一種誘導(dǎo)蛇足石杉離體葉狀體高產(chǎn)石杉堿甲的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)蛇足石杉離體葉狀體高產(chǎn)石杉堿甲的方法，即離體誘導(dǎo)和篩 選高產(chǎn)石杉堿甲的蛇足石杉葉狀體株系的方法，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb.ex Murray) Trev.，又名千層塔、蛇足石松、 蛇足草等，為石杉科石杉屬蕨類植物，全草入藥。自1972年國內(nèi)首次報(bào)道該植物中的生物 堿-石杉堿甲（hupenine A，Hup-A)具有橫紋肌松馳作用，以后深入研究發(fā)現(xiàn)該生物堿是 一種強(qiáng)效、可逆和高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑。在低劑量Hup-A下對乙酰膽堿酯酶(Ach E)有強(qiáng)大的抑制作用，使分布區(qū)內(nèi)神經(jīng)突觸間隙的乙酰膽堿(Ach)含量明顯升高，從而增強(qiáng) 神經(jīng)元興奮傳導(dǎo)，強(qiáng)化學(xué)習(xí)與記憶腦區(qū)的興奮作用，起到提高認(rèn)知功能、增強(qiáng)記憶保持和促 進(jìn)記憶再現(xiàn)的作用，它是目前國內(nèi)最為成功的治療阿爾茨海默病(老年性癡呆癥）的藥物。 隨著老年化社會(huì)到來，阿爾茨海默病(老年性癡呆癥）已成為人類的第四大病魔，蛇足石杉 是我國特有植物，由于蛇足石杉等石杉科植物生長于深山密林，生境條件特殊，很難解決石 杉科植物大面積的人工栽培。近年來人們大量挖采掠奪野生資源，直接導(dǎo)致國際市場上 Hup-A的供應(yīng)缺口加大，自然千層塔資源匱乏凸顯。
[0004] 自2012年本專利發(fā)明人離體培養(yǎng)蛇足石杉葉狀體成功以來，深入廣泛開展研究， 發(fā)明了"一種產(chǎn)石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導(dǎo)和增殖的培養(yǎng)方法"和"一種產(chǎn)石杉堿 甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系"，利用上述專利技術(shù)又發(fā)明了"一種誘導(dǎo)蛇足 石杉離體葉狀體高產(chǎn)石杉堿甲的方法"，利用本項(xiàng)發(fā)明轉(zhuǎn)化生產(chǎn)應(yīng)用可獲得大量的蛇足石 杉葉狀體高產(chǎn)石杉堿甲藥物的植物資源，將產(chǎn)生極其重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)蛇足石杉離體葉狀體高產(chǎn)石杉堿甲的方法。
[0006] 本發(fā)明所述方法步驟如下： (1) 所用材料:材料為離體培養(yǎng)建立的蛇足石杉葉狀體組織塊，該材料制備方法已申請 專利，（專利號(hào)ZL201210005499.6，專利名稱"一種產(chǎn)石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導(dǎo) 和增殖的培養(yǎng)方法"），上述專利的發(fā)明人即本專利的發(fā)明人； (2) 葉狀體組織塊分割:在無菌條件下，將葉狀體組織塊分成單片葉狀體備用； (3) 誘導(dǎo)葉狀體:將單片葉狀體分別置于3%-6%雙氧水中，浸泡7~15 min，棄雙氧水處 理液，然后用無菌水重復(fù)多次洗去雙氧水殘液，將葉狀體接種到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)； (4) 葉狀體株系恢復(fù)生長過程:誘導(dǎo)材料接種在繼代培養(yǎng)基上第三天至第十五天葉狀 體幾乎全變白色，直到20天后，誘導(dǎo)的葉狀體能長出綠色的培養(yǎng)物，以后生長速度加快，50 天左右形成葉狀體組織塊。
