一種海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法
【專利摘要】本發(fā)明以海水養(yǎng)殖池塘沉積物為研究對象，首先優(yōu)化提取沉積物樣品DNA的方法；然后對PCR退火溫度、循環(huán)次數(shù)、引物添加量、模板添加量進(jìn)行優(yōu)化篩選，建立擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA?V3區(qū)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序；再從變性劑濃度梯度范圍、電泳條件、染色方法等方面優(yōu)化篩選了變性梯度凝膠電泳反應(yīng)條件，最終完整建立并優(yōu)化了池塘沉積物微生物群落PCR-DGGE檢測體系，有利于獲得養(yǎng)殖池塘優(yōu)勢微生物信息，為從海水池塘沉積物分離篩選有益功能微生物奠定了基礎(chǔ)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明適用于對池塘沉積物微生物群落分析，具成本低廉、具可重復(fù)性、可直接快速分析的優(yōu)點(diǎn)，無需分離培養(yǎng)的過程，便可獲得原生環(huán)境微生物群落完整的相關(guān)信息。
【專利說明】一種海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物種群分子檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法
【背景技術(shù)】
[0002]底泥微生物是海水池塘生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動不可或缺的角色，直接影響?zhàn)B殖動物及底棲生物的生長與存活，從微生物群體基因組的角度研究微生物群落種類及功能多樣性已得到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。微生物傳統(tǒng)的研究方法是平板培養(yǎng)法，即選取合適的培養(yǎng)基對環(huán)境樣品微生物篩選培養(yǎng)，依據(jù)微生物的生理生化特征運(yùn)用顯微鏡觀察，研究生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)。但此方法僅能從固體培養(yǎng)基上分離微生物，而底泥微生物中僅有1%的可培養(yǎng)細(xì)菌，無法全面反映微生物的信息。因此，需要提供一種能夠有效的進(jìn)行海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明針對現(xiàn)有傳統(tǒng)平板培養(yǎng)技術(shù)存在的問題及沉積物樣品富含腐殖酸等特性，利用構(gòu)建的細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)通用引物，建立了海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的技術(shù)分析體系。本發(fā)明適用于對池塘沉積物微生物群落分析，可應(yīng)用于不同池塘和不同養(yǎng)殖周期的樣品進(jìn)行了檢測，并利用Quantity One軟件將電泳圖譜轉(zhuǎn)化成二維數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具成本低廉、具可重復(fù)性、直接快速分析等優(yōu)點(diǎn)，無需分離培養(yǎng)過程，便可獲得原生環(huán)境微生物群落的相關(guān)信息。
[0004]海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法，包括如下步驟:
[0005]I)從池塘沉積物樣品中提取基因組DNA ;提取的DNA稀釋后于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0006]2)建立擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，其中擴(kuò)增所用的引物為 Fl:5' -CC TAC GGG AGG CAG CAG-3' (SEQ ID N0:1),R1:5/ -ATT ACC GCG GCT GCTGG-3/ (SEQ ID N0:2)；
[0007]3)將步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣液混合進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染檢測；
[0008]4)利用Quantity One軟件對圖譜進(jìn)行分析；
[0009]5)回收銀染獲得的條帶，
[0010]6)對回收條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行T-克隆測序，將測序結(jié)果與GenBank比對得到海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)。
[0011]其中步驟(1)用CTAB法提取的池塘沉積物樣品基因組DNA，
[0012]步驟2)反應(yīng)體系一種組成為如下:總體積50 μ 1，包括DNA模板lOOng，10 X buffer5 μ I，dNTPs4 μ I，rTaq DNA 聚合酶 0.5 μ I，加 ddH20 至 50 μ I;
