪拌8~14小時(shí)，確保基團(tuán)化完全進(jìn)行，用磁選法收集基團(tuán)修飾的磁驅(qū)酶固定化載體，用乙醇洗滌后晾干。
[0021]該操作的特征在于:Ca)鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體與基團(tuán)化試劑的質(zhì)量比為450~500:1 ；(b)基團(tuán)化試劑為3-氨基丙基-三甲氧基硅烷、3-羧基丙基_ 二甲氧基硅烷、3-疏基丙基_ 二甲氧基硅烷等可以對(duì)娃基材料表面進(jìn)行官能團(tuán)化的二烷氧基硅烷；(C)修飾基團(tuán)為氨基化、羧基化、巰基化等能夠在硅基材料表面引入的化學(xué)基團(tuán)。
[0022]4)單一酶單層磁驅(qū)動(dòng)固定化酶制備，酶通過與磁驅(qū)載體上的修飾基團(tuán)相互作用，利用雙功能交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)酶單層固定化:將基團(tuán)修飾的磁驅(qū)酶固定化載體用磷酸緩沖液(50毫摩爾每升，pH7.4)進(jìn)行3~5次的洗漆和磁選收集,最后將基團(tuán)修飾的磁驅(qū)酶固定化載體分散于含質(zhì)量百分比為2~10%雙功能交聯(lián)劑的磷酸緩沖液中進(jìn)行活化，使得基團(tuán)修飾的磁驅(qū)酶固定化載體的終濃度為1.6~6.7毫克每毫升；活化是在室溫溫和攪拌的條件下進(jìn)行0.5~2小時(shí)。活化后的載體用磷酸緩沖液再進(jìn)行3~5次的洗滌和磁選收集，去除未反應(yīng)的游離的雙功能交聯(lián)劑；將收集后的載體與目標(biāo)酶分子進(jìn)行混合，室溫下溫和振蕩8~14小時(shí)以確保酶的充分固定化；最后用磷酸緩沖液進(jìn)行3~5次的磁選收集，從而得到單一酶單層磁驅(qū)固定化酶。
[0023]該操作的特征在于:(a)基團(tuán)修飾的磁驅(qū)酶固定化載體與目標(biāo)酶的質(zhì)量比為1:3~9，酶分子溶解在50毫摩爾每升、pH=7.4的磷酸緩沖液中。(b)所說的雙功能交聯(lián)劑為戊二醛、丁二酸酐、己二酰亞胺酸二甲酯或雙重氮聯(lián)苯胺_2，2- 二磺酸等能夠聯(lián)接生物材料與磁驅(qū)酶固定化載體表面官能團(tuán)的試劑。
[0024]適合上述操作的酶分子包括:辣根過氧化物酶、超氧化物歧化酶、單胺氧化酶、葡萄糖氧化酶、β_半乳糖苷酶、轉(zhuǎn)氨酶、脫羧基酶、巰基轉(zhuǎn)移酶等，屬于氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和合成酶酶類中的以小分子為產(chǎn)物和底物的酶分子。這些酶在固定化時(shí)，酶在酶固定載體表面的分子取向不影響酶的活性。
[0025]5)當(dāng)目標(biāo)酶在載體表面的分子取向影響酶的活性時(shí)，需要先對(duì)酶分子本身進(jìn)行基因工程改造，構(gòu)建基因工程改造酶。
[0026]這里的酶分子包括，過氧化物酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、連接酶、膠原酶、溶菌酶、脂肪水解酶等，屬于氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和合成酶酶類中的以大分子為產(chǎn)物和底物的酶分子。這些酶在酶固定化載體表面得取向影響酶的活性。
[0027]原理及基因工程改造設(shè)計(jì)要求:利用分子生物技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，在目標(biāo)酶分子活性口袋和底物結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)端(如:Ν末端、C末端或者Loop區(qū))插入成簇的巰基(cys)、氨基(Lys或Arg)、羧基(Glu或者Asp)側(cè)鏈氨基酸中的兩種或三種,構(gòu)建富含特定的可與雙功能交聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)的團(tuán)簇區(qū)；各種組合中巰基是必須包括的基團(tuán)，其主要起到酶的定向固定化作用，氨基或者羧基主要起到進(jìn)一步加強(qiáng)酶的固定化作用；該團(tuán)簇區(qū)實(shí)現(xiàn)了酶分子在基團(tuán)修飾的磁驅(qū)酶固定化載體表面的定取向固定化，該操作提高固定化酶的單位有效酶活性。
[0028]操作方法:基 因工程改造酶的基因(DNA)序列可以通過化學(xué)合成完成，基因工程改造蛋白的表達(dá)、純化與一般的基因工程蛋白表達(dá)純化途徑相同，可以依據(jù)一般的基因工程蛋白改造文獻(xiàn)進(jìn)行。該蛋白的表征采用紫外-可見吸收光譜和血紅蛋白相同的活性檢測(cè)方法。
[0029]6)基因工程改造酶與基團(tuán)修飾磁驅(qū)酶固定化載體間的酶單層固定化，利用基因工程改造蛋白上引入的團(tuán)簇區(qū)與基團(tuán)修飾磁驅(qū)酶固定化載體表面特定基團(tuán)間的特異相互作用實(shí)現(xiàn)酶的固定化。
