閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供一種閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌，命名為撕裂蠟孔菌MY183,其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC?M2013644。本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌，命名為披覆炭團(tuán)菌MY311，其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC?M2013645。本發(fā)明從閩浙馬尾杉中分離到產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌，首次發(fā)現(xiàn)撕裂蠟孔菌、披覆炭團(tuán)菌能產(chǎn)石杉堿甲，是尋找石杉堿甲新藥源的一種重要的微生物，有較大的應(yīng)用價值。
【專利說明】閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]老年癡呆癥是一種嚴(yán)重的、退行性腦疾患，由于其發(fā)病率高，致殘率高，給社會和家庭造成了嚴(yán)重的危害和巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，隨著社會老齡化，老年癡呆癥發(fā)病率相對上升，據(jù)統(tǒng)計，世界有5000多萬老年人患有不同程度的老年性癡呆癥，因此治療老年癡呆癥是擺在當(dāng)前社會的一大難題。
[0003]石杉堿甲[(_)Huperzine A,Hup A]是我國科學(xué)家劉嘉森于1986年從蛇足石杉中分離得到的一種新型石松類生物堿有效單體。藥理實驗表明，它能抑制乙酰膽堿酯酶活性，有效地改善老年人記憶功能，對治療老年癡呆癥有特殊療效。石杉堿甲不但來源于蛇足石杉全草，而且來源于其他石杉科植物。石杉科植物分為馬尾杉屬和石杉屬。2005年馬小強(qiáng)采用HPLC的方法測量Hup A的含量,發(fā)現(xiàn)在粗糙馬尾杉(Phlegmariurus carinatus)含量最高，由此可知從馬尾杉屬植物中可以分離到石杉堿甲。而該植物對環(huán)境要求苛刻，生長緩慢，分布零散，資源更新周期長，而且石杉堿甲的含量甚微，僅為萬分之幾，造成國際市場上石杉堿甲的價格不斷攀升，一度達(dá)到每千克50萬美元，成為制約石杉堿甲開發(fā)的瓶頸。由于石杉堿甲的結(jié)構(gòu)特殊，骨架中的橋環(huán)結(jié)構(gòu)難以人工合成，目前所有化學(xué)合成方法步驟復(fù)雜、合成條件苛刻、產(chǎn)率很低，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；植物組織培養(yǎng)無法消除內(nèi)在的微生物污染，同時由于植物生長條件十分苛刻，因此至今未能走出實驗室。
[0004]植物內(nèi)生真菌由于生活在植物體中，長期與植物相互作用，能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似化學(xué)成分。自從1993年Strobel等從短葉紅豆杉中分離出能夠合成抗癌成分的紫杉醇，人們希望采用內(nèi)生真菌發(fā)酵合成藥用成分。微生物具有易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，易誘變提高有效產(chǎn)物的含量，發(fā)酵產(chǎn)物較植物成分單一，有效成分容易分離等優(yōu)勢。因此從內(nèi)生真菌中提取活性成分代替從植物中提`取活性成分，不但可解決許多藥用植物資源的枯竭危機(jī)，而且也降低了活性成分的生產(chǎn)成本。
[0005]目前已有不少關(guān)于從蛇足石杉植物中分離到產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌的報道，如專利CN101195804A(黎萬奎等，專利申請?zhí)?200610119149.7，內(nèi)生枝頂孢霉)、CN101240304A(吳東才等，專利申請?zhí)?200710003519.5，枝孢霉菌)、CN101942393A(朱篤等，專利申請?zhí)?20091010186852.3，竹黃菌)、專利 CN103103134A(吳水生等，專利申請?zhí)?201110355882.X，炭疽菌)等;楊曉軍(《內(nèi)生真菌YD-Ol次生代謝產(chǎn)物的研究I》2006，37 (5) =479-480,中國藥科大學(xué)學(xué)報)均報道了產(chǎn)石杉堿甲及其類似物的菌株。以上均表明利用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲成為一種可能，采用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲是解決石杉堿甲原料來源的經(jīng)濟(jì)有效的新途徑。但目前報道的菌種石杉堿甲產(chǎn)量低，無法應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，通過進(jìn)一步的分離純化新的、高產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌成為必要，為發(fā)現(xiàn)適合于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲創(chuàng)造一種可能。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲藥物的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應(yīng)用。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌，命名為撕裂蠟孔菌(Ceriporia lacerata) MY183,其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC M2013644。
