酶類降解棒曲霉素的方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶類降解棒曲霉素的方法：將經(jīng)過棒曲霉素誘導(dǎo)的Rhodosporidium?paludigenum?Fell&Tallman的菌體制備成粗酶制劑；將所述粗酶制劑放入被棒曲霉素污染的液態(tài)物中，降解溫度為38～42℃，降解時(shí)間0.5～1h，從而進(jìn)行棒曲霉素的降解；每100μL的粗酶液至多用于降解含有16μg棒曲霉素的被棒曲霉素污染的液態(tài)物。采用本發(fā)明的方法降解棒曲霉素，具有成本低、降解效果好、安全性好、無二次污染的優(yōu)勢?！緦＠f明】酶類降解棒曲霉素的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于酶制劑領(lǐng)域，具體地，涉及一種利用來自海洋酵母的粗酶制劑降解真菌毒素棒曲霉素的方法。【
背景技術(shù)：
】[0002]棒曲霉素(patulin,4-hydroxy-4H-furo[3,2_c]pyran_2(6H)-one)是一種水溶性的大環(huán)內(nèi)酯，存在于一些腐爛的水果(如蘋果、柑橘、石榴、梨等)及其制品中。棒曲霉素可由不少真菌產(chǎn)生，主要的包括曲霉屬真菌(Aspergillus),青霉屬真菌(Penicillium)以及擬青霉屬真菌(Paeci1myces),其中青霉屬真菌是自然界中棒曲霉素的主要生產(chǎn)者。[0003]棒曲霉素是一種對(duì)人畜有毒性的真菌毒素。目前報(bào)道中已知的急性毒性包括惡心、潰瘍；慢性毒性包括神經(jīng)毒性、免疫毒性、基因毒性、抑制免疫系統(tǒng)、致癌致畸致突變等。另外，在分子生物學(xué)層面，棒曲霉素可抑制DNA合成、蛋白質(zhì)的交聯(lián)、與谷胱甘肽發(fā)生反應(yīng)等。各國科學(xué)家對(duì)本國所產(chǎn)的蘋果制品、石榴汁等產(chǎn)品中的棒曲霉素進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在歐洲的大部分國家、韓國和日本，對(duì)食品中棒曲霉素的控制較好，而一些地方如西班牙、意大利、南非、印度和中國等，食品中棒曲霉素的檢出率較高，而且部分樣品超標(biāo)很嚴(yán)重。[0004]棒曲霉素是擴(kuò)展青霉產(chǎn)生的二次代謝產(chǎn)物。雖然現(xiàn)在人們已擁有很多果蔬保鮮齊U、殺菌劑以及保鮮手段(如低溫儲(chǔ)運(yùn)、氣調(diào)等)，但抑制真菌生長和降低真菌毒素的分泌兩者之間并不一定相關(guān)?，F(xiàn)行的不少用于果蔬保鮮的物質(zhì)或者手段(如低溫、氣調(diào)等)雖然能有效降低果蔬病害的發(fā)生，但它們對(duì)相應(yīng)的真菌毒素的控制并無效果，相反，有一些保鮮產(chǎn)品或者保鮮手段反而促使真菌產(chǎn)生更多的毒素。這是因?yàn)椴簧僬婢诓焕谏L的逆境中，會(huì)分泌更多的真菌毒素等二次代謝產(chǎn)物，來增強(qiáng)自身的競爭能力。實(shí)例來說，據(jù)報(bào)道，體外實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)擴(kuò)展青霉的培養(yǎng)基中加入克菌丹(Captan)、多菌靈(Carbendazim)、乙喃酹磺酸酯(Bupirimate)等殺菌劑時(shí),可以誘導(dǎo)擴(kuò)展青霉產(chǎn)生更多的棒曲霉素。另有研究表明，經(jīng)過生物制劑處理的有機(jī)蘋果中的棒曲霉素含量高于經(jīng)過傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)(采用殺菌劑)栽培的蘋果，對(duì)這個(gè)現(xiàn)象的解釋還未形成定論。課題組對(duì)氣調(diào)儲(chǔ)藏的蘋果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同的氣調(diào)處理的蘋果雖然在發(fā)病率上有顯著差異，但在棒曲霉素的含量上卻無差異，說明在此處理下，病斑的大小和棒曲霉素的含量并不相關(guān)。總而言之，保鮮劑和保鮮手段雖然能控制真菌的生長，但并不能減少真菌分泌棒曲霉素的量。[0005]由于棒曲霉素在酸性環(huán)境下穩(wěn)定，因此一旦存在(被棒曲霉素污染的水果及其制品均為酸性環(huán)境)便很難通過常規(guī)方法去除。目前有報(bào)道利用臭氧、放射性元素、熱處理、大孔樹脂吸附等物理化學(xué)方法，對(duì)棒曲霉素進(jìn)行去除。但這些方法有的成本較高，有的對(duì)環(huán)境或人體有負(fù)面影響，有的降解效果欠佳，因此并不很理想。相比較而言，生物方法更加安全、低成本。不少文獻(xiàn)報(bào)道表明，利用微生物對(duì)棒曲霉素進(jìn)行降解，不僅非常的有效，而且成本低廉，安全性高，其降解產(chǎn)物的毒性也比棒曲霉素本身要小。目前已報(bào)道的可降解棒曲霉素的微生物包括氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,需要在無氧環(huán)境下)、瘤胃中的微生物群、紅酵母(Rhodosporidiumkratochvilovae)以及畢赤酵母(Pichiamembranifaciens及Pichiacaribbica)等。