[0030]具體實(shí)施方法如下:
[0031]a)單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶載體的制備:考慮到經(jīng)過步驟5)改造的基因工程改造酶，在其蛋白表面結(jié)構(gòu)中添加了特定的富含巰基、氨基或者羧基的團(tuán)簇區(qū)(巰基是必須包括的基團(tuán))，所以在基團(tuán)修飾的磁驅(qū)酶固定化載體表面需要同時(shí)引入巰基、氨基或羧基修飾基團(tuán)，與步驟3的區(qū)別在于，為了實(shí)現(xiàn)單一酶定取向磁驅(qū)固定化，這里需要在磁驅(qū)酶固定化載體表面引入一種以上的修飾基團(tuán)。即，首先按照步驟3)中磁驅(qū)酶固定化載體的制備步驟，將步驟2)制備得到的鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體在室溫下超聲分散到乙醇溶液中，形成濃度為0.2~0.4毫克每毫升的乙醇懸濁液，將包含巰基基團(tuán)化試劑在內(nèi)的兩種或兩種以上的基團(tuán)化試劑，加入到上述懸濁液中，兩種或兩種以基團(tuán)化試劑的用量(摩爾比為1:0.1~10:0.1~10)與酶自身結(jié)構(gòu)性質(zhì)和固定化載體表面性質(zhì)有關(guān)(以酶固定化產(chǎn)品的比活作為判斷指標(biāo))，室溫下溫和攪拌8~14小時(shí)，確?；鶊F(tuán)化完全進(jìn)行，最后用磷酸緩沖液進(jìn)行3~5次的磁選收集基團(tuán)修飾的磁驅(qū)酶固定化載體，用乙醇洗滌后晾干，制得用于單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶載體。
[0032]b)單一酶單層定取向磁驅(qū)酶固定化:將前面制備的單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶載體與基因工程改造酶按質(zhì)量比為1:3~9在50毫摩爾每升、pH=7.4的磷酸緩沖液中混合0.5~2小時(shí)，最后用磷酸緩沖液進(jìn)行3~5次的磁選收集，從而得到基于二硫鍵的單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶。
[0033]c)單層定取向磁驅(qū)酶固定化的二次固定化:由于二硫鍵對(duì)化學(xué)環(huán)境敏感，使得基于二硫鍵的單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶使用范圍不夠?qū)挘市枰M(jìn)行利用雙功能交聯(lián)劑對(duì)上述單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶進(jìn)行二次固定化。
[0034]將前述操作中制備的基于二硫鍵的單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶懸浮在磷酸緩沖液中，得到1.6~7毫克每毫升的懸濁液，然后加入酶的底物(這里選用酶底物中分子較小、來(lái)源較廣、價(jià)格較低的分子，例如:葡萄糖、ABTS, L-dopa等)，使底物(實(shí)施例2和3中底物是ABTS，這里加底物主要是為了避免雙功能交聯(lián)劑加入時(shí)影響酶的活性中心的結(jié)構(gòu)，用底物保護(hù)酶的活性中心，二次固定化時(shí)雙功能交聯(lián)劑是在酶進(jìn)行一次固定化后再添加的，這時(shí)如果不用酶的底物對(duì)酶的活性中心進(jìn)行封閉保護(hù)，雙功能交聯(lián)劑會(huì)影響酶的活性中心的結(jié)構(gòu)和功能)與酶的摩爾比為50~100:1 ;再加入多羥基物質(zhì)使其質(zhì)量百分濃度為0.5~10%，加入雙功能交聯(lián)劑使其質(zhì)量百分濃度為2~5%，室溫下溫和振蕩0.5~4小時(shí)，使得二硫鍵固定的基因工程改造酶通過分子表面團(tuán)簇內(nèi)負(fù)責(zé)進(jìn)一步加強(qiáng)酶的固定化的修飾基團(tuán)(氨基或羧基)與單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶載體表面負(fù)責(zé)進(jìn)一步加強(qiáng)酶固定化的修飾基團(tuán)(氨基或羧基)形成共價(jià)交聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)酶的二次固定化，最后用磷酸緩沖液進(jìn)行3~5次的磁選收集，從而得到二次固定化酶。
[0035]該操作中多羥基物質(zhì)是葡萄糖、海藻糖、蔗糖、PEG等。該操作中，底物與多羥基物質(zhì)的添加可以最大限度的抑制`雙功能交聯(lián)劑使用時(shí)對(duì)酶活性相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能的不利影響，提高酶的有效利用度。