[0008]上述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌一撕裂蠟孔菌MY183，其顯微形態(tài)為:菌絲無隔，分枝，平滑，呈管狀，間距不等，孢子橢圓形，單孢。
[0009]上述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌一撕裂蠟孔菌MY183，其基因組ITS特征堿基序列如SEQ ID NO:1 所示。
[0010]上述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌一撕裂蠟孔菌MY183，其液體培養(yǎng)菌落特征為PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)第三天出現(xiàn)少量菌絲球，第五天菌絲球直徑增大，量變多，第八天發(fā)酵液呈淡黃色，第十天顏色加深；其菌落特征為:四天布滿整個平板，菌絲發(fā)達(dá)，呈乳白色，顆粒狀突起，背面黃白色。
[0011]本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌，命名為披覆炭團(tuán)菌(Hypoxylon investiens)MY311，其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCCM2013645。
[0012]上述的閩浙馬尾 杉內(nèi)生真菌一披覆炭團(tuán)菌MY311，其顯微形態(tài)為:菌絲分枝，有隔，孢子橢圓形，單胞。
[0013]上述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌一披覆炭團(tuán)菌MY311，其基因組ITS特征堿基序列如SEQ ID NO:2 所示。
[0014]上述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌一披覆炭團(tuán)菌MY311，其液體培養(yǎng)菌落特征為PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，生長迅速，第三天未見明顯生長，第五天菌絲球出現(xiàn)，發(fā)酵液呈白色，第六天發(fā)酵液呈灰色，第九天發(fā)酵液呈灰黑色，菌絲球直徑增大。其菌落特征為:菌絲發(fā)達(dá)，中央呈黃灰色，呈點(diǎn)狀，外源淺黃灰色，顆粒狀，凸起處呈灰白色，布滿整個平板，背面黑色。
[0015]本發(fā)明的又一技術(shù)方案為提供一種閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌提取石杉堿甲的方法，包括下列步驟:
[0016](I)取閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌菌種即撕裂蠟孔菌MY183或披覆炭團(tuán)菌MY311，在無菌條件下，用接種針挑取菌絲，接入滅菌的固體PDA培養(yǎng)基，于28°C活化48小時；
[0017](2)取活化后的菌種，在無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的液體PDA培養(yǎng)基，于28°C在140rpm搖床培養(yǎng)72小時，得種子液；
[0018](3)將制備好的種子液按10:1的質(zhì)量比接入液體PDA培養(yǎng)基中，于28°C下140rpm搖床培養(yǎng)10天；
[0019](4)發(fā)酵完后，加入30ml的2%酒石酸，靜置過夜，超聲兩次，每次各40min，抽濾收集上清液，用氨水調(diào)節(jié)至PH值為9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，600C回收二氯甲烷，用IOml的甲醇溶解殘留物得到石杉堿甲初提物。
[0020]本發(fā)明的又一技術(shù)方案為提供一種上述閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌菌種即撕裂蠟孔菌MY183或披覆炭團(tuán)菌MY311制備石杉堿甲的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明從閩浙馬尾杉中分離到產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌，首次發(fā)現(xiàn)撕裂蠟孔菌、披覆炭團(tuán)菌能產(chǎn)石杉堿甲。經(jīng)HPLC、LC/MS檢測實驗證明該菌發(fā)酵產(chǎn)物中含有化合物石杉堿甲，是尋找石杉堿甲新藥源的一種重要的微生物，有較大的應(yīng)用價值。利用本發(fā)明閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌的特點(diǎn)以及現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，可以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)石杉堿甲，以解決石杉堿甲開發(fā)的瓶頸問題，同時可以挽救瀕臨滅絕的石杉堿甲自然資源。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明撕裂蠟孔菌MY183的顯微形態(tài)圖；
[0023]圖2為本發(fā)明披覆炭團(tuán)菌MY311的顯微形態(tài)圖；
[0024]圖3為撕裂蠟孔菌MY183的菌落形態(tài)圖；
[0025]圖4為披覆炭團(tuán)菌MY311的菌落形態(tài)圖；
[0026]圖5為Hup A標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖；
[0027]圖6為撕裂蠟孔菌MY183發(fā)酵提取物色譜圖；
