一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法及其應(yīng)用，屬于酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過納米硅溶膠與聚乙二醇的協(xié)同添加顯著提高酶的熱穩(wěn)定性，大大提高了酶的工業(yè)化應(yīng)用價值，同時該發(fā)明操作簡單、成本低廉，具有較好的推廣潛力。
【專利說明】一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法及其應(yīng)用，屬于酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]在酶法合成過程中，酶的熱穩(wěn)定性是很關(guān)鍵的一個因素。酶的熱穩(wěn)定性高不僅可以延長酶的儲存時間、減少酶在運輸過程中酶活的損失，而且可以使酶在較高反應(yīng)溫度下延長酶的反應(yīng)時間，提高生產(chǎn)效率，進而有效的降低生產(chǎn)成本。
[0003]淀粉酶指作用于淀粉或其衍生物的一類酶，可催化水解或轉(zhuǎn)苷反應(yīng)。淀粉酶在食品、醫(yī)藥、紡織等工業(yè)中具有十分廣泛的應(yīng)用，提高淀粉酶的熱穩(wěn)定性對于其工業(yè)化應(yīng)用具
有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種提高酶熱穩(wěn)定性的酶液，由酶和穩(wěn)定劑組成，所述穩(wěn)定劑活性成分為聚乙二醇和納米硅溶膠。
[0005]所述酶液中聚乙二醇含量優(yōu)選1%_20%，納米硅溶膠含量優(yōu)選0.0OP/o-0.2%。
[0006]所述聚乙二醇分子量范圍優(yōu)選400-20000。
[0007]本發(fā)明還提供了一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法，是將聚乙二醇和納米硅溶膠用于提高酶的熱穩(wěn)定性。
[0008]具體而言，是將酶加入以聚乙二醇和納米硅溶膠為活性成分的體系中，混合后的酶液中聚乙二醇的濃度為1%_20%，納米硅溶膠的濃度為0.0OP/o-0.2%。
[0009]所述酶優(yōu)選淀粉酶，經(jīng)過試驗確定，本發(fā)明對環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、淀粉分支酶、中溫α -淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、普魯蘭酶、異淀粉酶、麥芽四糖生成酶、麥芽六糖生成酶等均有一定效果。
[0010]進一步地，在所述淀粉酶優(yōu)選環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0011]雖然本發(fā)明方法簡單、成本低廉，但是效果顯著，能極大提高酶的工業(yè)應(yīng)用的價值。
【具體實施方式】
[0012]實施例1:本例具體說明CGT酶熱穩(wěn)定性分析
[0013](I) a -CGT酶熱穩(wěn)定性分析
[0014]α-CGT酶在一定溫度下保溫，不同時間點取樣，迅速冷卻至0°C，測定酶的殘余α -環(huán)化活力，以未保溫酶液的活力為100%。
[0015]α-環(huán)化活力采用甲基橙法測定:取適當稀釋的酶液0.lmL，加入裝有0.9mL預(yù)先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的l%(w/v)可溶性淀粉溶液中，在40O下反應(yīng)10min后，加入1.0mLl.0N的鹽酸停止反應(yīng)，再加入1.0mL用50mM磷酸緩沖液配制的0.1mM甲基橙溶液，在室溫下保溫20min，在505nm下測定吸光度。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成I μ mol α -環(huán)糊精所需的酶量。
[0016](2) β -CGT酶熱穩(wěn)定性分析
[0017]β-CGT酶在一定溫度下保溫，不同時間點取樣，迅速冷卻至0°C，測定酶的殘余β -環(huán)化活力，以未保溫酶液的活力為100%。