盡管生物降解棒曲霉素具有諸多優(yōu)勢，但微生物在降解過程中會(huì)消耗溶液中的營養(yǎng)物質(zhì)，并且分泌二次代謝產(chǎn)物，若應(yīng)用到果汁中，則可能對(duì)果汁本身的品質(zhì)帶來負(fù)面影響。而相應(yīng)的酶制劑可彌補(bǔ)這些缺陷，而且更加高效。但目前沒有任何文獻(xiàn)涉及有關(guān)降解棒曲霉素的酶類報(bào)道。[0006]紅冬抱酵母(RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman)是一株從海洋中分離出來的安全的生防酵母。據(jù)研究，該酵母能適應(yīng)高滲透壓的環(huán)境，并且對(duì)小番茄、冬棗以及柑橘的釆后病害控制非常有效。[0007]該紅冬抱酵母(RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman)亦名該海洋酵母[0008](RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman)被保藏于英國國際真菌研究所國際農(nóng)業(yè)與生物中心基因資源保藏中心(InternationalMycologicalInstitute,CABIGeneticResourceCollection)，保藏地址:英國TW209TY薩里郡艾格鎮(zhèn)貝克漢姆路國際農(nóng)業(yè)與生物中心英國中心，保藏日期:2006.4.19，保藏編號(hào):頂1394084。[0009]上述海洋酵母細(xì)胞懸浮液已被用于生產(chǎn)生物保鮮劑，該專利的申請(qǐng)?zhí)枮?00610155209.0。[0010]上文中涉及的參考文獻(xiàn)如下:[0011]BurghardtRCjBarhoumiRjLewisEHjBaileyRH,PyleKAjClementBA，PhillipsT(1992).ToxicologyandAppliedPharmacology,112(2)，235-244(BurghardtRCjBarhoumiRjLewisEHjBaileyRH,PyleKA，ClementBA，PhillipsT(1992).棒曲霉素誘發(fā)的細(xì)胞毒性:一種重要的熒光研究。112(2)，235-244)；[0012]Cao，J.，H.Zhang，etal.(2013)."5EfficacyofPichiacaribbicaincontrollingbluemoldrotandpatulindegradationinapples."InternationalJournalofFoodMicrobiology162(2):167-173(Cao,J.,H.Zhang,etal.(2013).Pichiacaribbica酵母控制蘋果青霉害和降解棒曲霉素的效果。國際食品微生物。162(2):167-173)；[0013]CastoriajR.，ManninajL.，Duran-PatronjR.，MaffeijF.，Sobolev,A.P.，DeFelice,D.V.,Pinedo-RivillajC.,Wright,S.A.1.(2011).ConversionofthemycotoxinpatulintothelesstoxicdesoxypatulinicacidbythebiocontrolyeastRhodosporidiumkratochvilovaestrainLS11.JournalofAgriculturalandFoodChemistry59(21)，11571-11578(CastoriajR.，ManninajL.，Duran-PatronjR.，MaffeijF.，Sobolev,A.P.，DeFelice，D.V.，Pinedo-Rivilla，C.，Wright,S.A.1.(2011).酵母RhodosporidiumkratochvilovaeLSll降解棒曲霉素為低毒的desoxypatulinicacid。農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)。59(21)，11571-11578);[0014]CoelhojA.R.，CellijM.G.，OnojE.Y.S.，WosiackijG.，Hoffmann,F.L.,PagnoccajF.C.,HirookajE.Y.(2007).Penicilliumexpansumversusantagonistyeastsandpatulindegradationinvitr0.BrazilianArchivesofBiologyandTechnology50(4),725-733(CoelhojA.R.,CellijM.G.,OnojE.Y.S.，WosiackijG.，Hoffmann,F.L，PagnoccajF.C.，HirookajE.Y.(2007).擴(kuò)展青霉在體外對(duì)拮抗酵母及棒曲霉素的拮抗作用。巴西生物技術(shù)檔案。50(4)，725-733)[0015]CoorayR，KiesslingKHjLindahl-KiesslingK(1982).FoodandChemicalToxicology:anInternationalJournalPublishedfortheBritishIndustrialBiologicalResearchAssociation，20(6)，893-898(CoorayR，KiesslingKHjLindahl-KiesslingK(1982).棒曲霉素及棒曲霉素-半胱氨酸復(fù)合物對(duì)人類淋巴球細(xì)胞的DNA合成及姊妹單染色體互換的影響。