[0028]圖7為披覆炭團(tuán)菌MY311發(fā)酵提取物色譜圖；
[0029]圖8為Hup A標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖；
[0030]圖9為撕裂蠟孔菌MY183發(fā)酵提取物質(zhì)譜圖；
[0031]圖10為披覆炭團(tuán)菌MY311發(fā)酵提取物質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0032]為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附圖詳予說明。
[0033]本發(fā)明所述的產(chǎn)石杉堿甲的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌是從閩浙馬尾杉活體植物中采用內(nèi)生真菌分離純化技術(shù)分離獲得。經(jīng)分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)鑒定命名為撕裂蠟孔菌(Ceriporia lacerata) MY183、披覆炭團(tuán)菌(Hypoxylon investiens) MY311,都已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期:2013年12月10號；其中撕裂臘孔菌(Ceriporia lacerata) MY183 保藏號:CCTCC M2013644,披覆炭團(tuán)菌(Hypoxyloninvestiens) MY311 保藏號 CCTCC M2013645。
[0034]實施例1
[0035]1、菌株顯微形態(tài)觀察:將本發(fā)明兩種產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌點(diǎn)接種于平板中央，再將滅完菌的蓋玻片45°斜插人接完菌的平板中(2片/平板)，于28°C真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌株長到一定程度(6d)后，取插片(超凈臺中進(jìn)行)于顯微鏡下觀察。
[0036]請參閱圖1為本發(fā)明撕裂蠟孔菌MY183的顯微形態(tài)圖，所述撕裂蠟孔菌MY183的顯微形態(tài)為:菌絲無隔，分枝，平滑，呈管狀，間距不等，孢子橢圓形，單孢。
[0037]請參閱圖2為本發(fā)明披覆炭團(tuán)菌MY311的顯微形態(tài)圖，所述披覆炭團(tuán)菌MY311顯微形態(tài)為:菌絲分枝，有隔，孢子橢圓形，單胞。 [0038]2、菌株平板形態(tài)觀察:將本發(fā)明產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌點(diǎn)接到3個平板中央。于28°C真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時觀察記錄菌體的生長情況，包括菌落直徑、菌落顏色、菌絲變化等菌株形態(tài)變化。[0039]閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌一撕裂蠟孔菌MY183，其液體培養(yǎng)菌落特征為PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)第三天出現(xiàn)少量菌絲球，第五天菌絲球直徑增大，量變多，第八天發(fā)酵液呈淡黃色，第十天顏色加深；其菌落特征為:四天布滿整個平板，菌絲發(fā)達(dá)，呈乳白色，顆粒狀突起，背面黃白色。
[0040]閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌一披覆炭團(tuán)菌MY311，其液體培養(yǎng)菌落特征為PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，生長迅速，第三天未見明顯生長，第五天菌絲球出現(xiàn)，發(fā)酵液呈白色，第六天發(fā)酵液呈灰色，第九天發(fā)酵液呈灰黑色，菌絲球直徑增大。其菌落特征為:菌絲發(fā)達(dá)，中央呈黃灰色，呈點(diǎn)狀，外源淺黃灰色，顆粒狀，凸起處呈灰白色，布滿整個平板，背面黑色。
[0041 ] 3、本發(fā)明閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌分子生物學(xué)特征
[0042]菌體收集:將本發(fā)明產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌接自PDA液體培養(yǎng)基，28°C，140r/min，搖瓶培養(yǎng)，待菌體長到一定量后，8000rpm離心5min，棄上清，將沉淀的菌體轉(zhuǎn)至EP管內(nèi)，于_80°C冰柜中預(yù)凍一晚待用。
[0043]DNA提取:采用CTAB法提取基因組DNA，取適量凍干后的菌體，于研缽中充分研磨，加入預(yù)熱至65°C的CTAB溶液1ml，取500ul轉(zhuǎn)入2ml離心管，加入20 μ I巰基乙醇，混合，65°C溫浴Ih ;溫浴結(jié)束后加入等體積的1:1的苯酚:氯仿，緩慢震蕩，12000rpm，20°C離心lOmin，取上清液至新的離心管，重復(fù)以上步驟，至上清液澄清，將上清液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管(共提2~4次)。加入7/10體積異丙醇，4°C下沉淀，30min后1000Orpm離心IOmin,棄上清；用75%冷乙醇(500ul)洗滌沉淀，然后10000rpm，4°C離心lOmin，棄上清(重復(fù)一次)，自然風(fēng)干；最后加入20ul超純水充分溶解,最后放置_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0044]PCR擴(kuò)增:采用ITSl和ITS4作為上下游引物，構(gòu)建20 μ I反應(yīng)體系(含ddH2012.2μ l、10Xbuffer2 μ 1、dNTPl.6μ 1、Primer ITSl 和 Primer ITS4 各 I μ 1、模板I μ l、Taq 酶 0.2 μ I。)，以 94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s, 55°C退火 Imin，72°C延伸 Imin，32個循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保溫`的條件進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。結(jié)束后，以該輪的PCR產(chǎn)物作為模板，再次擴(kuò)增100 μ I。