[0036]7)需要固定一種以上的酶，實(shí)際生產(chǎn)和研究中往往需要制備固定多種酶的酶固定化制劑或多酶反應(yīng)器?；诒緦＠猩婕暗拇膨?qū)酶固定化載體，可以采用兩種方法實(shí)現(xiàn)多酶固定化:
[0037]a)第一種是將兩種或兩種以上的目標(biāo)酶混合后與用雙功能交聯(lián)劑活化好的基團(tuán)修飾磁驅(qū)酶固定化載體直接混合進(jìn)行固定化，即得到多種酶單層定比例磁驅(qū)固定化酶；
[0038]b)第二種是先按照步驟5)進(jìn)行第一種目標(biāo)的酶基因工程改造，然后按照步驟6)先進(jìn)行第一種酶(基因工程改造酶)的基于二硫鍵的單層固定化和二次固定化，最后將該固定化酶懸浮在第二種目標(biāo)酶的溶液中，其中固定化酶的濃度為1.6~7毫克每毫升，第二種酶的濃度為0.2~10毫克每毫升，利用固定化酶的單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶載體表面殘余的雙功能交聯(lián)劑活化的基團(tuán)進(jìn)行第二種目標(biāo)酶的固定化，即多酶單層定取向定比例磁驅(qū)固定化。
[0039]主要操作如下:將步驟6b)制備的基于二硫鍵的第一種酶(基因工程改造酶)的單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶懸浮在含有質(zhì)量百分比為0.5~10%的多羥基物質(zhì)(如:葡萄糖、海藻糖、蔗糖、PEG等多羥基物質(zhì))的磷酸緩沖液中，磁驅(qū)固定化酶的濃度為1.6~7毫克每毫升，酶的底物(這里選用酶底物中分子較小、來(lái)源較廣、價(jià)格較低的分子，例如:葡萄糖、ABTS、L-dopa等)與酶的摩爾比為50~100:1，加入雙功能交聯(lián)劑使其質(zhì)量百分濃度為2~5%，室溫下溫和振蕩0.5~4小時(shí)，再用多羥基物質(zhì)質(zhì)量百分比濃度為0.5~10%的磷酸緩沖液進(jìn)行3~5次洗滌磁選收集，將收集得到的固定化酶懸浮在第二種酶的磷酸緩沖液中，其中固定化酶的濃度為1.6~7毫克每毫升，第二種酶的濃度為0.2~10毫克每毫升，兩種酶分子的摩爾比為1:0.1~10，室溫下溫和振蕩10小時(shí)，確保第二種酶的充分固定化，最后用磷酸緩沖液進(jìn)行3~5次的磁選收集多種酶單層定取向定比例磁驅(qū)固定化酶。
[0040]這里的第一種酶、第二種酶可以是單一種類的酶也可以是多種酶的混合酶。酶按其催化反應(yīng)性質(zhì)可以是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和合成酶，具體的酶與目標(biāo)反應(yīng)需求有關(guān)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1:本發(fā)明制備的磁驅(qū)動(dòng)核心鐵粒子的電鏡圖；
[0042]圖2:本發(fā)明制備鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)磁驅(qū)酶固定化載體的電鏡圖；
[0043]圖3:溫度對(duì)游離酶及固定化酶活性的影響曲線；以游離酶室溫下的比活為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行各個(gè)固定化酶和游離酶在不同溫度下比活力的歸一化；
[0044]圖4:脈沖磁場(chǎng)對(duì)磁驅(qū)固定化血紅蛋白催化氧化ABTS能力的比活力曲線(a)和對(duì)固定化血紅蛋白催化氧化ABTS能力的比活力曲線(b);分別以O(shè)磁場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)的酶或固定化酶比活標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化。
【具體實(shí)施方式】
[0045]實(shí)施例1:
[0046]磁驅(qū)固定化血紅蛋白制備及其在大水體ABTS催化氧化中的應(yīng)用
[0047]以氨基修飾的磁驅(qū)固定化酶載體為基質(zhì)，將來(lái)源于屠宰業(yè)廢棄物-血液中的血
紅蛋白進(jìn)行單層固定化，利用該固定化酶在脈沖磁場(chǎng)作用下進(jìn)行大水體反應(yīng)體系中ABTS的過氧化反應(yīng)，同時(shí)檢測(cè)溫度、離子強(qiáng)度、pH、溶液體系中游離的蛋白水解酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶)對(duì)該酶制劑的催化活性的影響。
[0048]選用血紅蛋白的意義在于，I)它是源自屠宰業(yè)的廢棄物；2)它具有偽過氧化物酶活性，可以用來(lái)清除反應(yīng)體系中的酚、胺污染物。對(duì)ABTS底物的催化氧化能力是檢測(cè)這類酶或者酶制劑活性的常用方法。
[0049]I)磁驅(qū)固定化載體制備:
[0050](I)磁驅(qū)核心鐵粒子制備:4.21克Fe2 (SO4)3與2.92克FeS047H20在用200微升濃度為35.7%的濃鹽酸酸化的80毫升去離子水中混合，然后將上述鐵鹽的酸性反應(yīng)體系放在60°C水浴中溫和振蕩(利用懸垂臂攪拌器進(jìn)行攪拌混合，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)每分鐘)30分鐘，加入質(zhì)量體積百分比為25%的濃氨水40毫升，繼續(xù)在60°C水浴中溫和振動(dòng)30分鐘；然后將該反應(yīng)體系迅速移至70°C水浴中，加入20毫升油酸，繼續(xù)溫和振動(dòng)30分鐘，反應(yīng)體系中形成的磁性鐵粒子進(jìn)入油酸層。利用磁選法收集磁性鐵粒子，采用丙酮20毫升分3次洗滌，獲得目的納米尺度鐵粒子(見圖1 )，鐵粒子放在空氣中過夜晾干，稱重，質(zhì)量為5.35克，如圖1所示鐵粒子的直徑小于20納米。這種尺度的鐵粒子具有超順磁性。[0051](2)鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)酶固定化載體制備:上述步驟合成的75.7毫克磁性鐵粒子加到300毫升乙醇中，室溫下超聲I小時(shí)，使得磁性鐵粒子充分分散在乙醇溶液內(nèi)。磁性鐵粒子乙醇懸濁液傾倒轉(zhuǎn)移到新的錐形瓶中，移除不能懸浮在乙醇中的固體物質(zhì)。然后向該懸濁液中緩慢加入3.6毫升正硅酸乙酯，利用懸垂臂攪拌器室溫下溫和攪拌過夜，利用磁選法收集硅基化的磁驅(qū)酶固定化載體，硅基固定化載體利用500毫升乙醇分3次進(jìn)行洗滌，獲得97.8毫克鐵粒子-硅基結(jié)構(gòu)酶固定化載體。
[0052](3)氨基修飾的磁驅(qū)酶固定化載體制備:96.3mg磁驅(qū)娃基固定化載體室溫下利用超聲分散到300毫升乙醇溶液中形成磁驅(qū)硅基固定化載體乙醇懸濁液，210微升APTS(3-氨基丙基三甲氧基硅烷)加入到上述懸濁液中，利用懸垂臂攪拌器室溫下攪拌10小時(shí)，確?；鶊F(tuán)化(氨基化)完全進(jìn)行，氨基化磁驅(qū)硅基固定化載體利用磁選法進(jìn)行收集(磁場(chǎng)方向垂直于地磁場(chǎng)方向)，該載體利用500毫升乙醇分3次進(jìn)行洗滌，共獲得186.0毫克目的載體。如圖2所示，我們制備的鐵粒子-硅基殼結(jié)構(gòu)磁驅(qū)固定化酶載體直徑在50nm以內(nèi)。
[0053]2)磁驅(qū)固定化血紅蛋白制備:
[0054]150毫克氨基修飾的磁驅(qū)酶固定化載體分散于40毫升磷酸緩沖液(50毫摩爾PH7.4)中，利用120毫升磷酸緩沖液分3次磁選法洗滌載體，最后將氨基修飾的磁驅(qū)酶固定化載體分散于含10%戊二醛的40毫升磷酸緩沖液中進(jìn)行活化。活化在室溫溫和攪拌的條件下進(jìn)行I小時(shí)。活化后的載體利用200毫升磷酸緩沖液分3次進(jìn)行洗滌。收集后的載體與180毫升、濃度為5暈克每毫升的血紅蛋白進(jìn)行混合,室溫下溫和振蕩10小時(shí)以確保蛋白的充分固定化。磁選法收集固定化蛋白的載體獲得磁驅(qū)固定化血紅蛋白。
[0055]3)酶固定化率計(jì)算:
[0056]溶液部分進(jìn)行合并收集，利用光譜法檢測(cè)未結(jié)合于固定化載體上的蛋白的量，計(jì)算單位磁驅(qū)硅基載體上固定化的蛋白質(zhì)量和蛋白的固定化率。經(jīng)計(jì)算可知每毫克氨基磁驅(qū)硅基固定化載體上血紅蛋白的固載量為3.4毫克，900毫克血紅蛋白中有52%的蛋白被固定化在載體上。
[0057]4)單位有效酶活性計(jì)算:
[0058]制備得到的磁驅(qū)固定化血紅蛋白室溫下單位有效酶活性即固定化酶比活與游離酶比活之比為1.7。有效酶活性=固定化酶比活力/游離酶比活力。
[0059]5)脈沖磁場(chǎng)對(duì)磁驅(qū)固定化血紅蛋白催化氧化ABTS能力的影響:
[0060]用ABTS為底物時(shí)，無(wú)外磁場(chǎng)作用下，固定化酶呈現(xiàn)非常微弱的溫度依賴活性變化規(guī)律，游離酶呈現(xiàn)典型的鐘形溫度依賴活性變化規(guī)律(圖3)。如圖所示，固定化酶(淺色組)呈現(xiàn)出較為微弱的溫度相關(guān)酶活力變化，游離酶呈現(xiàn)出較為明顯的溫度相關(guān)“鐘形”曲線變化，即在酶達(dá)到最大活力前，隨反應(yīng)體系的溫度上升，游離酶的催化活力明顯上升，達(dá)到酶的最大活力后，隨反應(yīng)體系的溫度上升，游離酶活力出現(xiàn)明顯下降，這種活力下降與酶的高溫失活有關(guān)。這說明，固定化酶對(duì)反應(yīng)體系的溫度變化不敏感，它更適用于大水體催化反應(yīng)；在O~1.2T的磁場(chǎng)作用下，游離酶催化活性呈鐘型變化，0.4T時(shí)游離酶活性是無(wú)磁場(chǎng)強(qiáng)度下游離酶活性的 1.5倍(圖4，做固定化酶研究時(shí)，需要注意在多個(gè)方面與游離酶進(jìn)行對(duì)比，看看固定化操作對(duì)酶自身的活性的影響，游離酶是固定化酶研究的參照物)。