[0018]β -環(huán)化活力采用酹酞法測定:取適當稀釋的酶液0.1mL,加入裝有0.9mL預(yù)先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的l%(w/v)可溶性淀粉溶液的試管中，在4(TC下反應(yīng)10min后，加入3.5mL30mM NaOH和0.5mL由5mM Na2CO3溶液配制的0.02% (w/v)酚酞溶液停止反應(yīng)，在室溫下保溫20min，在550nm下測定吸光度。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成I μ mol β -環(huán)糊精所需的酶量。
[0019](3) Y -CGT酶熱穩(wěn)定性分析
[0020]y -CGT酶在一定溫度下保溫，不同時間點取樣，迅速冷卻至O °C，測定酶的殘余Y-環(huán)化活力，以未保溫酶液的活力為100%。
[0021]Y-環(huán)化活力采用溴甲酚氯法測定:取適當稀釋的酶液0.lmL，加入裝有0.9mL預(yù)先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的l%(w/v)可溶性淀粉溶液的試管中，在40°C下反應(yīng)IOmin后，加入50 μ L1.0N的鹽酸停止反應(yīng)，再加入2mL0.2M檸檬酸緩沖液(ρΗ4.2)和100 μ L5mM溴甲酚氯溶液 ，在室溫下保溫20min，在630nm下測定吸光度。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成I μ mol Y -環(huán)糊精所需的酶量。
[0022]實施例2:
[0023]配制20%(w/v)的聚乙二醇1000，按體積比1:1分別與不同來源的CGT酶溶液混合，混勻，4°C平衡60min，60°C下測CGT酶熱穩(wěn)定性，與空白對照相比，CGT酶的熱穩(wěn)定性顯著提高，半衰期延長了 1-3倍。
[0024]實施例3:
[0025]在不同來源的CGT酶溶液中，添加納米硅溶膠至終濃度為0.0OP/o-0.2%(w/v)，混勻，4°C平衡60min，60°C下測CGT酶熱穩(wěn)定性，與空白對照相比，CGT酶的熱穩(wěn)定性基本無影響。
[0026]實施例4:
[0027]配制20%(w/v)的聚乙二醇1000,按體積比 1:1 與來源于Paenibacillus macerans的a -CGT酶溶液混合，并添加納米硅溶膠至終濃度為0.0OP/o-0.2%(w/v)，混勻，4°C平衡60min,60°C下測a -CGT酶熱穩(wěn)定性,與空白對照相比，a -CGT酶的熱穩(wěn)定性顯著提高,半衰期延長了 5-8倍；與單獨添加聚乙二醇1000相比，其60°C下的半衰期延長了 2-3倍。當添加納米硅溶膠至終濃度為0.005%(w/v)時，與單獨添加聚乙二醇1000相比，其60°C下的半衰期延長了約2.3倍。
[0028]實施例5:
[0029]配制12%(w/v)的聚乙二醇10000,按體積比1:1與來源于Paenibacillusmacerans的a -CGT酶溶液混合，并添加納米硅溶膠至終濃度為0.001%_0.2% (w/v)，混勻，4°C平衡60min,70°C下測其熱穩(wěn)定性,與空白對照相比，a -CGT酶的熱穩(wěn)定性顯著提高,半衰期延長了 4-6倍；與單獨添加聚乙二醇10000相比，其70°C下的半衰期延長了 2-3倍。當添加納米硅溶膠至終濃度為0.l%(w/v)時，與單獨添加聚乙二醇10000相比，其70°C下的半衰期延長了約2.6倍。[0030]實施例6:
[0031]配制30%(w/v)的聚乙二醇400,按體積比1:1與來源于Bacillus circulans的β -CGT酶溶液混合，并添加納米硅溶膠至終濃度為0.0OP/o-0.2%(w/v)，混勻，4°C平衡60min,70°C下測其熱穩(wěn)定性,與空白對照相比，β -CGT酶的熱穩(wěn)定性顯著提高,半衰期延長了 6-10倍；與單獨添加聚乙二醇400相比，其70°C下的半衰期延長了 3-4倍。當添加納米硅溶膠至終濃度為0.001%(w/v)時，與單獨添加聚乙二醇400相比，其70°C下的半衰期延長了約3.2倍。
[0032]實施例7:
[0033]配制2%(w/v)的聚乙二醇4000,按體積比1:1與來源于Bacillus circulans的β -CGT酶溶液混合，并添加納米硅溶膠至終濃度為0.0OP/o-0.2%(w/v)，混勻，4°C平衡60min,40°C下測其熱穩(wěn)定性,與空白對照相比，β -CGT酶的熱穩(wěn)定性顯著提高,半衰期延長了 2-4倍；與單獨添加聚乙二醇4000相比，其40°C下的半衰期延長了 1-2倍。當添加納米硅溶膠至終濃度為0.005%(w/v)時，與單獨添加聚乙二醇4000相比，其40°C下的半衰期延長了約1.3倍。
[0034]實施例8:
[0035]配制40%(w/v)的聚乙二醇2000,按體積比1:1與來源于Bacillus clarkii的Y -CGT酶溶液混合，并添加納米硅溶膠至終濃度為0.0OP/o-0.2%(w/v)，混勻，4 °C平衡60min, 50°C下測其熱穩(wěn)定性,與空白對照相比，Y -CGT酶的熱穩(wěn)定性顯著提高,半衰期延長了 5-10倍；與單獨添加聚乙二醇2000相比，其50°C下的半衰期延長了 2-4倍。當添加納米硅溶膠至終濃度為0.2%(w/v)時，與單獨添加聚乙二醇2000相比，其50°C下的半衰期延長了約2.8倍。
[0036]實施例9:
[0037]配制10%(w/v)的聚乙二醇2OOOO,按體積比1:1與來源于Bacillus clarkii的Y -CGT酶溶液混合，并添加納米硅溶膠至終濃度為0.0OP/o-0.2%(w/v)，混勻，4°C平衡60min, 60 V下測其熱穩(wěn)定性，與空白對照相比，Y -CGT酶的熱穩(wěn)定性顯著提高,半衰期延長了 3-5倍；與單獨添加聚乙二醇20000相比，其60°C下的半衰期延長了 1_2倍。當添加納米硅溶膠至終濃度為0.001%(w/v)時，與單獨添加聚乙二醇20000相比，其60°C下的半衰期延長了約1.2倍。
【權(quán)利要求】
1.一種提高酶熱穩(wěn)定性的酶液，由酶和穩(wěn)定劑組成，其特征在于，穩(wěn)定劑活性成分為聚乙二醇和納米硅溶膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶液，其特征在于，所述酶為淀粉酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶液，其特征在于，所述酶為環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶液，其特征在于，所述酶液中聚乙二醇含量為1%_20%，納米硅溶膠含量為0.001%-0.2%。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶液，其特征在于，所述聚乙二醇分子量為400-20000。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的任一酶液，其特征在于，所述酶液中聚乙二醇含量為1%-20%，聚乙二醇分子量為400-20000 ;所述酶液中納米硅溶膠含量為0.001%-0.2% ;所述酶為環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、淀粉分支酶、中溫α -淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、普魯蘭酶、異淀粉酶、麥芽四糖生成酶或麥芽六糖生成酶中任種。
7.一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于，是將聚乙二醇和納米硅溶膠用于提高酶的熱穩(wěn)定性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，將淀粉酶加入以聚乙二醇和納米硅溶膠為活性成分的體系中，混合后的酶液中聚乙二醇的濃度為1%_20%，納米硅溶膠的濃度為0.001%-0.2% ;所述聚乙二醇分子量為400-20000。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，將酶加入以聚乙二醇和納米硅溶膠為活性成分的體系中，混合后的酶液中聚乙二醇的濃度為I%-20%，納米硅溶膠的濃度為0.001%-0.2%;所述酶為環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、淀粉分支酶、中溫α -淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、普魯蘭酶、異淀粉酶、麥芽四糖生成酶或麥芽六糖生成酶中任一一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，將環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶加入以聚乙二醇和納米硅溶膠為活性成分的體系中，混合后的酶液中聚乙二醇的濃度為1%_20%，納米硅溶膠的濃度為0.0OP/o-0.2% ;所述聚乙二醇分子量為400-20000。
【文檔編號】C12N9/96GK103789294SQ201410050707
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月14日
【發(fā)明者】顧正彪, 李才明, 李兆豐, 李雯雯, 程力, 洪雁 申請人:江南大學(xué)