閩浙馬尾杉菌根真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領域】，具體涉及閩浙馬尾杉菌根真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應用。本發(fā)明提供一種閩浙馬尾杉菌根真菌，命名為裂褶菌（Schizophyllum?commune）MT39，其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC?M2013642。本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種閩浙馬尾杉菌根真菌，命名為(Chaunopycnis?alba)MT78，其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC?M2013643。本發(fā)明解決了土壤中細菌含量較多分離純化內(nèi)生菌根真菌難度較大的問題，從根際土壤中分離產(chǎn)石杉堿甲的菌根真菌。
【專利說明】閩浙馬尾杉菌根真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領域】，具體涉及閩浙馬尾杉菌根真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002]老年癡呆癥是一種嚴重的、退行性腦疾患，由于其發(fā)病率高，致殘率高，給社會和家庭造成了嚴重的危害和巨大的經(jīng)濟負擔，隨著社會老齡化，老年癡呆癥發(fā)病率相對上升，據(jù)統(tǒng)計，世界有5000多萬老年人患有不同程度的老年性癡呆癥，因此治療老年癡呆癥是擺在當前社會的一大難題。
[0003]石杉堿甲[(_)Huperzine A,Hup A]是我國科學家劉嘉森于1986年從蛇足石杉中分離得到的一種新型石松類生物堿有效單體。藥理實驗表明，它能抑制乙酰膽堿酯酶活性，有效地改善老年人記憶功能，對治療老年癡呆癥有特殊療效。石杉堿甲主要來源于野生蛇足石杉全草，而該植物對環(huán)境要求苛刻，生長緩慢，分布零散，資源更新周期長，而且石杉堿甲在蛇足石杉中的含量甚微，僅為萬分之幾，造成國際市場上石杉堿甲的價格不斷攀升，一度達到每千克50萬美元，成為制約石杉堿甲開發(fā)的瓶頸。由于石杉堿甲的結(jié)構(gòu)特殊，骨架中的橋環(huán)結(jié)構(gòu)難以人工合成，目前所有化學合成方法步驟復雜、合成條件苛刻、產(chǎn)率很低，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；植物組織培養(yǎng)無法消除內(nèi)在的微生物污染，同時由于植物生長條件十分苛刻，因此至今未能走出實驗室。
[0004]植物-菌根真菌-內(nèi)生真菌三重互惠共生體，其建立共生體的內(nèi)在機制是兩種真菌通過營養(yǎng)競爭或通過分泌次生代謝產(chǎn)物來相互抑制與植物建立共生體。目前已有不少關(guān)于從蛇足石杉內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中分離到石杉堿甲的報道，如專利CNlOl 195804A (黎萬奎等，專利申請?zhí)?2006 10119149.7，內(nèi)生枝頂孢霉)、CN101240304A(吳東才等，專利申請?zhí)?200710003519.5，枝孢霉菌)、CN101942393A (朱篤等，專利申請?zhí)?20091010186852.3，竹黃菌)、專利CN103103134A (吳水生等，專利申請?zhí)?201110355882.X，炭疽菌)等；楊曉軍(《內(nèi)生真菌YD-Ol次生代謝產(chǎn)物的研究I》2006，37 (5):479_480，中國藥科大學學報)均報道了產(chǎn)石杉堿甲及其類似物的內(nèi)生真菌。以上均表明利用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲成為一種可能，依據(jù)該共生體的內(nèi)在機制從植物根際土壤中可分離到產(chǎn)石杉堿甲的菌根真菌，但目前關(guān)于該機制的研究觀點不盡相同且土壤中微生物種類繁多，分離純化工作量大，因此至今關(guān)于從植物根際土壤中分離產(chǎn)石杉堿甲菌根菌的研究仍未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服土壤中細菌含量較多，分離純化內(nèi)生菌根真菌難度較大的缺陷，提供一種供發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲藥物的閩浙馬尾杉菌根真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應用。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種閩浙馬尾杉菌根真菌，命名為裂褶菌(Schizophyllum commune)MT39，其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC M2013642。