在周期為0.66次/s,脈沖寬度為42毫秒,磁場(chǎng)強(qiáng)度在O~0.15T之間的交變脈沖磁場(chǎng)磁場(chǎng)作用下，固定化酶催化活性呈鐘型變化，磁場(chǎng)強(qiáng)度為0.1T時(shí)固定化酶活性是無(wú)磁場(chǎng)強(qiáng)度下固定化酶活性的1.5倍(圖4)。如圖4所示，外磁場(chǎng)強(qiáng)度增加時(shí)，游離酶(血紅蛋白)呈現(xiàn)“鐘形”催化活力變化曲線，說明磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)酶的催化功能有一定的調(diào)節(jié)和影響，磁場(chǎng)對(duì)固定化酶同樣存在“鐘形”催化活力變化影響，不同的是，固定化酶在較弱的外磁場(chǎng)作用下呈現(xiàn)出與游離酶在較強(qiáng)磁場(chǎng)作用下相似的催化活性。這表明，本專利中制備的磁驅(qū)酶固定化載體可以賦予酶較高的磁場(chǎng)敏感性，使得酶在較弱的外磁場(chǎng)作用下獲得較為顯著的活性調(diào)節(jié)，這使得外磁場(chǎng)在釋放、回收和驅(qū)動(dòng)固定化酶進(jìn)行大水體體系反應(yīng)催化時(shí)，采用較弱的磁場(chǎng)強(qiáng)度即可獲得較高的催化效率，磁場(chǎng)強(qiáng)度低時(shí)，誘發(fā)磁場(chǎng)所需的能量也隨之降低，即，低能耗下獲得更高的催化活性。
[0061]上述現(xiàn)象說明，本專利合成的磁驅(qū)酶固定化載體在進(jìn)行酶的單層固定化時(shí)，可以使得固定化酶具有更好的溫度穩(wěn)定性，固定化酶的溫度穩(wěn)定性高，使得固定化酶在使用時(shí)對(duì)環(huán)境的溫度變化不敏感，具有更加寬廣的使用范圍；酶固定在本專利制備的磁驅(qū)酶固定化載體上時(shí)，酶的活性更容易受到外界磁場(chǎng)的影響，達(dá)到相同催化活性時(shí)，固定化酶需要更低的外磁場(chǎng)強(qiáng)度，這使得外磁場(chǎng)在釋放、回收和驅(qū)動(dòng)固定化酶進(jìn)行大水體體系反應(yīng)催化時(shí)，采用較低的磁場(chǎng)強(qiáng)度即可獲得較高的催化效率，磁場(chǎng)強(qiáng)度低時(shí)，誘發(fā)磁場(chǎng)所需的能量也隨之降低，即，低能耗下獲得更高的催化活性。
[0062]6)環(huán)境因素對(duì)酶制劑催化活性的影響:
[0063]實(shí)驗(yàn)證明，固定化酶具有較好的穩(wěn)定性，經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶長(zhǎng)時(shí)間酶解后，固定化酶的氧化催化能力保存80%以上；酶制劑經(jīng)過100°C加熱30分鐘后生物活性保持50%以上；經(jīng)過10次重復(fù)使用，固定化酶制劑呈現(xiàn)較好的活性穩(wěn)定性和回收性(99%);酶制劑保存在去離子水中，保存2個(gè)月活性未見明顯變化。
[0064]上述現(xiàn)象表明，固定在本發(fā)明制備的磁驅(qū)酶固定化載體上的固定化酶具有很高的活性穩(wěn)定性和抗蛋白酶酶解能力，這一特點(diǎn)使得該類固定化酶可以用于環(huán)境復(fù)雜水體中的催化反應(yīng)。
[0065]實(shí)施例2:
[0066]磁驅(qū)固定化基因工程透明顫菌血紅蛋白
[0067]基因工程改造蛋白構(gòu)建:根據(jù)步驟5)中的基因工程改造蛋白的原則，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析結(jié)果，將來(lái)源于原核生物透明顫菌的血紅蛋白(該蛋白的序列和結(jié)構(gòu)為公知技術(shù)，任何人可以從多種渠道獲得，也可以直接讓公司進(jìn)行化學(xué)合成)進(jìn)行分子改造，需要在蛋白C末端添加一段序列為GGG￡GG|2iGG的多妝序列，該序列的特征在于含有疏基側(cè)鏈氣基酸殘基Cys及氨基側(cè)鏈氨基酸殘基Lys。這里我們通過基因合成公司用化學(xué)合成的辦法合成了新的目的蛋白基因(我們提供目的基因序列，由公司化學(xué)合成)，該蛋白的表達(dá)、純化與一般的基因工程蛋白表達(dá)純化途徑相同。該蛋白的表征采用紫外-可見吸收光譜和血紅蛋白相同的活性檢測(cè)方法。
[0068]選用透明顫菌血紅蛋白的意義在于，I)它與血紅蛋白相同，同樣具有偽過氧化物酶活性；2)它的晶體結(jié)構(gòu)已知，便于利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析；3)它的基因工程改造較為成熟。
[0069]與實(shí)施例1相比，主要操作差別存在于這里是利用步驟6)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)酶的定取向固定化，具體差異操作如下:
[0070]I)磁驅(qū)酶固定化載體官能團(tuán) 化修飾:磁驅(qū)酶固定化載體制備步驟采用130微升APTS+80微升MPTS (3-巰基丙基三甲氧基硅烷)代替210微升APTS作為基團(tuán)化試劑；
[0071]2)第一次基于巰基的單層定向固定化:磁驅(qū)酶固定化載體合成后不利用10%戊二醛進(jìn)行活化，直接加入180毫升濃度為5毫克每毫升基因工程改造目標(biāo)蛋白和硫酸銅溶液使得反應(yīng)體系內(nèi)銅離子的終濃度為0.5微摩爾每升，促使酶C末端添加序列上的Cys殘基的巰基與載體表面巰基間形成二硫鍵，從而實(shí)現(xiàn)酶的單層、定向固定化；室溫混合I小時(shí)后分三次利用磁選法洗滌未結(jié)合目標(biāo)蛋白，分離得到磁驅(qū)固定化酶。由于二硫鍵存在化學(xué)環(huán)境敏感的特性，使得固定化酶使用范圍不夠?qū)?，故需要進(jìn)行利用雙功能交聯(lián)劑進(jìn)行的二次固定化；
[0072]3)第二次雙功能交聯(lián)劑固定化:將固定化酶懸浮于PBS緩沖液中，加入大過量酶的底物ABTS (終濃度為2毫摩爾每升)和葡萄糖(終濃度為0.3摩爾每升)，加入戊二醛使其終濃度為2~5%，室溫下反應(yīng)2小時(shí)，使得固定在磁驅(qū)固定化酶載體上的酶通過二硫鍵附近的載體上氨基和目標(biāo)蛋白C末端添加序列上的氨基殘基(Lys)間通過戊二醛形成共價(jià)交聯(lián)。利用120毫升的PBS緩沖液分三次洗滌固定化酶制劑，去除多余的ABTS和戊二醛，收集磁驅(qū)固定化透明顫菌血紅蛋白，按照實(shí)施例1中酶固定化率測(cè)定方法測(cè)試，經(jīng)計(jì)算可知每毫克氨基磁驅(qū)硅基固定化載體上透明顫菌血紅蛋白的固載量為2.1毫克。二次固定化時(shí)，底物和多羥基物質(zhì)的添加可以最大限度抑制雙功能交聯(lián)劑在活性相關(guān)區(qū)域的固定化，降低共價(jià)交聯(lián)法對(duì)固定化酶活性抑制。
[0073]利用本方法固定化的基因工程改造透明顫菌血紅蛋白在催化氧化大水體環(huán)境內(nèi)的ABTS時(shí)，室溫下單位有效酶活性0.97。
[0074]實(shí)施例3:
[0075]磁驅(qū)固定化基因工程透明顫菌血紅蛋白和葡萄糖氧化酶
[0076]本實(shí)施例中 采用是實(shí)施例2中的氨基-巰基雙官能團(tuán)修飾磁驅(qū)酶固定化載體進(jìn)行透明顫菌血紅蛋白和葡萄糖氧化酶的雙酶反應(yīng)器共固定，該雙酶反應(yīng)器的特征為葡萄糖氧化酶消耗反應(yīng)體系中外源添加的葡萄糖，利用水中溶解的氧產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫作為具有偽過氧化物酶活性的透明顫菌血紅蛋白的底物，經(jīng)透明顫菌血紅蛋白催化產(chǎn)生過氧自由基與反應(yīng)體系中的ABTS進(jìn)行催化氧化反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)大水體反應(yīng)體系的無(wú)外源過氧化氫添加和過氧化氫的高效利用。
[0077]與實(shí)施例1和實(shí)施例2相比，主要操作差別在于這里是利用步驟7)實(shí)現(xiàn)多酶固定化，具體差異操作如下:
[0078]I)第二次雙功能交聯(lián)劑固定化:將固定化酶懸浮于PBS緩沖液中，加入大過量酶的底物ABTS (終濃度為2毫摩爾每升)和葡萄糖(終濃度為0.3摩爾每升)，加入戊二醛使其終質(zhì)量百分比濃度為2~5%，室溫下反應(yīng)2小時(shí)，使得固定在磁驅(qū)固定化酶載體上的酶通過二硫鍵附近的載體上氨基和目標(biāo)蛋白C末端添加序列上的氨基殘基(Lys)間通過戊二醛形成共價(jià)交聯(lián)。利用120毫升的葡萄糖濃度為0.3摩爾每升的PBS緩沖液分三次洗滌固定化酶制劑，去除多余的ABTS和戊二醛，收集磁驅(qū)固定化透明顫菌血紅蛋白，將其懸浮在180毫升濃度為5毫克每毫升的葡萄糖氧化酶溶液中，溫下溫和振蕩10小時(shí)以確保蛋白的充分固定化。
[0079]磁選法收集固定化蛋白的載體，溶液部分與利用120毫升磷酸緩沖液分三次洗滌，溶液部分進(jìn)行合并收集，利用光譜法檢測(cè)未結(jié)合于固定化載體上的蛋白的量，計(jì)算單位磁區(qū)硅基載體上固定化的蛋白質(zhì)量和蛋白的固定化率，經(jīng)計(jì)算可知每毫克磁驅(qū)酶固定化載體上固載透明顫菌血紅蛋白2.1毫克，固載葡萄糖氧化酶0.3毫克。
[0080]利用本方法固定化的透明顫菌血紅蛋白和葡萄糖氧化酶雙酶反應(yīng)體系在催化氧化大水體環(huán)境內(nèi)的ABTS時(shí)不需要外界添加過氧化氫，具有高安全性和經(jīng)濟(jì)可控的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)大水體中的ABTS的催化氧化能力是相同含量葡萄糖氧化酶、透明顫菌血紅蛋白混合體系的11 .3倍。
【權(quán)利要求】