食品及化學(xué)物質(zhì)毒理學(xué)。20(6)，893-898);[0016]G.Wichmann，0.Herbarth，1.Lehmann(2002).Themycotoxinscitrinin,gliotoxin,andpatulinaffectinterferon-yratherthaninterIeukin_4productiοninhumanbloodcells.EnvironmentalToxicology,17(3)，211-218(G.Wichmannj0.Herbarthj1.Lehmann(2002).真菌毒素橘霉素，木霉素及棒曲霉素對(duì)人類血細(xì)胞內(nèi)干擾素-Y合成的影響大于白介素-4的合成。環(huán)境毒理學(xué)。17(3)，211-218);[0017]GlaserjN.andH.Stopper(2012).^PatuliniMechanismofgenotoxicity."FoodandChemicalToxicology50(5):1796-1801(Glaser,N.andH.Stopper(2012).棒曲霉素:基因毒性的機(jī)理。食品和化學(xué)物質(zhì)毒理學(xué)。50(5):1796-1801);[0018]KWalker,BPWiesner(1944).Patulinandclavicin.Lancet,246:294(KWalker,BPWiesner(1944).棒曲霉素。柳葉刀。246:294)；[0019]LEscoulajJMore,CBaradat-AnnalesdeRecherchesVeterinaires(1977).ThetoxinsofByssochlamysniveawestling.-Acutetoxicityofpatulininadultratsandmice.AnnalesdeRecherchesVeterinairesj8(I)41-49(LEscoulajJMore,CBaradat-AnnaIesdeRecherchesVeterinaires(1977).Byssochlamysniveawestling的毒素:棒曲霉素對(duì)成人大鼠和小鼠的急性毒性。獸醫(yī)研究年刊。8(1):41-49);[0020]MoakejΜ.M.，Padilla-Zakourj0.1.，WorobojR.W.2005.Comprehensivereviewofpatulincontrolmethodsinfoods.ComprehensiveReviewsinFoodScienceandFoodSafety4，8-21(Moake，M.M.，Padilla-Zakour，0.1.，Worobo，R.W.(2005).控制食品中棒曲霉素的方法全面綜述。食品科學(xué)和食品安全的全面綜述。4:8-21);[0021]MorgavijD.P.，BoudrajH.，JouanyjJ.-P.，GravioujD.(2003).PreventionofPatulinToxicityonRumenMicrobialFermentationbySH-ContainingReducingAgents.JournalofAgriculturalandFoodChemistry51(23),6906-6910(Morgavi,D.P?，BoudrajH.，JouanyjJ.-P.，GravioujD.(2003).包含SH鍵的還原性化學(xué)物質(zhì)降低棒曲霉素對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的毒性影響。農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)。51(23):6906-6910);[0022]Moss,M.0.2008.Fungi,qualityandsafetyissuesinfreshfruitsandvegetables.JournalofAppliedMicrobiologyl04,1239-1243(Moss,M.0.(2008).新鮮果蔬的真菌，品質(zhì)和安全議題。應(yīng)用微生物學(xué)。104,1239-1243);[0023]Moss，M.0.，Long，Μ.T.(2002).FateofpatulininthepresenceoftheyeastSaccharomycescerevisiaeFoodAdditivesandContaminantsl9(4),387-399(Moss,M.0.，Long，Μ.T.(2002).酵母Saccharomycescerevisiae對(duì)棒曲霉素的影響。食品添加劑和污染物。19(4):387-399)；[0024]RalphFliege,ManfredMetzler(1999).Themycotoxinpatulininducesintra—andintermolecularproteincrosslinksinvitroinvolvingcysteine，lysine,andhistidinesidechains,anda-aminogroups.Chemico-BiologicalInteractions,123(2)，85-103(RalphFliege，ManfredMetzler(1999).真菌毒素棒曲霉素體外誘導(dǎo)分子內(nèi)及分子鍵蛋白質(zhì)交聯(lián)作用包括半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸側(cè)鏈以及α-氨基的基團(tuán)。