一株有活性的雙歧桿菌菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細胞生物學領(lǐng)域，涉及一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法及試劑。本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，改進當前海馬神經(jīng)元體外分離和培養(yǎng)的方法，解決了海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的增殖性和活性無法保持的問題。本發(fā)明的細胞種植液含有雙歧桿菌(Bifidobacterium?sp.)WZ002的活性發(fā)酵濾液。建立了一套比較成熟的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的方法，本發(fā)明得到的神經(jīng)細胞數(shù)量充足，生長狀態(tài)較好，能夠從哺乳動物的海馬組織中分離出高活性、高數(shù)量的海馬神經(jīng)細胞，符合原代海馬細胞培養(yǎng)的要求，可滿足神經(jīng)科學研究中細胞生物學實驗的需求。
【專利說明】一株有活性的雙歧桿菌菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬 生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一株有活性的雙歧桿菌菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]海馬(hippocampal)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，作為神經(jīng)元高度集中的區(qū)域，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的典型特性，在學習、記憶、情緒反應(yīng)及自主神經(jīng)功能等方面發(fā)揮重要作用。神經(jīng)元細胞培養(yǎng)模型是研究神經(jīng)元發(fā)育分化、神經(jīng)再生、神經(jīng)疾病的發(fā)生機制等重要的實驗?zāi)Ｐ停w外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元已成為研究阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的重要技術(shù)手段。原代培養(yǎng)(primary culture)是指從活體細胞獲得細胞、組織或器官，在體外條件下進行的第一次培養(yǎng)。神經(jīng)元原代培養(yǎng)是將胚胎哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分組織，如海馬組織、大腦皮層、小腦、下丘腦、海馬、脊髓和神經(jīng)叢從機體直接取出，再接種培養(yǎng)的方法。目前國內(nèi)、外有關(guān)神經(jīng)元培養(yǎng)的方法較多，但在原代培養(yǎng)中神經(jīng)元的純度和產(chǎn)量方面還存在一些急待解決的問題。由于神經(jīng)元是一種高度分化的細胞，動物出生后很少分裂，相對于其它細胞而言，神經(jīng)元在體外更難以存活和生長。因此，體外培養(yǎng)神經(jīng)元要求的培養(yǎng)方法和營養(yǎng)條件均較為特殊。
[0003]目前，導(dǎo)致難以獲得足夠數(shù)量和活力的原代海馬神經(jīng)元的因素有以下幾方面:(I)海馬神經(jīng)組織分離過程中，多數(shù)人用D-hanV s或hanV s作為漂洗液，離體哺乳動物海馬組織中去除紅細胞、被膜及結(jié)締組織等雜質(zhì)，分離過程時間較長，有時候需要2小時以上，在漂洗液中時間會更長，海馬神經(jīng)元即已部分死亡，從而出現(xiàn)假陰性的培養(yǎng)結(jié)果。實驗上無法開展海馬神經(jīng)元的常規(guī)培養(yǎng)，主要可能是因為沒有合適的用于海馬組織標本的神經(jīng)元培養(yǎng)用漂洗液/解剖液之故。在組織分離過程中，即使冰浴，神經(jīng)元依然進行著很大程度代謝，hank' s液的無糖環(huán)境對神經(jīng)元分離很不利，在hank' s液中添加DMEM或者高糖來供給大腦的代謝，但葡萄糖濃度太高，易增加細菌污染的機會；添加DMEM培養(yǎng)液會堿性化，不利于神經(jīng)元細胞存活。中國專利CN102978162A“一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法及試劑”、中國專利CN102994452A “一種高效分離和培養(yǎng)神經(jīng)元的方法”和中國專利CN102994451A “一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)的改進型方法”，取腦組織放入盛有I X PBS的培養(yǎng)皿中，所采用清洗液均為PBS液，DMEM-高糖或DMEM-F12與馬血清來浸泡解剖過程中的大腦，來供給大腦的代謝，考慮到了神經(jīng)元能量代謝需要，但未添加任何抗菌物質(zhì)，葡萄糖濃度太高，就容易增加細胞污染的機會。(2)采用大劑量胰蛋白酶消化后，海馬神經(jīng)細胞勢必受到相當程度的生比和機械損害；細胞表面的粘附分子或膜蛋白極易受到破壞，對于這類具有立體結(jié)構(gòu)用以維持細胞增殖及自我更新的細胞來說，很難迅速恢復(fù)細胞狀態(tài)，往往伴隨著大范圍的細胞死亡/凋亡，細胞“老化”嚴重，細胞活力將明顯減弱，組織中不能獲得大量活細胞；(3)細胞種植液對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元至關(guān)重要，細胞種植液不同于接下來的細胞維持液，需要給予神經(jīng)細胞特殊的生長因子，這樣才能保證獲得足夠數(shù)量和活力的海馬神經(jīng)元。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種哺乳動物的海馬神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)的方法，目的是建立一種簡單易行、高純度的海馬神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)的方法及試劑，滿足神經(jīng)科學研究的需求。