[0013]PCR反應(yīng)程序?yàn)榻德銹CR，95°C預(yù)變性5min，前10個(gè)循環(huán)94°C變性30s，58°C退火30s ;每個(gè)循環(huán)降低0.5°C;72°C延伸30s ;后25個(gè)循環(huán)94°C變性30s，53。。退火30s，72。。延伸 30sec ;最后 72°C延伸 IOmin0
[0014]其中步驟(3)中，進(jìn)行變性梯度凝膠電泳的條件如下:丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑濃度梯度是45%-55%，電壓60v，60°C電泳IOh
[0015]本發(fā)明以海水養(yǎng)殖池塘沉積物為研究對象，首先優(yōu)化提取沉積物樣品DNA的方法；然后對PCR退火溫度、循環(huán)次數(shù)、引物添加量、模板添加量進(jìn)行優(yōu)化篩選，建立擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序；再從變性劑濃度梯度范圍、電泳條件、染色方法等方面優(yōu)化篩選了變性梯度凝膠電泳反應(yīng)條件，最終完整建立并優(yōu)化了池塘沉積物微生物群落PCR-DGGE檢測體系，有利于獲得養(yǎng)殖池塘優(yōu)勢微生物信息，為從海水池塘沉積物分離篩選有益功能微生物奠定了基礎(chǔ)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明適用于對池塘沉積物微生物群落分析，具成本低廉、具可重復(fù)性、可直接快速分析的優(yōu)點(diǎn)，無需分離培養(yǎng)的過程，便可獲得原生環(huán)境微生物群落完整的相關(guān)信息。本發(fā)明可同時(shí)分析不同時(shí)期采集的樣品，檢測微生物群落在不同時(shí)空上的動態(tài)變化規(guī)律。【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1:養(yǎng)殖池塘底泥DGGE指紋圖譜示意圖。
[0017]圖2:養(yǎng)殖池塘底泥DGGE圖譜UPGMA聚類分析。
【具體實(shí)施方式】
[0018]通過實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)方法:首先利用CTAB法提取池塘沉積物樣品基因組DNA，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)，變性梯度凝膠電泳分離DNA片段，銀染后顯著條帶切膠回收重PCR，產(chǎn)物T-克隆測序，將測序結(jié)果到GenBank比對可獲得養(yǎng)殖池塘沉積物優(yōu)勢微生物的信息。
[0019]實(shí)施例1基因組DNA提取
[0020]稱取500mg海水養(yǎng)殖池塘的樣品，加入800 μ I CTAB抽提緩沖液，漩渦混勻后加入30 μ I蛋白酶K (20mg/mL)，37 V溫浴30min，每15min顛倒混勻；加入45 μ 120%的SDS65O溫浴2h,每15min顛倒混勻；6000rpm離心IOmin,收集上清液,沉淀中加入裂解緩沖液450 μ 1、SDS50 μ 1，混勻后65°C溫浴30min，6000rpm離心IOmin,收集上清液；集合上清液到一個(gè)離心管內(nèi)，加入等體積酹-氯仿-異戍醇(25:24:1)抽提IOmin, 12000rpm離心lOmin，取上清液到新EP管中；收集上一步驟所得的上清，加入等體積氯仿-異戊醇(24:1)，抽提10min，20000rpm離心IOmin ;將上述抽提收集到的上清液置_20°C冰箱過夜沉淀，12000rpm離心IOmin,收集沉淀,70%乙醇洗漆，12000rpm離心IOmin,乙醇揮發(fā)后加無菌水20 μ I，溶解DNA，保存于-20°C。
[0021]實(shí)施例2PCR-DGGE分析
[0022]設(shè)計(jì)16SrDNA引物，此引物為擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)的引物對，并在正向引物的5’ 端加上 GC 夾；引物是:F1:5’ -CC TAC GGG AGG CAG CAG-3’，Rl:5’ -ATT ACC GCG GCTGCT GG-3，。
[0023]擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA V3 區(qū) PCR 反應(yīng)體系包括:DNA 模板 lOOng，IOXbuffer (withMgC12) 5μ I, dNTPs4y I, rTaq DNA 聚合酶 0.5 μ 1，加 ddH20 至 50 μ I。反應(yīng)程序?yàn)榻德銹CR:95°C預(yù)變性5min,前10個(gè)循環(huán)94°C變性30s, 58°C，退火30s (每個(gè)循環(huán)降低0.5°C )，72°C延伸30s;后25個(gè)循環(huán)94 °C變性30s，53 °C退火30s，72 °C延伸30s，最后72°C延伸IOmin0擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣液以1:1的比例混合，變性梯度凝膠電泳相關(guān)參數(shù)是:丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑濃度梯度是45%-55%，電壓60v，60°C電泳10h，銀染方法:①固定:10%的乙醇及0.5%的冰醋30min;②漂洗:ddH20漂洗三次，每次2min ;③染色:染色15_20min，銀染液組成:1.5gAgN03+2.25mL37%甲醛+ILddH2O ;④顯影:顯影l(fā)_2min，顯影液組成:
7.5gNa0H+2.25mL37% 甲醛 +ILddH2O ;⑤固定:ILddH2O 固定 5min。