[0007]上述的閩浙馬尾杉菌根真菌一裂褶菌MT39，其顯微形態(tài)為:菌絲棉花狀，有隔，分枝，不產(chǎn)孢子。
[0008]上述的閩浙馬尾杉菌根真菌一裂褶菌MT39，其基因組ITS特征堿基序列如SEQ IDNO:1所示。
[0009]上述的閩浙馬尾杉菌根真菌一裂褶菌MT39，其菌落培養(yǎng)特征為:PDA培養(yǎng)基28V培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為HOrpm，培養(yǎng)第二天開始出現(xiàn)菌絲球，第五天菌絲球直徑變大，發(fā)酵液變粘稠，發(fā)酵液開始變淡黃色，第九天顏色變深，發(fā)酵液變得非常粘稠，其菌落形態(tài)為:正面白色，菌絲發(fā)達，細膩，背面黃白色。
[0010]本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種閩浙馬尾杉菌根真菌,命名為(Chaunopycnisalba)MT78，其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC M2013643。
[0011]上述的閩浙馬尾杉菌根真菌一MT78，其顯微形態(tài)為:菌絲分枝，無隔，孢子梨形，單胞。
[0012]上述的閩浙馬尾杉菌根真菌一MT78，其基因組ITS特征堿基序列為:SEQ ID NO:2。
[0013]上述的閩浙馬尾杉菌根真菌一MT78，其固體培養(yǎng)菌落特征為:PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為HOrpm，第三 天明顯生長大量菌絲呈顆粒狀，第五天發(fā)酵液變無色粘稠狀液體，第九天菌絲集結(jié)成團。其菌落形態(tài)為:正面白色，菌絲細小，呈薄膜狀，有葉脈狀凸起，呈放射狀，背面呈脈狀放射裂紋，黃白色。
[0014]本發(fā)明的又一技術(shù)方案為提供一種閩浙馬尾杉菌根真菌制備石杉堿甲的方法，包括下列步驟:
[0015](I)取閩浙馬尾杉菌根真菌-裂褶菌MT39或MT78，在無菌條件下，用接種針挑取菌絲，接入已滅菌過的固體PDA培養(yǎng)基試管，于28 °C活化48小時；
[0016](2)取活化后的菌種，在無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的液體PDA培養(yǎng)基，于28°C在140rpm搖床培養(yǎng)72小時，得種子液；
[0017](3)將制備好的種子液接入液體PDA培養(yǎng)基中，于28°C下140rpm搖床培養(yǎng)10天；
[0018](4)發(fā)酵完后，加入2%酒石酸，靜置過夜，超聲兩次，每次各40min，抽濾收集上清液，用氨水調(diào)節(jié)至PH值為9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60°C回收二氯甲烷，用甲醇溶解殘留物得到石杉堿甲初提物。
[0019]本發(fā)明的又一技術(shù)方案為提供一種上述的閩浙馬尾杉菌根真菌-裂褶菌MT39或MT78制備石杉堿甲的應用。
[0020]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明解決了土壤中細菌含量較多分離純化內(nèi)生菌根真菌難度較大的問題，從根際土壤中分離產(chǎn)石杉堿甲的菌根真菌。本發(fā)明兩株閩浙馬尾杉菌根真菌分別通過發(fā)酵，經(jīng)石杉堿甲單克隆抗檢測、HPLC、LC-MS分析證實可以產(chǎn)生石杉堿甲化合物，可以作為石杉堿甲新藥源，有較大的應用價值。本發(fā)明可以利用兩株閩浙馬尾杉菌根真菌產(chǎn)石杉堿甲的特點以及現(xiàn)代發(fā)酵育種技術(shù)，達到工業(yè)化生產(chǎn)石杉堿甲，以解決石杉堿甲短缺的瓶頸問題，同時可以挽救瀕臨滅絕的石杉堿甲自然資源。
【專利附圖】

【附圖說明】[0021]圖1為本發(fā)明裂褶菌MT39的顯微形態(tài)圖；
[0022]圖2為本發(fā)明MT78的顯微形態(tài)圖；
[0023]圖3為裂褶菌MT39的菌落形態(tài)圖；
[0024]圖4為MT78的菌落形態(tài)圖；
[0025]圖5為Hup A標準品HPLC色譜圖；
[0026]圖6為裂褶菌MT39發(fā)酵提取物色譜圖；
[0027]圖7為MT78發(fā)酵提取物色譜圖；
[0028]圖8為Hup A標準品質(zhì)譜圖；
[0029]圖9為裂褶菌MT39發(fā)酵提取物質(zhì)譜圖；
[0030]圖10為MT78發(fā)酵提取物質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0031]為詳細說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附圖詳予說明。