化學(xué)-生物相互作用。123(2):85-103);[0025]Ricelli,A.,Baruzzi,F.,Solfrizzo,M.,Morea,M.,Fanizzi,F.P.(2007).BiotransformationofpatulinbyGluconobacteroxydans.AppliedandEnvironmentalMicrobiology73(3),785-792(Ricelli,A.,Baruzzi,F.,Solfrizzo,M.,Morea,M.,Fanizzi,F.P.(2007).Gluconobacteroxydans對(duì)棒曲霉素的生物轉(zhuǎn)化。應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)。73(3):785-792)；[0026]RollR,MatthiaschkG,KorteA(1990).Embryotoxicityandmutagenicityofmycotoxins.JEnvironPatholToxicolOncol,10(1-2)，1-7(RollR,MatthiaschkG,KorteA(1990).真菌毒素的胚胎毒性和誘導(dǎo)突變性。環(huán)境病理學(xué)、毒理學(xué)及腫瘤學(xué)。10(1-2):1-7)；[0027]Wang,Y.F.,T.Yu,etal.(2010)."BiocontrolofpostharvestgraymoldofcherrytomatoeswiththemarineyeastRhodosporidiumpaludigenum."BiologicalControl53(2):178-182(Wang,Y.F.,T.Yu,etal.(2010).海洋酵母Rhodosporidiumpaludigenum對(duì)櫻桃番茄采后灰霉病的控制。生物防治53(2):178-182)；[0028]Zhu,R.,L.Lu,etal.(2013)."PostharvestControlofGreenMoldDecayofCitrusFruitUsingCombinedTreatmentwithSodiumBicarbonateandRhodosporidiumpaludigenum."FoodandBioprocessTechnology6(10):2925-2930(Zhu,R.,L.Lu,etal.(2013).碳酸氫鈉及Rhodosporidiumpaludigenum對(duì)米后柑橘的綠霉病害控制。食品和生物工藝技術(shù)。6(10):2925-2930)。【
發(fā)明內(nèi)容】[0029]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低、降解效果好、安全性好、無二次污染的酶類降解棒曲霉素的方法。[0030]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種酶類降解棒曲霉素的方法:將經(jīng)過棒曲霉素誘導(dǎo)的RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman的菌體制備成粗酶制劑；[0031]將所述粗酶制劑放入被棒曲霉素污染的液態(tài)物中，降解溫度為38~42°C，降解時(shí)間0.5~lh，從而進(jìn)行棒曲霉素的降解；[0032]每100μL的粗酶液至多用于降解含有16μg棒曲霉素的被棒曲霉素污染的液態(tài)物。[0033]備注說明:一般而言，被棒曲霉素污染的液態(tài)物中棒曲霉素的濃度≤40ppm。[0034]作為本發(fā)明的利用紅冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法的改進(jìn):[0035]所述被棒曲霉素污染的液態(tài)物的pH≤7。[0036]作為本發(fā)明的酶類降解棒曲霉素的方法的進(jìn)一步改進(jìn)，粗酶制劑的制備方法為:[0037]在NYDB培養(yǎng)液中添加棒曲霉素，直至棒曲霉素的濃度為Ippm;得含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液；[0038]將RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman的菌落接種到上述含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液中，于24?26°C(較佳為25°C)、180?220rpm(較佳為200rpm)的搖床中培養(yǎng)35?37小時(shí)(較佳為36小時(shí))；培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)離心、棄去上清后用無菌水洗滌，得菌體；[0039]按照每Ig菌體配用9?Ilml的ρΗ7.0的Britton-Robinson緩沖溶液的用量比，將菌體研磨破碎后加入pH為7.0的Britton-Robinson緩沖溶液，于3?5°C、10000?14000g的條件下離心8?12min(較佳為于4°C、12000g的條件下離心IOmin),吸取上清液(為澄清的上清液)作為粗酶制劑(于4°C條件下放置，待用)。[0040]備注說明:上述菌體研磨時(shí)，需要加入石英砂并在液氮條件下快速研磨破碎菌體，此屬于常規(guī)技術(shù)。