[0045]凝膠電泳:采用TBE做緩沖液,取lul6 X loading buffer和2ul樣品(基因組和擴(kuò)增產(chǎn)物)混勻上樣，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄結(jié)果。
[0046]產(chǎn)物純化:采用離心柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(EZ-lOSpin Column PCR ProductPurification Kit)純化PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物送交生工生物工程上海股份有限公司完成測序。
[0047]本發(fā)明所述的兩種產(chǎn)石杉堿甲閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌genebank登入號分別為:撕裂臘孔菌(Ceriporia lacerata) MY183 登入號 KF973226,披覆炭團(tuán)菌(Hypoxyloninvestiens) MY311 登入號 KF973227, ITS 堿基序列為:
[0048]撕裂臘孔菌(Ceriporialacerata) MY183 (SEQ ID NO:I):
[0049]CCTTTACGAGGTATGTGCACGCCTGGCTCATCCACTCTCAACCTCTGTGCACTTTATGTAAGAAACGGTGTAAGCCAGCTATTTATTAGTTGGTAATAAGCCTTTCTTATGTTCACTACAAACGCTTCAGTTATAGAATGTTTACTGTGTATAACACAATTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTGAGTCTCATGGAATTCTCAACCCCTAAATTTTGTAATGAAGTTTAG TGGGCTTGGACTTGGAGGTTGTGTCGGCTTCTAGTCGACTCCTCTGAAATGCATTAGCGTGAATCTTACGGATCGCCTTCAGTGTGATAATTAT
CTGCGCTGTGGTGTTGAAGTATTTATTAGTTCGTGCTTATAATCGTCTCTTACCGAGACAATTTATGACAATCTGAG
CTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAACGGAGGAA
[0050]披覆炭團(tuán)菌(Hypoxyloninvestiens) MY311 (SEQ ID NO:2):
[0051]GGCCTATAGGCGGTGGTAGTCCTCCCCTTTGTGACCTTACCGTCGTTGCCTCGGCGTGAGCTACGGCTACCCGGGAGCTACCCTGGAAGTACCCTAGAGTTACCCTATAGCTACCCTGCAGCTACCCTATACTTACCCTATAGCTACCCTGCAGCTACCCTATAGTTAGTTACCCTGGAGTTACCCTGGAGCTACCCTGTAGCCGGCTTATGGCCCGCCGAAGGACAGCTAAACTCTTGTTTTTACCACTGTTTCTCTGAATTACAAACTGAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTATTCGAGCGTCATTTCGACCCCTAAGCCCCTGTTGCTTAGCGTTGGGAATCTACAGCGTAGTTCCTCAAAATTAGTGGCGGAGTTAGGGTACACTCTCAGCGTAGTAATTTCTCTCGCTCGTGTGGTGGCCTTGGCTGCTAGCCGTTAAAACCCCTATAATTTCTAGTGGTTGACCTCGGATTAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCCGGAGGAAG
[0052]序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建:本發(fā)明閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌18S rDNA序列測序結(jié)果全部轉(zhuǎn)換為FASTA格式，在線BLAST檢索，與GenBank中其他真菌的18SrDNA序列進(jìn)行比對，分別與撕裂臘孔菌(Ceriporia lacerata)、披覆炭團(tuán)菌(Hypoxylon investiens)同源性為100%，同時通過菌株形態(tài)特征比較，確定菌株分類的正確。
[0053]實施例2 [0054]一、本發(fā)明閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌的采集
[0055]1、從福建省龍巖市連城縣冠豸山采回的閩浙馬尾杉依照石緯等的分離方法分離閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌。對采來的新鮮閩浙馬尾杉活體植物用自來水沖洗干凈，浸入75%乙醇(5min),用無菌水沖洗5次；用無菌濾紙吸干后再將其浸入0.1%升萊(約Imin),再次用無菌水沖洗，無菌濾紙吸干，最后用75%乙醇浸泡30s，無菌濾紙吸干。用滅菌后的剪刀將不同植物組織材料(即根，莖，葉)分割成約5mm長的大小。然后每種樣品分別轉(zhuǎn)入含有3%鏈霉素的PDA平板上，用于內(nèi)生真菌的分離。于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天。定期觀察內(nèi)生真菌菌落形成情況，3-5天后觀察到樣品邊緣部分有菌絲長出，挑取尖端菌絲轉(zhuǎn)接于新鮮PDA平板，純化2-3次，將純化到的菌株進(jìn)行菌種保藏。