1.一種磁驅(qū)固定化酶，其特征在于:該磁驅(qū)固定化酶是以納米尺度的順磁性鐵粒子為磁驅(qū)動(dòng)核心，以氨基、羧基或巰基基團(tuán)化試劑修飾的硅基材料為外殼；目標(biāo)酶或基因工程改造酶通過基團(tuán)化試劑引入的官能化基團(tuán)固定化在硅基材料的外殼上，進(jìn)而形成的單一酶單層磁驅(qū)固定化酶、單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶、多種酶單層定比例磁驅(qū)固定化酶或多種酶單層定取向定比例磁驅(qū)固定化酶。
2.權(quán)利要求1所述的磁驅(qū)固定化酶的制備方法，其步驟如下: (O納米尺度鐵粒子磁驅(qū)動(dòng)核心的制備:將摩爾比為1:1的二價(jià)鐵鹽與三價(jià)鐵鹽在pH=4.0~6.0的去離子水中混合，然后將上述鐵鹽的酸性反應(yīng)體系在50~70°C水浴條件下振蕩20~50分鐘，加入氨水使反應(yīng)體系的pH=10~11，繼續(xù)在50~70°C水浴條件下振動(dòng)20~40分鐘；再加入15~30毫升油酸，繼續(xù)在50~70°C水浴條件下振動(dòng)20~40分鐘，反應(yīng)體系中形成的納米尺度的鐵粒子進(jìn)入油酸層；最后磁選收集鐵粒子，丙酮洗滌后晾干; (2)鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體的制備:將鐵粒子在室溫下超聲分散到乙醇溶液中形成濃度為0.15~0.3毫克/毫升的懸濁液，然后向該懸濁液中緩慢加入硅基化試劑，鐵粒子與硅基化試劑的質(zhì)量比為1:10~15，攪拌過夜；磁選收集得到的鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體，乙醇洗滌后晾干； (3)氨基、羧基或巰基修飾的磁驅(qū)酶固定化載體的制備:將鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體在室溫下超聲分散到乙醇溶液中形成濃度為0.2~0.4毫克每毫升的懸濁液，然后將氨基、羧基或巰基基團(tuán)化試劑加入到上述懸濁液中，室溫下攪拌8~14小時(shí)，磁選收集得到的氨基、羧基或巰基修飾的磁驅(qū)酶固定化載體，乙醇洗滌后晾干；其中，鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體與基團(tuán)化試劑的質(zhì)量比為450~500:1 ; (4)酶單層固定化的磁驅(qū)`酶固定化載體的制備:將氨基、羧基或巰基修飾的磁驅(qū)酶固定化載體用磷酸緩沖液洗滌后磁選收集，然后分散于雙功能交聯(lián)劑質(zhì)量百分含量為2~10%的磷酸緩沖液中進(jìn)行活化，磁驅(qū)酶固定化載體的終濃度為1.6~6.7毫克每毫升；活化后的載體用磷酸緩沖液洗滌后磁選收集，從而去除未反應(yīng)的游離的雙功能交聯(lián)劑；在磷酸緩沖液中，將收集后的載體與目標(biāo)酶分子混合，室溫下振蕩8~14小時(shí)；最后用磷酸緩沖液洗滌后磁選收集，從而得到單一酶單層磁驅(qū)固定化酶；其中，氨基、羧基或巰基修飾的磁驅(qū)酶固定化載體與目標(biāo)酶的質(zhì)量比為1:3~9 ; 或?qū)⑹占蟮妮d體與兩種或兩種以上的目標(biāo)酶分子混合，室溫下振蕩8~14小時(shí)；最后用磷酸緩沖液洗滌后磁選收集，從而得到多種酶單層定比例磁驅(qū)固定化酶；其中，氨基、羧基或巰基修飾的磁驅(qū)酶固定化載體與兩種或兩種以上目標(biāo)酶的質(zhì)量比為1:3~9。
3.權(quán)利要求1所述的磁驅(qū)固定化酶的制備方法，其步驟如下: (O納米尺度鐵粒子磁驅(qū)動(dòng)核心的制備:將摩爾比為1:1的二價(jià)鐵鹽與三價(jià)鐵鹽在pH=4.0~6.0的去離子水中混合，然后將上述鐵鹽的酸性反應(yīng)體系在50~70°C水浴條件下振蕩20~50分鐘，加入氨水使反應(yīng)體系的pH=10~11，繼續(xù)在50~70°C水浴條件下振動(dòng)20~40分鐘；再加入15~30毫升油酸，繼續(xù)在50~70°C水浴條件下振動(dòng)20~40分鐘，反應(yīng)體系中形成的納米尺度的鐵粒子進(jìn)入油酸層，利用油酸與水溶液的不相容性將鐵粒子與水溶性反應(yīng)溶液分離開；最后磁選收集鐵粒子，丙酮洗滌后晾干； (2)鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體的制備:將鐵粒子在室溫下超聲分散到乙醇溶液中形成濃度為0.15~0.3毫克/毫升的懸濁液，然后向該懸濁液中緩慢加入硅基化試劑，鐵粒子與硅基化試劑的質(zhì)量比為1:10~15，攪拌過夜；磁選收集得到的鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體，乙醇洗滌后晾干； (3)基因工程改造酶的構(gòu)建:在目標(biāo)酶分子活性口袋和底物結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)端插入成簇的巰基(cys)、氨基(Lys或Arg)、羧基(Glu或Asp)側(cè)鏈氨基酸中的兩種或三種,構(gòu)建富含可與雙功能交聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)的團(tuán)簇區(qū)，各種組合中巰基是必須包括的基團(tuán)； (4)單層定取向磁驅(qū)酶固定化載體的制備:將步驟2)制備得到的鐵粒子-硅基核殼結(jié)構(gòu)的磁驅(qū)酶固定化載體在室溫下超聲分散到乙醇溶液中，形成濃度為0.2~0.4毫克每毫升的乙醇懸濁液，將包含巰基基團(tuán)化試劑在內(nèi)的兩種或兩種以上的氨基、羧基或巰基基團(tuán)化試劑加入到上述懸濁液中，室溫下溫和攪拌8~14小時(shí)，最后用磷酸緩沖液進(jìn)行3~5次的磁選收集，用乙醇洗滌后晾干，制得用于單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶載體； (5)基于二硫鍵的單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶的制備:將單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶載體與基因工程改造酶按質(zhì)量比為1:3~9在50毫摩爾每升、pH=7.4的磷酸緩沖液中混合0.5~2小時(shí)，最后用磷酸緩沖液進(jìn)行3~5次的磁選收集，從而得到基于二硫鍵的單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶； (6)單層定取向磁驅(qū)酶固定化的二次固定化:將步驟(5)獲得的基于二硫鍵的單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶懸浮在磷酸緩沖液中，得到磁驅(qū)固定化酶的濃度為1.6~7毫克每毫升的懸濁液，然后加入酶的底物，使底物與基因工程改造酶的摩爾比為50~100:1 ;再加入多羥基物質(zhì)使其質(zhì)量百分濃度為0.5~10%，加入雙功能交聯(lián)劑使其質(zhì)量百分濃度為2~5%，室溫下溫和振蕩0.5~4小時(shí)，使得二硫鍵固定的基因工程改造酶通過分子表面團(tuán)簇內(nèi)氨基或羧基基團(tuán)與單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶載體表面的氨基或羧基基團(tuán)形成共價(jià)交聯(lián)，實(shí)現(xiàn)酶的二 次固定化，最后用磷酸緩沖液進(jìn)行3~5次的磁選收集，從而得到二次固定化的單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶； 或?qū)⒉襟E(5)獲得的基于二硫鍵的單一酶單層定取向磁驅(qū)固定化酶懸浮在含有質(zhì)量百分比為0.5~10%的多羥基物質(zhì)的磷酸緩沖液中，得到磁驅(qū)固定化酶的濃度為1.6~7毫克每毫升的懸濁液，然后加入酶的底物，使底物與基因工程改造酶的摩爾比為50~100:1，加入雙功能交聯(lián)劑使其質(zhì)量百分濃度為2~5%，室溫下溫和振蕩0.5~4小時(shí)，再用多羥基物質(zhì)質(zhì)量百分比濃度為0.5~10%的磷酸緩沖液進(jìn)行3~5次洗滌磁選收集；然后將收集得到的固定化酶懸浮在第二種酶的磷酸緩沖液中，其中固定化酶的濃度為1.6~7毫克每毫升，第二種酶的濃度為0.2~10毫克每毫升，兩種酶分子的摩爾比為1:0.1~10，室溫下溫和振蕩10小時(shí)，最后用磷酸緩沖液進(jìn)行3~5次的磁選收集多種酶單層定取向定比例磁驅(qū)固定化酶。
4.如權(quán)利要求2或3所述的磁驅(qū)固定化酶的制備方法，其特征在于:二價(jià)鐵鹽是硫酸亞鐵、硝酸亞鐵或氯化亞鐵，三價(jià)鐵鹽是硫酸鐵、硝酸鐵或氯化鐵。
5.如權(quán)利要求2或3所述的磁驅(qū)固定化酶的制備方法，其特征在于:硅基化試劑是正硅酸乙酯、正硅酸甲酯或水玻璃。
6.如權(quán)利要求2或3所述的磁驅(qū)固定化酶的制備方法，其特征在于:氨基、羧基、巰基化試劑分別是3-氨基丙基_ 二甲氧基硅烷、3-羧基丙基_ 二甲氧基硅烷、3-疏基丙基_ 二甲氧基硅烷。
7.如權(quán)利要求2所述的磁驅(qū)固定化酶的制備方法，其特征在于:活化是在室溫溫和攪拌的條件下進(jìn)行0.5~2小時(shí)。
8.如權(quán)利要求2或3所述的磁驅(qū)固定化酶的制備方法，其特征在于:雙功能交聯(lián)劑為戊二醛、丁二酸酐、己二酰亞胺酸二甲酯或雙重氮聯(lián)苯胺_2，2-二磺酸。
9.如權(quán)利要求3所述的磁驅(qū)固定化酶的制備方法，其特征在于:多羥基物質(zhì)是葡萄糖、海藻糖、蔗糖或PEG。`
【文檔編號(hào)】C12N11/10GK103865916SQ201410114538
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】呂明, 周杰, 吳家安, 杜金玲 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)