[0005]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一為:
[0006]本發(fā)明的雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)WZ002,已于2014年I月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)，保藏編號為 CGMCC N0.8809。
[0007]本發(fā)明的雙歧桿菌WZ002分離于一名浙江省健康青年人糞便中。
[0008]本發(fā)明的雙歧桿菌WZ002菌株具有下述微生物學特征:
[0009](1)菌落形態(tài):WZ002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質(zhì)地軟、邊緣整齊，直徑I~1.5mm。
[0010](2)個體形態(tài):G+無芽孢桿菌，桿狀。
[0011](3)生理生化特征:D_核糖(+) ;L_阿拉伯糖(+);乳糖(+);纖維二糖㈠；松三糖(+);棉籽糖(+);山梨醇(-);淀粉(-);葡萄糖酸鈉(-);木糖(+);甘露糖(-);果糖(+);半乳糖(+);蔗糖(+);麥芽糖(+);海藻糖(-);密二糖(+);甘露醇(+);菊糖(-);水楊素(-);F6PPK酶⑴；對氧的反應(yīng)(在好氣固體培養(yǎng)基上不生長)；硝酸鹽還原㈠；觸酶㈠；靛基質(zhì)反應(yīng)(_)。
[0012]厭氧下生長良好，有氧環(huán)境中不生長。最適生長溫度37~41°C ;最低生長溫度25~28°C;最高43~45°C;生長最適ρΗ6.5~7.0 ;在ρΗ4.5~5.0或8.0~8.5不生長。
[0013]所述雙歧桿菌(Bifidobacteriumsp.)WZ002, CGMCC N0.8809 應(yīng)用于海馬神經(jīng)元的細胞種植液中。
[0014]我們實驗過程中意外發(fā)現(xiàn):雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)WZ002菌株的活性發(fā)酵濾液既能提供營養(yǎng)成分，又可促進神經(jīng)元生長，獲取神經(jīng)元的數(shù)量可以滿足實驗的需要。
[0015]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二為:海馬神經(jīng)元的分離、原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0016]1.漂洗:取離體哺乳動物的海馬組織，置冰浴的漂洗液中，去除紅細胞、被膜及結(jié)締組織，用漂洗液沖洗2~5次；
[0017]2.消化:將步驟I漂洗后的海馬組織剪成直徑Imm3小塊，用5倍組織體積的消化液37°C作用5~10分鐘，組織成粥糜狀，用細胞種植液終止消化，輕輕吹打至組織塊10次以分散細胞。
[0018]3.制備細胞懸液:收集步驟2消化后初次細胞懸液，經(jīng)200目細胞篩過濾后，
[0019]800~1000rpm4°C離心5~10分鐘，棄去上清液，加入細胞種植液，重懸細胞，制成5 X 1O5~10 X 1O5個/mL的單細胞懸液；
[0020]4.接種、培養(yǎng):將步驟3細胞懸液種植于預(yù)先鋪好多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，種植后24~72小時換成細胞維持液，之后每隔兩天用細胞維持液換液，每次更換的量為原體積的1/2。
[0021]試劑購買:[0022]DMEM/F12神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基和B27購于Gibco公司；多聚賴氨酸、胎牛血清(FBS)、海藻糖和L-谷氨酰胺購于美國Sigma公司；青鏈霉素混合液(雙抗)，購于美國HyClone公司。
[0023]試劑的配置:
[0024](I)所述的D-Hank ' s液，經(jīng)過如下步驟得到:NaC18.0g, KC10.4g,Na2HPO4.12H200.12g，KH2PO40.06g, NaHCO30.35g ;依次將各成分溶解于約 500mL 三蒸水中混勻，加三蒸水定容至1000mL,調(diào)整pH值至7.2~7.4，分裝，高壓滅菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0025](2)所述的漂洗液，經(jīng)過如下步驟得到:2g海藻糖、3g葡萄糖和IOmL雙抗溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻,加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0026](3)所述的消化液，經(jīng)過如下步驟得到:1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻，加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.22 μ m濾膜過濾除菌,0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌,分裝,4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027](4)所述的活性發(fā)酵濾液，經(jīng)過如下步驟得到:
[0028]①雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.) WZ002,該菌株已于2014年I月22日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8809 ；
[0029]②雙歧桿菌WZ002采用改良MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為:以重量計，取蛋白胨IOg,牛肉膏IOg,酵母膏5g，葡萄糖20g,乙酸鈉5g，K2HP042g, MgSO4.7Η200.5g，MnSO4.4Η200.2g，低聚果糖3g，檸檬酸二銨2g，吐溫_801mL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6.5，115°C高壓滅菌15-20分鐘。
[0030]③將雙歧桿菌WZ002接種于冷卻至40±2°C的步驟②改良MRS培養(yǎng)基中，菌種接種量為0.2~0.5%，35±2°C厭氧培養(yǎng)24小時，用分光光度計測定上述培養(yǎng)液A58tlnm值為1.2時，將上述培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)數(shù)5000~8500rpm下離心10分鐘后，取上清液，0.22 μ m濾膜過濾除菌，即得到活性發(fā)酵液濾液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0031](5)所述的多聚賴氨酸，經(jīng)過如下步驟得到:10mg多聚賴氨酸溶于IOmL三蒸水中，混勻，加三蒸水定容至IOOmL, 0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌,分裝,冰凍備用。
[0032](6)所述的細胞種植液，經(jīng)過如下步驟得到:DMEM/F12培養(yǎng)基加入胎牛血清、活性發(fā)酵濾液和雙抗，使胎牛血清終濃度為10%、活性發(fā)酵濾液終濃度為0.2%，雙抗終濃度為I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033](7)所述的細胞維持液，經(jīng)過如下步驟得到=Neurobasal培養(yǎng)基加入B27和谷氨酰胺，使B27終濃度為2 %，谷氨酰胺終濃度I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0034](8)所述的雙抗,為青霉素-鏈霉素溶液(100 X),青霉素含量為10000U/mL,鏈霉素含量為10mg/mL。1%雙抗:青霉素含量為100U/mL,鏈霉素含量為0.lmg/mL。
[0035]本發(fā)明具有以下優(yōu)點及效果:
[0036]1.漂洗步驟中，海馬組織浸潤在氫氣環(huán)境下，最大化減少組織的分離操作對海馬神經(jīng)細胞的損傷，而且，氫氣具有極強的生物學活性，最大限度保護海馬神經(jīng)細胞不受傷害，可提高了原代海馬神經(jīng)細胞的存活率和生物活性。[0037]2.漂洗液含有海藻糖，替換常規(guī)使用的蔗糖，蔗糖粘度較大，不利于組織分離操作。海藻糖對生物體具有神奇的保護作用，在細胞表面能形成獨特的保護膜，有效地保護神經(jīng)細胞，維持生命體的生命過程和生物特征，而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖類，均不具備這一功能。
[0038]3.消化步驟中，采用了富含氫氣的消化液，使得胰蛋白酶與所消化組織充分接觸和作用，氣體攪拌均勻，胰蛋白酶消化效率大大提高，胰蛋白酶使用劑量和經(jīng)歷的時間有所縮短(從原來的10~20分鐘縮短到不超過10分鐘)，同時又增加了海馬神經(jīng)元生理呼吸，氫氣本身又是健康因子，使海馬神經(jīng)元細胞更多地保持了原有的生物活性。短時間、低濃度胰酶即達到必要的消化效果，對神經(jīng)元損傷更小，也提高了神經(jīng)元的體外存活率。
[0039]總之，本發(fā)明建立了一套比較成熟的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的方法，即在氫氣環(huán)境下漂洗和酶消化，漂洗液含有保護功能的海藻糖，低濃度、短時間的酶分離細胞和含活性發(fā)酵濾液的特殊種植培養(yǎng)基；本發(fā)明得到的神經(jīng)細胞數(shù)量充足，生長狀態(tài)較好，能夠從哺乳動物的海馬組織中分離出高活性、高數(shù)量的海馬神經(jīng)細胞，符合海馬細胞神經(jīng)元原代培養(yǎng)的要求。
【具體實施方式】[0040]以下結(jié)合具體實施例，實驗材料取新生SD大鼠的海馬組織，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0041]實施例1
[0042]本發(fā)明的雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)WZ002,已于2014年I月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為雙歧桿菌(Bifidobacterium sp),保藏編號為 CGMCC N0.8809。