[0041]作為本發(fā)明的酶類降解棒曲霉素的方法進(jìn)一步改進(jìn)，粗酶制劑的制備方法為:[0042]在NYDB培養(yǎng)液中添加棒曲霉素，直至棒曲霉素的濃度為Ippm;得含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液；[0043]將RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman的菌落接種到上述含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液中，于24?26°C(較佳為25°C)、180?220rpm(較佳為200rpm)的搖床中培養(yǎng)35?37小時(shí)(較佳為36小時(shí))；培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)離心、棄去上清后用無菌水洗滌，得菌體；[0044]將所得的菌體于-15?-25°C放置11?13小時(shí)(較佳為_20°C放置12小時(shí))，然后再放入冷凍干燥機(jī)中，于-35?_45°C干燥46?50小時(shí)(較佳為_40°C干燥48小時(shí))，得菌體凍干粉；[0045]按照每Ig菌體凍干粉配用14?16ml的ρΗ7.0的Britton-Robinson緩沖溶液的用量比，將菌體凍干粉研磨破碎后加入ρΗ7.0的Britton-Robinson緩沖溶液中，于3?5°C>10000?14000g的條件下離心8?12min(較佳為于4°C、12000g的條件下離心IOmin),吸取上清液(為澄清的上清液)作為粗酶制劑(于4°C條件下放置，待用)。[0046]作為本發(fā)明的酶類降解棒曲霉素的方法的進(jìn)一步改進(jìn):降解溫度為40°C。[0047]在本發(fā)明中，NYDB為常規(guī)技術(shù):IOg葡萄糖+Sg牛肉浸膏+5g酵母浸出粉+IL蒸餾水。[0048]pH7.0的Britton-Robinson緩沖溶液也屬于常規(guī)技術(shù):磷酸、乙酸、硼酸三酸混合液，濃度均為0.04mol/L,通過加入0.2mol/LNa0H溶液來調(diào)整pH值。[0049]在本發(fā)明中，[0050]將棒曲霉素加入到用于培養(yǎng)紅冬抱酵母RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman的NYDB培養(yǎng)液中，是因?yàn)榘羟顾啬苷T導(dǎo)紅冬孢酵母產(chǎn)生更大量的分解棒曲霉素的相關(guān)酶類。將菌體制成凍干粉，是因?yàn)閮龈煞塾欣诒３置傅幕钚?，易于保存，且方便研磨。[0051]本發(fā)明是獲取菌株RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman的胞內(nèi)粗酶組分，將其放入到被棒曲霉素污染的液態(tài)物(pH<7)中，從而達(dá)到利用酶制劑降解棒曲霉素的效果。[0052]本發(fā)明所得的RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman菌體凍干粉，可放置于-20°C?_80°C中干燥保存，保存期為一年以上。本發(fā)明所得的來自RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman的粗酶制劑可于4°C下保存一個(gè)星期,于_20°C下保存一個(gè)月。[0053]研究表明來自RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman菌體的粗酶制劑能有效降解棒曲霉素。隨著人們對(duì)食品安全的高度重視，安全、高效的降解棒曲霉素的粗酶制劑有著廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景和研究價(jià)值。[0054]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):[0055]1.降解效率高:[0056]本發(fā)明通過獲取RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman菌體的胞內(nèi)粗酶組分制成粗酶制劑，該粗酶制劑能在極短時(shí)間高效降解棒曲霉素，降解效率高；同時(shí)，棒曲霉素被降解后的產(chǎn)物毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于棒曲霉素本身的毒性，不造成二次污染。[0057]2.成本低:[0058]RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman是從海洋分離得到的天然、安全酵母菌株，存在于大自然中，來源廣泛，易于獲取。RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman對(duì)生長環(huán)境要求不苛刻，且耐高滲透壓，易于培養(yǎng)，能大量繁殖，因此成本低廉MTvο[0059]3.操作簡單，實(shí)際應(yīng)用方便:[0060]本發(fā)明獲得的粗酶制劑使用方便，只需將其加入被棒曲霉素污染的液態(tài)物中，便可以通過酶解作用降解棒曲霉素。【專利附圖】【附圖說明】[0061]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。[0062]圖1為本發(fā)明的來自RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman的粗酶制劑在Britton-Robinson緩沖溶液(ρΗ=7.0)中的降解棒曲霉素的效果圖。