[0032]本發(fā)明所述的兩株閩浙馬尾杉菌根真菌是從閩浙馬尾杉(Phlegmariurusphlegmaria)根際土壤采用土壤稀釋法分離純化得到。經(jīng)分子生物學及形態(tài)學鑒定命名為裂裙菌(Schizophyl lum commune)MT39、Chaunopycnis alba MT78,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國.武漢.武漢大學，保藏日期為2013年12月10號，其中Chaunopycnisalba MT78 保藏號 CCTCC M2013643，裂褶菌(Schizophyllum commune) MT39 保藏號 CCTCCM2013642。
[0033]實施例1
[0034]1、菌株顯微形態(tài)觀察:將本發(fā)明兩種產(chǎn)石杉堿甲的菌根真菌接點接種于平板中央，再將滅完菌的蓋玻片45°斜插人接完菌的平板中(2片/平板)，于28° C真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌株長到一定程度(6d)后，取插片(超凈臺中進行)于顯微鏡下觀察。
[0035]請參閱圖1為本發(fā)明裂褶菌MT39的顯微形態(tài)圖，所述裂褶菌MT39的顯微形態(tài)為:菌絲棉花狀，有隔，分枝，不產(chǎn)孢子。
[0036]請參閱圖2為本發(fā)明MT78的顯微形態(tài)圖，所述MT78顯微形態(tài)為:菌絲分枝，無隔，孢子梨形，單胞。
[0037]2、菌株平板形態(tài)觀察:將本發(fā)明產(chǎn)石杉堿甲的菌根真菌點接到平板中央。于28° C真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時觀察記錄菌體的生長情況，包括菌落直徑、菌落顏色、菌絲變化等菌株形態(tài)變化。
[0038]閩浙馬尾杉菌根真菌一裂褶菌MT39，其菌落培養(yǎng)特征為:PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)第二天開始出現(xiàn)菌絲球，第五天菌絲球直徑變大，發(fā)酵液變粘稠，發(fā)酵液開始變淡黃色，第九天顏色變深，發(fā)酵液變得非常粘稠，其菌落形態(tài)為:正面白色，菌絲發(fā)達，細膩，背面黃白色。
[0039]閩浙馬尾杉菌根真菌一MT78，其固體培養(yǎng)菌落特征為PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，生長迅速，第三天明顯生長大量菌絲呈顆粒狀，第五天發(fā)酵液變無色粘稠狀液體，第九天菌絲集結(jié)成團。其菌落形態(tài)為:正面白色，菌絲細小，呈薄膜狀，有葉脈狀凸起，呈放射狀，背面呈脈狀放射裂紋，黃白色，生長較緩慢，10天約8x7cm。[0040]3、本發(fā)明閩浙馬尾杉菌根真菌分子生物學特征
[0041]菌體收集:將本發(fā)明產(chǎn)石杉堿甲菌根真菌接自PDA液體培養(yǎng)基，28°C，140r/min，搖瓶培養(yǎng)，待菌體長到一定量后，8000rpm離心5min，棄上清，將沉淀的菌體轉(zhuǎn)至EP管內(nèi)，于-80°C冰柜中預凍一晚待用。
[0042]DNA提取:采用CTAB法提取基因組DNA，取適量凍干后的菌體，于研缽中充分研磨，加入預熱至65°C的CTAB溶液1ml，取500ul轉(zhuǎn)入2ml離心管，加入20 μ I巰基乙醇，混合，65°C溫浴Ih ;溫浴結(jié)束后加入等體積的1:1的苯酚:氯仿，緩慢震蕩，12000rpm，20°C離心lOmin，取上清液至新的離心管，重復以上步驟，至上清液澄清，將上清液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管(共提2~4次)。加入7/10體積異丙醇，4°C下沉淀，30min后1000Orpm離心IOmin,棄上清；用75%冷乙醇(500ul)洗滌沉淀，然后10000rpm，4°C離心lOmin，棄上清(重復一次)，自然風干；最后加入20ul超純水充分溶解,最后放置_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0043]PCR擴增:采用ITSl和ITS4作為上下游引物，構(gòu)建20 μ I反應體系(含ddH2012.2μ l、10Xbuffer2 μ 1、dNTPl.6μ 1、Primer ITSl 和 Primer ITS4 各 I μ 1、模板I μ l、Taq 酶 0.2 μ I。)，以 94°C預變性 5min ;94°C變性 30s, 55°C退火 Imin，72°C延伸 Imin，32個循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保溫的條件進行反應擴增。結(jié)束后，以該輪的PCR產(chǎn)物作為模板，再次擴增100 μ I。