[0056]2、將純化后的菌株用PDB液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0057]3、PDB液體培養(yǎng)基的制作方法:將洗凈后去皮的馬鈴薯200g切碎，加水至1000ml煮沸半小時，用八層紗布濾去馬鈴薯，然后加入20g葡萄糖，加水補(bǔ)足至1000ml，攪拌溶解后分裝滅菌(121°C高壓蒸汽滅菌20min)。
[0058]二、本發(fā)明閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液的制備
[0059]1、取本發(fā)明的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌絲，接入已滅菌過的固體PDA培養(yǎng)基試管，于28°C活化48小時。
[0060]2、取活化后的菌種，在無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的液體PDA培養(yǎng)基，于28°C在140rpm搖床培養(yǎng)72小時，得種子液。
[0061]3、將制備好的種子液按10%的量轉(zhuǎn)接入盛有100ml/250ml液體PDA培養(yǎng)基中，于28°C下140rpm搖床培養(yǎng)10天。
[0062]4、發(fā)酵完后，先取Iml的菌株發(fā)酵液，17000rpm離心15min取上清，用于ELISA初篩產(chǎn)石杉堿甲的菌株。剩余發(fā)酵液加入30ml的2%酒石酸，靜置過夜，超聲兩次，每次各40min，抽濾收集上清液，用氨水調(diào)節(jié)至PH值為9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60°C回收二氯甲烷，合并有機(jī)相，減壓濃縮至干，用IOml無水甲醇分三次加入回收瓶中，溶解，取出吹干，加0.2%甲酸200 μ 1，加入活化好的C-18固相小柱，收集40%甲醇洗脫的樣品3ml,吹干,加0.2%甲酸200 μ 1,17000r/min離心IOmin,取上清液備用。
[0063]三、本發(fā)明的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌產(chǎn)石杉堿甲特性的確定
[0064]I) ELISA 初篩
[0065]根據(jù)抗原的性質(zhì)和實驗要求，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液將包被抗原HupA-OVA稀釋成1:200濃度，以100 μ I/孔，4°C孵育16h。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水紙上拍干。洗完板加入封閉液，200μ1/孔，37°C孵育2h。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水紙上拍干。在已經(jīng)封閉好的96孔板內(nèi)分別加入PBS處理好樣品和稀釋度為1:8000的石杉堿甲的單克隆抗體(Hup A-McAb)各50 μ 1，振蕩混勻后，置于37°C孵育lh。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水紙上拍干。每孔加入新鮮稀釋的酶標(biāo)二抗(HRP-1gG)(稀釋度為1:5000) 100 μ I/孔，37°C孵育40min，倒空液體，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水紙上拍干。加入新鮮配制的顯色液100 μ I/孔，振蕩混勻后，室溫孵育lOmin，密切觀察，顯色I(xiàn)Omin后，每孔加入50 μ 12M H2SO4溶液終止反應(yīng)，振蕩混勻，靜置5min，使終止徹底，顏色均一。在酶標(biāo)測定儀上，于波長450nm測定吸光值。
[0066]2 ) HPLC 和 LC-MS 分析
[0067](I) HPLC (高效液相色譜)條件
[0068]色譜條件:色譜柱:XTerraMS C-18 (2.1 X 50mm, 5 μ m)流動相:甲醇:0.2%甲酸(15:85);流速:1.00/min ;柱溫:30°C ;進(jìn)樣量:20μ I ；
[0069](2) LC-MS(質(zhì)譜條件)條件:離子源:ESI ;檢測方式:正離子檢測；采集方式:MSscan ;檢測對象:石杉堿甲，m/z (243.2 — 211.5);毛細(xì)管電壓:3.0KV，錐孔電壓:35V，離子源溫度:110°C，脫溶劑溫度:350°C，脫溶劑氣流量:654L/hr。
[0070](3)結(jié)果分析
[0071 ] 在酶標(biāo)測定儀上，于波長450nm測定吸光值，根據(jù)公式抑制率=(BO-B) /BO,計算抑制率，撕裂臘孔菌(Ceriporia lacerata) MY183抑制率為85.4%,披覆炭團(tuán)菌(Hypoxyloninvestiens) MY311 抑制率為 99.4%。
[0072]經(jīng)HPLC分析，本發(fā)明所述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物HPLC色譜圖如圖6、圖7所不，色譜圖中的31.127min、31.303min分別是撕裂臘孔菌(Ceriporia lacerata)MY183、披覆炭團(tuán)菌(Hypoxylon investiens) MY311發(fā)酵提取物目標(biāo)峰保留時間，與石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品保留時間(圖5) (31.599min) 一致。