[0063]圖2為本發(fā)明的來自RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman粗酶制劑在石榴汁中的降解棒曲霉素的效果圖。[0064]圖3為本發(fā)明的來自RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman粗酶制劑降解棒曲霉素后降解產(chǎn)物對(duì)人體肝臟細(xì)胞的毒性圖。[0065]圖4為棒曲霉素對(duì)人體肝臟細(xì)胞的毒性圖，作為和圖3的對(duì)比?！揪唧w實(shí)施方式】[0066]下面通過實(shí)施例對(duì)本實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步詳細(xì)說明。[0067]實(shí)施例1、粗酶制劑降解Britton-Robinson緩沖溶液(ρΗ=7.0)中的棒曲霉素,依次進(jìn)行如下步驟:[0068]I)、粗酶制劑的制備:[0069]先配制含有棒曲霉素的無菌NYDB:[0070]在IL的無菌NYDB培養(yǎng)液中加入棒曲霉素使其最終濃度為Ippm;得含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液；[0071]挑取RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman的單菌落接種到50mL上述含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液中，于25°C、200rpm的搖床中培養(yǎng)36小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，先3000rpm離心lOmin、棄去上清、用無菌水(約30ml)洗漆沉淀,此過程重復(fù)兩次(即，再重復(fù)一次上述的離心、棄去上清、用無菌水洗漆沉淀)，最后再次離心(3000rpm離心IOmin)后棄去上清，收獲菌體。將所得的菌體放于_20°C冰箱中過夜(約12小時(shí))，再馬上放入冷凍干燥機(jī)(_40°C)中冷凍干燥48小時(shí)，獲得菌體凍干粉。[0072]往研缽中加入Ig菌體凍干粉，快速研磨破碎菌體后，再溶于15mLpH7.0的Britton-Robinson緩沖溶液(配方為磷酸、乙酸、硼酸三酸混合液,濃度均為0.04mol/L,再逐滴加入0.2mol/LNaOH溶液，調(diào)整pH值至7.0)。在4°CU2000g的條件下離心IOmin,吸取澄清的上清液制成粗酶制劑，于4°C條件下放置，待用。[0073]2)、棒曲霉素的降解:[0074]將5mg的棒曲霉素標(biāo)品溶解于20mL乙酸乙酯中，吸取0.6mL于氮吹儀中吹干，再溶解于0.6m的Britton-Robinson緩沖溶液(pH=7.0)中，制成棒曲霉素溶液。向2mL的離心管中加入380μLBritton-Robinson緩沖溶液(ρΗ=7.0)、20μL棒曲霉素溶液以及100μL粗酶制劑，混合均勻，即，共含有5μg的棒曲霉素(棒曲霉素的最終濃度為lOppm)。以不加粗酶制劑的處理為空白對(duì)照。每個(gè)處理及空白對(duì)照各設(shè)三個(gè)平行。放置于40°C恒溫箱反應(yīng)；檢測的時(shí)間點(diǎn)分別為5分鐘、10分鐘、30分鐘、I小時(shí)。[0075]對(duì)反應(yīng)所得物中棒曲霉素的含量按照如下方法進(jìn)行檢測:[0076]I)樣品處理:向每管中加入ImL乙酸乙酯，于250rpm小搖床中振蕩10分鐘，再于3000rpm的離心機(jī)中離心3分鐘。吸取850μL上清液，氮?dú)獯蹈桑苡?00μL去離子水中(用乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.0)，用2.5μm的濾膜過濾，進(jìn)行HPLC檢測。[0077]2)HPLC檢測:檢測方法如下:[0078]流動(dòng)相為10%乙腈+90%水(為體積％),流速為0.2mL/min,檢測波長為276nm,柱溫35°C，進(jìn)樣量10μL。所選取的柱子為Synergi2.5μ,Fusion-RP，100X2mm。實(shí)驗(yàn)中棒曲霉素的出峰時(shí)間為3.18min。[0079]結(jié)果如圖1所示，在Ih的降解過程中，處理組中棒曲霉素的含量隨著時(shí)間不斷下降。在短短的5分鐘內(nèi)，有22.5%的棒曲霉素被降解(即，經(jīng)檢測棒曲霉素含量僅為3.875yg)；10分鐘后，有48.3%的棒曲霉素被降解(即，經(jīng)檢測棒曲霉素含量僅為2.585μg);到了30分鐘，有90%的棒曲霉素被降解(即，經(jīng)檢測棒曲霉素含量僅為0.5μg)；Ih時(shí)，已經(jīng)檢測不到棒曲霉素的存在。[0080]通過上述實(shí)驗(yàn)，我們可以得到以下結(jié)論:本發(fā)明的來自RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman菌體的胞內(nèi)粗酶制劑能夠高效的降解棒曲霉素。[0081]實(shí)施例2、粗酶制劑降解石榴汁(pH為4.6)中的棒曲霉素，依次進(jìn)行如下步驟:[0082]I)、粗酶制劑的制備:[0083]同實(shí)施例1中的粗酶制劑的制備。