[0044]凝膠電泳:采用TBE做緩沖液,取lul6 X loading buffer和2ul樣品(基因組和擴增產(chǎn)物)混勻上樣，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄結(jié)果。
[0045]產(chǎn)物純化:采用離心柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(EZ-lOSpin Column PCR ProductPurification Kit)純化PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物送交生工生物工程上海股份有限公司完成測序。
[0046]本發(fā)明所述的兩種產(chǎn)石杉堿甲閩浙馬尾杉菌根真菌genebank登入號分別為:裂裙菌(Schizophyllum commune)MT39 登入號為 KF973228,Chaunopycnis alba MT78 登入號為KF973229。ITS堿基序列為:
【權(quán)利要求】
1.一種閩浙馬尾杉菌根真菌，命名為裂裙菌(Schizophyllum commune)MT39,其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC M2013642。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的閩浙馬尾杉菌根真菌，其特征在于，它的顯微形態(tài)為:菌絲棉花狀，有隔，分枝，不產(chǎn)孢子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的閩浙馬尾杉菌根真菌，其特征在于，它的基因組ITS特征堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛇足石杉菌根真菌，其特征在于，它的菌落培養(yǎng)特征為:PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)第二天開始出現(xiàn)菌絲球，第五天菌絲球直徑變大，發(fā)酵液變粘稠，發(fā)酵液開始變淡黃色，第九天顏色變深，發(fā)酵液變得非常粘稠，其菌落形態(tài)為:正面白色，菌絲發(fā)達，細膩，背面黃白色。
5.—種閩浙馬尾杉菌根真菌,命名為(Chaunopycnis alba)MT78,其保藏單位和保藏號為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC M2013643。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的閩浙馬尾杉菌根真菌，其特征在于，它的顯微形態(tài)為:菌絲分枝，無隔，孢子梨形，單胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的閩浙馬尾杉菌根真菌，其特征在于，它的基因組ITS特征堿基序列為:SEQ ID NO:2.
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的閩浙馬尾杉菌根真菌，其特征在于，它的固體培養(yǎng)菌落特征為:PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，第三天明顯生長大量菌絲呈顆粒狀，第五天發(fā)酵液變無色粘稠狀液體，第九天菌絲集結(jié)成團。其菌落形態(tài)為:正面白色，菌絲細小，呈薄膜狀，有葉脈狀凸起，呈放射狀，背面呈脈狀放射裂紋，黃白色。
9.一種閩浙馬尾杉菌根真菌制備石杉堿甲的方法，其特征在于，包括下列步驟: (1)取如權(quán)利要求1或5任一項所述的閩浙馬尾杉菌根真菌，在無菌條件下，用接種針挑取菌絲，接入已滅菌過的固體PDA培養(yǎng)基試管，于28°C活化48小時； (2)取活化后的菌種，在無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的液體PDA培養(yǎng)基，于28°C在140rpm搖床培養(yǎng)72小時，得種子液； (3)將制備好的種子液接入液體PDA培養(yǎng)基中，于28°C下140rpm搖床培養(yǎng)10天； (4)發(fā)酵完后，加入2%酒石酸 ，靜置過夜，超聲兩次,每次各40min，抽濾收集上清液，用氨水調(diào)節(jié)至PH值為9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60°C回收二氯甲烷，用甲醇溶解殘留物得到石杉堿甲初提物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或5任一項所述的閩浙馬尾杉菌根真菌制備石杉堿甲的應用。
【文檔編號】C12P17/12GK103834577SQ201410044946
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月7日
【發(fā)明者】吳水生, 劉海元, 張方方, 鄭雅媗 申請人:福建中醫(yī)藥大學