[0073]經(jīng)LC-MS分析，本發(fā)明所述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物L(fēng)C-MS色譜圖如圖
9、圖10所不，其分子尚子峰分別為m/z243.51/211.55,如圖8所不石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品分子尚子峰為m/z243.51/211.55。本發(fā)明訴述的兩株閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物與石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品化合物有一致的分子離 子峰。
[0074]本發(fā)明所述的產(chǎn)石杉堿甲的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌一撕裂蠟孔菌MY183、披覆炭團(tuán)菌MY311是從閩浙馬尾杉內(nèi)中分離純化到的絲狀真菌，經(jīng)液體發(fā)酵后，ELISA、HPLC, LC-MS檢測證明該菌株能夠產(chǎn)生與寄生植物的化合物石杉堿甲，是尋找石杉堿甲新藥源的重要微生物，有較大的應(yīng)用價值。
[0075]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本 發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌,命名為撕裂臘孔菌(Ceriporia lacerata) MY183,其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC M2013644。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌，其特征在于，它的顯微形態(tài)為:菌絲無隔，分枝，平滑，呈管狀，間距不等，孢子橢圓形，單孢。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌，其特征在于，它的基因組ITS特征堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌，其特征在于，它的液體培養(yǎng)菌落特征為PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)第三天出現(xiàn)少量菌絲球，第五天菌絲球直徑增大，量變多，第八天發(fā)酵液呈淡黃色，第十天顏色加深；其菌落特征為:四天布滿整個平板，菌絲發(fā)達(dá)，呈乳白色，顆粒狀突起，背面黃白色。
5.—種閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌,命名為披覆炭團(tuán)菌(Hypoxylon investiens)MY311,其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC M2013645。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌，其特征在于，它的顯微形態(tài)為:菌絲分枝，有隔，孢子橢圓形，單胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌，其特征在于，它的基因組ITS特征堿基序列如SEQ ID NO:2所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌，其特征在于，它的液體培養(yǎng)菌落特征為PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，生長迅速，第三天未見明顯生長，第五天菌絲球出現(xiàn)，發(fā)酵液呈白色，第六天發(fā)酵液呈灰色，第九天發(fā)酵液呈灰黑色，菌絲球直徑增大。其菌落特征為:菌絲發(fā)達(dá)，中央呈黃灰色，呈點(diǎn)狀，外源淺黃灰色，顆粒狀，凸起處呈灰白色，布滿整個平板，背面黑色。
9.一種閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌提取石杉堿甲的方法，其特征在于，包括下列步驟: (1)取如權(quán)利要求1或5所述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取菌絲，接入滅菌的固體PDA培養(yǎng)基，于28°C活化48小時； (2)取活化后的菌種，在無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的液體PDA培養(yǎng)基，于28°C在140rpm搖床培養(yǎng)72小時，得種子液； (3)將制備好的種子液按10:1的質(zhì)量比接入液體PDA培養(yǎng)基中，于28°C下140rpm搖床培養(yǎng)10天； (4)發(fā)酵完后，加入30ml的2%酒石酸，靜置過夜，超聲兩次，每次各40min，抽濾收集上清液，用氨水調(diào)節(jié)至PH值為9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60°C回收二氯甲烷，用10ml的甲醇溶解殘留物得到石杉堿甲初提物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或5任一項所述的閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌制備石杉堿甲的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/14GK103820331SQ201410045031
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月7日
【發(fā)明者】吳水生, 張方方, 鄭雅媗, 劉海元 申請人:福建中醫(yī)藥大學(xué)