[0084]2)、石榴汁中棒曲霉素的降解:[0085]向50mL的離心管中加入20mL市購石榴汁，已事先測得石榴汁內(nèi)含有95μg/L的棒曲霉素(即管內(nèi)共有Uyg棒曲霉素)。加入100μL粗酶制劑，混合均勻。放置于40°C恒溫箱反應(yīng)；檢測的時(shí)間點(diǎn)分別為5分鐘、10分鐘、30分鐘、I小時(shí)；從而實(shí)現(xiàn)對(duì)棒曲霉素進(jìn)行降解。[0086]其余內(nèi)容等同于實(shí)施例1。[0087]結(jié)果如圖2所示。在Ih的降解過程中，處理組中棒曲霉素的含量隨著時(shí)間不斷下降。在短短的5分鐘內(nèi)，有22.5%的棒曲霉素被降解(即，經(jīng)檢測棒曲霉素含量僅為1.4725μg)；10分鐘后，有67.33%的棒曲霉素被降解(即，經(jīng)檢測棒曲霉素含量僅為0.62μg);到了30分鐘，已經(jīng)檢測不到棒曲霉素的存在。[0088]通過上述實(shí)驗(yàn)，我們可以得到以下結(jié)論:本發(fā)明的來自RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman菌體的胞內(nèi)粗酶制劑能夠有效應(yīng)用于被棒曲霉素污染的石槽汁中，從而可進(jìn)行實(shí)際推廣應(yīng)用。[0089]實(shí)施例3、相對(duì)于實(shí)施例1而言，作如下更改:[0090]向2mL的離心管中加入336μLBritton-Robinson緩沖溶液(ρΗ=7.0)、64μL棒曲霉素溶液以及100μL粗酶制劑，混合均勻，即，共含有16μg的棒曲霉素。以不加粗酶制劑的處理為空白對(duì)照。每個(gè)處理及空白對(duì)照各設(shè)三個(gè)平行。放置于40°C恒溫箱反應(yīng)；檢測的時(shí)間點(diǎn)分別為5分鐘、10分鐘、30分鐘、I小時(shí)。[0091]結(jié)果為:在Ih的降解過程中，處理組中棒曲霉素的含量隨著時(shí)間不斷下降。在短短的5分鐘內(nèi)，有25%的棒曲霉素被降解；10分鐘后，有55%的棒曲霉素被降解；到了30分鐘，有95%的棒曲霉素被降解；lh時(shí)，已經(jīng)檢測不到棒曲霉素的存在。[0092]對(duì)比例1、相對(duì)于將實(shí)施例1作如下改變:[0093]將粗酶制劑的制備方法中所用的含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液改成“常規(guī)的NYDB培養(yǎng)液”，即，棒曲霉素的添加量為O;[0094]檢測時(shí)間點(diǎn)為I小時(shí)。[0095]其余內(nèi)容等同于實(shí)施例1。[0096]結(jié)果為:降解I小時(shí)后，僅有73%的棒曲霉素被降解。[0097]對(duì)比例2、相對(duì)于將實(shí)施例1作如下改變:[0098]將粗酶制劑的制備方法中所用的含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液中棒曲霉素的濃度由Ippm改成2ppm；[0099]檢測時(shí)間點(diǎn)為0.5小時(shí)、I小時(shí)。[0100]結(jié)果為:[0101]降解0.5小時(shí)后，僅有75%的棒曲霉素被降解。[0102]降解I小時(shí)后，僅有92%的棒曲霉素被降解。[0103]對(duì)比例3、將實(shí)施例1中的降解溫度由40°C下降為30V，檢測時(shí)間為5分鐘；其余等同于實(shí)施例1。[0104]結(jié)果為:[0105]降解5分鐘后，僅有12.28%的棒曲霉素被降解。[0106]對(duì)比例4、將實(shí)施例1中的降解溫度由40°C上升為50°C，檢測時(shí)間為5分鐘；其余等同于實(shí)施例1。[0107]結(jié)果為:[0108]降解5分鐘后,僅有18.1%的棒曲霉素被降解。[0109]安全性實(shí)驗(yàn):[0110]將棒曲霉素被降解后所得的產(chǎn)物進(jìn)行毒性評(píng)估，檢測方法如下:[0111]I)、棒曲霉素降解產(chǎn)物的獲取[0112]將700μL粗酶制劑加入裝有4.2mL醋酸銨(0.1mM)水溶液的50mL離心管里，并加入IOOyL的棒曲霉素(也用0.1mM的醋酸銨水溶液溶解)，使棒曲霉素的最終濃度為20ppm，共有10個(gè)重復(fù)。于40°C恒溫箱中反應(yīng)2h。每管加入15mL乙腈，低溫下靜置30分鐘，3000rpm離心，收獲上清，將蛋白質(zhì)沉淀?xiàng)壢ァＳ玫祪x將乙腈和醋酸銨水溶液的混合溶液吹干，再用DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液(10%胎牛血清)溶解，用無菌濾頭過濾(用HPLC檢測，確認(rèn)棒曲霉素已被完全降解)。在無菌條件下，配制棒曲霉素降解產(chǎn)物的溶液，使?jié)舛确謩e為50ppm,IOppm,lppm,0.5ppm。同時(shí),用相同的溶劑配制相同濃度梯度的棒曲霉素溶液。[0113]2)、棒曲霉素降解產(chǎn)物的毒性檢測[0114]將正常人體肝臟細(xì)胞(L02)接種到無菌96孔板上，接種密度為6000個(gè)細(xì)胞/孔，接種兩塊培養(yǎng)板。37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。吸取掉培養(yǎng)液，加入150μL棒曲霉素溶液或棒曲霉素降解產(chǎn)物的溶液，每個(gè)處理做5個(gè)平行。