[0024]實(shí)施例3利用軟件對圖譜進(jìn)行分析
[0025]DGGE圖譜導(dǎo)入Quantity One分析軟件中，采用軌跡定量法將凝膠電泳圖譜轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息，定量分析結(jié)果可以輸出系統(tǒng)進(jìn)化樹、泳道比對結(jié)果，進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。池塘底泥DGGE指紋圖譜如圖1，能真實(shí)反映出污水中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，其中DNA條帶能夠回收并進(jìn)行克隆測序，從而得到DNA條帶所代表的物種信息。，可得知DGGE電泳圖譜條帶數(shù)量豐富，不同時(shí)期樣品的條帶數(shù)量和亮度均有差異，以I~9表示采樣的九個(gè)時(shí)期。并作出DGGE圖譜的形似性做UPGMA聚類分析樹，如圖2可以得到在同一養(yǎng)殖池塘不同養(yǎng)殖時(shí)期的菌群之間的相互關(guān)系。
[0026]實(shí)施例4細(xì)菌群落序列分析
[0027]切膠回收方法:用滅菌刀片切下顯著條帶勿搗碎置于1.5mL無菌離心管內(nèi)，加入50 μ I無菌水置4°C冰箱過夜；上清液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物及擴(kuò)增程序同實(shí)施例
2。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，對篩選到的白色菌落進(jìn)行陽性克隆驗(yàn)證，將陽性克隆轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜后送測序，測序結(jié)果到GenBank比對可獲得對應(yīng)微生物的種屬信息。
[0028]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照圖1，對圖1中的優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收測序。其中測序結(jié)果如下。
[0029]表1:目標(biāo)序列的比對結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法，包括如下步驟: 1)從池塘沉積物樣品中提取基因組DNA;提取的DNA稀釋后于_20 C保存?zhèn)溆茫? 2)建立擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNAV3區(qū)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序， 3)將步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣液混合進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染檢測； 4)利用QuantityOne軟件對圖譜進(jìn)行分析； 5)回收銀染獲得的條帶， 6)對回收條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行T-克隆測序，將測序結(jié)果與GenBank比對得到海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟I)是用CTAB法提取的池塘沉積物樣品基因組DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟2)中擴(kuò)增所用的引物的序列為 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2。
4.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟2)中反應(yīng)體系組成為如下:總體積 50 μ I，包括 DNA 模板 IOOng, 10 X buffer5 μ I，dNTPs4 μ I，rTaq DNA 聚合酶 0.5 μ I，加 ddH20 至 50 μ I。
5.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟2)中PCR反應(yīng)程序?yàn)榻德溱??，951:預(yù)變性51^11，前10個(gè)循環(huán)94°C變性30s，58°C退火30s ;每個(gè)循環(huán)降低0.5°C；72°C延伸30s ;后25個(gè)循環(huán)94°C變性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30sec ;最后72°C延伸IOmin0
6.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟3)中進(jìn)行變性梯度凝膠電泳的條件如下:丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑濃度梯度是45%-55%，電壓60v，60°C電泳10h。
【文檔編號】C12Q1/04GK103789437SQ201410050852
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月14日
【發(fā)明者】王 琦, 李健, 陳萍, 高天翔, 張秀梅 申請人:中國海洋大學(xué), 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所