[0043]本發(fā)明的雙歧桿菌WZ002分離于一名浙江省健康青年人糞便中。
[0044]本發(fā)明的雙歧桿菌WZ002菌株具有下述微生物學特征:
[0045](I)菌落形態(tài):WZ002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質(zhì)地軟、邊緣整齊，直徑1-1.5_。
[0046](2)個體形態(tài):G+無芽孢桿菌，桿狀。
[0047](3)生理生化特征:D_核糖(+) ;L_阿拉伯糖(+);乳糖(+);纖維二糖㈠；松三糖(+);棉籽糖(+);山梨醇(-);淀粉(-);葡萄糖酸鈉(-);木糖(+);甘露糖(-);果糖(+);半乳糖(+);蔗糖(+);麥芽糖(+);海藻糖(-);密二糖(+);甘露醇(+);菊糖(-);水楊素(-);F6PPK酶⑴；對氧的反應(yīng)(在好氣固體培養(yǎng)基上不生長)；硝酸鹽還原㈠；觸酶㈠；靛基質(zhì)反應(yīng)(_)。
[0048]厭氧下生長良好，有氧環(huán)境中不生長。最適生長溫度37_41°C ;最低生長溫度25-28 0C ；
[0049]最高43-450C ;生長最適 ρΗ6.5-7.0 ;在 ρΗ4.5-5.0 或 8.0-8.5 不生長。
[0050]所述雙歧桿菌(Bifidobacteriumsp.)WZ002, CGMCC N0.8809 應(yīng)用于海馬神經(jīng)元的細胞種植液中。
[0051]我們實驗過程中意外發(fā)現(xiàn):雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)WZ002菌株的活性發(fā)酵濾液既能提供營養(yǎng)成分，又可促進神經(jīng)元生長，獲取神經(jīng)元的數(shù)量可以滿足實驗的需要。
[0052]實施例2
[0053]試劑購買:
[0054]DMEM/F12神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基和B27購于Gibco公司；多聚賴氨酸、胎牛血清(FBS)、海藻糖和L-谷氨酰胺購于美國Sigma公司；青鏈霉素混合液(雙抗)，購于美國HyClone公司。
[0055]試劑的配置:
[0056](1)所述的D-Hank ' s液，經(jīng)過如下步驟得到:NaC18.0g, KC10.4g,Na2HPO4.12H200.12g，KH2PO40.06g, NaHCO30.35g ;依次將各成分溶解于約 500mL 三蒸水中混勻，加三蒸水定容至1000mL,調(diào)整pH值至7.2~7.4，分裝，高壓滅菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0057](2)所述的漂洗液，經(jīng)過如下步驟得到:2g海藻糖、3g葡萄糖和IOmL雙抗溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻,加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0058](3)所述的消化液，經(jīng)過如下步驟得到:1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻，加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.22 μ m濾膜過濾除菌,0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌,分裝,4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0059](4)所述的活性發(fā)酵濾液，經(jīng)過如下步驟得到:
[0060]①雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.) WZ002,該菌株已于2014年I月22日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8809 ；
[0061]②雙歧桿菌WZ002采用改良MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為:以重量計，取蛋白胨IOg,牛肉膏IOg,酵母膏5g，葡萄糖20g,乙酸鈉5g，K2HP042g, MgSO4.7Η200.5g，MnSO4.4Η200.2g，低聚果糖3g，檸檬酸二銨2g，吐溫_801mL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6.5，115°C高壓滅菌15-20分鐘。
[0062]③將雙歧桿菌WZ002接種于冷卻至40±2°C的步驟②改良MRS培養(yǎng)基中，菌種接種量為0.2~0.5%，35+2°C厭氧培養(yǎng)24小時，用分光光度計測定上述培養(yǎng)液A58tol值為1.2時，將上述培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)數(shù)5000~8500rpm下離心10分鐘后，取上清液，0.22 μ m濾膜過濾除菌，即得到活性發(fā)酵液濾液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0063](5)所述的多聚賴氨酸，經(jīng)過如下步驟得到:IOmg多聚賴氨酸溶于IOmL三蒸水中，混勻，加三蒸水定容至IOOmL, 0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌,分裝,冰凍備用。