于37°C，5%C02培養(yǎng)條件下在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)。吸棄上清液，加入120μL預(yù)先配制好的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3_4小時(shí)。取出96孔培養(yǎng)板，以3000rmp轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清。每孔加入150μLDMSO,放置IOmin后用酶標(biāo)儀檢測在570nm下的吸光度值。[0115]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3和圖4所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，棒曲霉素對(duì)人體肝臟下細(xì)胞有顯著毒性，當(dāng)棒曲霉素的濃度高于Ippm時(shí)，能顯著抑制人體肝臟細(xì)胞的存活。相比較，棒曲霉素降解產(chǎn)物的毒性要比棒曲霉素低很多。[0116]通過上述實(shí)驗(yàn)，我們可以得到以下結(jié)論:采用本發(fā)明來自RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman的粗酶制劑降解棒曲霉素,其降解產(chǎn)物的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于棒曲霉素。[0117]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍?！緳?quán)利要求】1.酶類降解棒曲霉素的方法，其特征是:將經(jīng)過棒曲霉素誘導(dǎo)的RhodosporidiumpaludigenumFell&TalIman的菌體制備成粗酶制劑；將所述粗酶制劑放入被棒曲霉素污染的液態(tài)物中，降解溫度為38?42°C，降解時(shí)間0.5?lh，從而進(jìn)行棒曲霉素的降解；每100μL的粗酶液至多用于降解含有16μg棒曲霉素的被棒曲霉素污染的液態(tài)物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶類降解棒曲霉素的方法，其特征是:所述被棒曲霉素污染的液態(tài)物的pH<7。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶類降解棒曲霉素的方法，其特征是所述粗酶制劑的制備方法為:在NYDB培養(yǎng)液中添加棒曲霉素，直至棒曲霉素的濃度為Ippm;得含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液；將RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman的菌落接種到上述含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液中，于24?26°C、180?220rpm的搖床中培養(yǎng)35?37小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)離心、棄去上清后用無菌水洗滌，得菌體；按照每Ig菌體配用9?Ilml的pH7.0的Britton-Robinson緩沖溶液的用量比,將菌體研磨破碎后加入pH為7.0的Britton-Robinson緩沖溶液，于3?5°C、10000?14000g的條件下離心8?12min，吸取上清液作為粗酶制劑。4.如權(quán)利要求2所述的酶類降解棒曲霉素的方法，其特征是所述粗酶制劑的制備方法為:在NYDB培養(yǎng)液中添加棒曲霉素，直至棒曲霉素的濃度為Ippm;得含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液；將RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman的菌落接種到上述含有棒曲霉素的NYDB培養(yǎng)液中，于24?26°C、180?220rpm的搖床中培養(yǎng)35?37小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)離心、棄去上清后用無菌水洗滌，得菌體；將所得的菌體于-15?-25°C放置11?13小時(shí)，然后再放入冷凍干燥機(jī)中，于-35?_45°C干燥46?50小時(shí)，得菌體凍干粉；按照每Ig菌體凍干粉配用14?16ml的pH7.0的Britton-Robinson緩沖溶液的用量比，將菌體凍干粉研磨破碎后加入pH7.0的Britton-Robinson緩沖溶液中，于3?5°C、10000?14000g的條件下離心8?12min，吸取上清液作為粗酶制劑。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的酶類降解棒曲霉素的方法，其特征是:所述降解溫度為40。。。【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103859016SQ201410065286【公開日】2014年6月18日申請(qǐng)日期:2014年2月26日優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日【發(fā)明者】鄭曉冬,朱瑞瑜,余挺,吳濤,胡浩申請(qǐng)人:浙江大學(xué)