[0064](6)所述的細胞種植液，經(jīng)過如下步驟得到:DMEM/F12培養(yǎng)基加入胎牛血清、活性發(fā)酵濾液和雙抗，使胎牛血清終濃度為10%、活性發(fā)酵濾液終濃度為0.2%，雙抗終濃度為I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0065](J)所述的細胞維持液,經(jīng)過如下步驟得到:Neurobasal培養(yǎng)基加入B27和谷氨酰胺，使B27終濃度為2 %，谷氨酰胺終濃度I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0066](8)所述的雙抗,為青霉素-鏈霉素溶液(100 X),青霉素含量為10000U/mL,鏈霉素含量為10mg/mL。1%雙抗:青霉素含量為100U/mL,鏈霉素含量為0.lmg/mL。[0067]實施例3
[0068]以SD大鼠海馬神經(jīng)元的分離、原代培養(yǎng)方法包括以下步驟:
[0069]以實施例1和實施例2所準備的試劑和配置試劑。
[0070](I)漂洗:取離體哺乳動物的海馬組織，置冰浴的漂洗液中，去除紅細胞、被膜及
結(jié)
[0071 ] 締組織，用漂洗液沖洗2~5次；
[0072](2)消化:將步驟I漂洗后的海馬組織剪成直徑Imm3小塊，用5倍組織體積的消化液37°C作用5~10分鐘，組織成粥糜狀，用細胞種植液終止消化，輕輕吹打至組織塊10次以分散細胞。
[0073](3)制備細胞懸液:收集步驟2消化后初次細胞懸液，經(jīng)200目細胞篩過濾后，800~1000rpm4°C離心5~10分鐘，棄去上清液，加入細胞種植液，重懸細胞，制成5 X IO5~10 X IO5個/mL的單細胞懸液；
[0074](4)接種、培養(yǎng):將步驟3細胞懸液種植于預(yù)先鋪好多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，種植后24~72小時換成細胞維持液，之后每隔兩天用細胞維持液換液，每次更換的量為原體積的1/2。
[0075](5)鏡檢判定:神經(jīng)細胞種植后12小時后，倒置顯微鏡觀察，顯示:大部分細胞貼壁，形態(tài)呈圓形，其中少數(shù)神經(jīng)細胞外觀為長梭型，并開始伸出I~2個突起。第2天更換細胞維持液，培養(yǎng)24小時后，細胞形態(tài)多樣，如梭形、三角形、椎體形或不規(guī)則形，伸出突起的神經(jīng)細胞逐漸增多長短不一。培養(yǎng)第72小時，神經(jīng)元胞體增大，飽滿；3天后神經(jīng)元形狀已很典型:胞體飽滿，多呈梭形、錐形，少數(shù)呈多邊形，胞漿豐富，核大，核仁隱約可見，突起明顯增長，背景中仍然可見極少數(shù)扁平狀多邊形的神經(jīng)膠質(zhì)細胞鋪墊。
[0076]在培養(yǎng)第3~5天，進行顯微鏡鏡檢，培養(yǎng)細胞出現(xiàn)體積變大、且大部分細胞出現(xiàn)典型的神經(jīng)元形態(tài)，沒有雜細胞增殖，則說明培養(yǎng)成功。
[0077]本發(fā)明方法建立的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)細胞可存活5~9天，能夠滿足開展神經(jīng)元細胞功能研究的需要。
[0078](6)細胞純化
[0079]如果觀測到有雜細胞存在，則進行細胞純化處理。
[0080]如果細胞培養(yǎng)48~72小時，觀察到有雜細胞存在，每孔加入阿糖胞苷(濃度為2~10 μ g/mL) lmL，再加入與阿糖胞苷溶液等體積的步驟(3)配制的細胞種植液，使阿糖胞苷終濃度為I~5μ g/mL，24~48小時后，用步驟(4)配制的細胞維持液完全換液。
[0081]實施例4
[0082]1.細胞活力試驗
[0083]表1培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的細胞活力
[0084]
【權(quán)利要求】
1.雙歧桿菌(Bifidobacteriumsp.)WZ002,該菌株已于2014年I月22日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8809 ；
2.活性發(fā)酵濾液，經(jīng)過如下步驟得到: ①雙歧桿菌WZ002采用改良MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為:以重量計，取蛋白胨10g，牛肉膏 10g，酵母膏 5g，葡萄糖 20g,乙酸鈉 5g，K2HP042g，MgSO4.7Η200.5g，MnSO4.4Η200.2g，低聚果糖3g，檸檬酸二銨2g，吐溫-80ImL,蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6.5，115°C高壓滅菌15-20分鐘。 ②將雙歧桿菌WZ002接種于冷卻至40± 2°C的步驟②改良MRS培養(yǎng)基中，菌種接種量為.0.2~0.5%，35±2°C厭氧培養(yǎng)24小時，用分光光度計測定上述培養(yǎng)液A58tol值為1.2時，將上述培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)數(shù)5000~8500rpm下離心10分鐘后，取上清液，0.22 μ m濾膜過濾除菌，即得到活性發(fā)酵液濾液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C12N1/20GK103898007SQ201410066532
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】劉洛賢 申請人:劉洛賢