[0007] (5)葉狀體株系構(gòu)建：當(dāng)代誘導(dǎo)的葉狀體培養(yǎng)50天后，取半致死劑量處理的恢復(fù)生 長的培養(yǎng)物建立株系，將每塊葉狀體組織塊分割后建成單個(gè)株系，并標(biāo)記株系代號(hào)，以后按 株系繼代擴(kuò)大培養(yǎng)，每50天為繼代周期，連續(xù)培養(yǎng)5代，以高效液相色譜法檢測每個(gè)株系的 石杉堿甲含量(ug/g); (6) 重復(fù)誘導(dǎo)篩選高產(chǎn)石杉堿甲葉狀體株系:選取石杉堿甲含量較高的葉狀體株系，重 復(fù)步驟(2)、（3)，取半致死劑量為3%雙氧水浸泡13~15分鐘脅迫誘導(dǎo)葉狀體，經(jīng)步驟(4)和 (5)，定向篩選高產(chǎn)石杉堿甲的葉狀體株系； (7) 葉狀體株系分割繼代:分別從每株系取一小部分葉狀體切割成小塊作繼代，接種到 繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每45~50天轉(zhuǎn)代一次，分別建成葉狀體無性繁殖株系； (8) 高產(chǎn)石杉堿甲葉狀體株系的建立與鑒定:每株系繼代剩余的另一大部分葉狀體培 養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)25~35天后收獲，用作提取檢測石杉堿甲含量，連續(xù)培養(yǎng)收獲5代，世代間石 杉堿甲含量高且重復(fù)一致的株系，鑒定為高產(chǎn)石杉堿甲葉狀體株系。
[0008] 所述繼代培養(yǎng)基按下列成份組成并進(jìn)行配制： 誘導(dǎo)后葉狀體生長繼代培養(yǎng)基：1/4MS+蔗糖2.5%+瓊脂粉0.6%;培養(yǎng)基的pH值5.8~ 6.0,并在0.1 MPa高溫高壓下滅菌25min后使用。
[0009] 所述培養(yǎng)條件如下： 培養(yǎng)參數(shù):恒溫23±2°C，相對濕度60%~70%，光照強(qiáng)度為1500~18001x，日照時(shí)長13~ 15 h/d； 葉狀體誘導(dǎo)半致死劑量為3%雙氧水處理13~15分鐘，篩選獲得高產(chǎn)株系的葉狀體生物 量每代鮮重比接種量增加30~35倍、葉狀體每克干重含石杉堿甲60~88微克。
[0010] 對單片葉狀體誘導(dǎo)試劑為3%-6%雙氧水，浸泡7~15 min，然后用無菌水洗凈殘 液;接種恢復(fù)生長，建立株系、繁殖5代，并檢測葉狀體株系的生長量和累積石杉堿甲含量， 選著優(yōu)良的葉狀體株系繼續(xù)重復(fù)誘導(dǎo)，定向篩選石杉堿甲高生產(chǎn)率的葉狀體株系。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)效果是:蛇足石杉離體培養(yǎng)葉狀體再生僅發(fā)明人有成功報(bào)道和授權(quán) 專利（ZL2012100005499.6)。鑒于蛇足石杉離體培養(yǎng)是開發(fā)生產(chǎn)原植物源藥用石杉堿甲 (Hup-A)資源的重要技術(shù)，本發(fā)明又建立了蛇足石杉離體葉狀體每克干重產(chǎn)石杉堿甲60~ 88微克的高產(chǎn)株系，它超過了蛇足石杉母植株每克干重產(chǎn)石杉堿甲58.54微克的含量，突破 了同類研究中的關(guān)鍵技術(shù)。利用這項(xiàng)技術(shù)擴(kuò)大規(guī)模離體培養(yǎng)葉狀體提取生產(chǎn)的藥物石杉堿 甲（Hup-A)將產(chǎn)生極為重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本發(fā)明的誘導(dǎo)方法、培養(yǎng)條件、基質(zhì)配方為蛇足石 杉離體葉狀體增殖高產(chǎn)株系提供了技術(shù)體系。因此，運(yùn)用本發(fā)明的方法進(jìn)行蛇足石杉離體 培養(yǎng)，可獲得大量高產(chǎn)石杉堿甲的葉狀體藥用植物資源。
【附圖說明】
[0012] 圖1蛇足石杉葉狀體誘導(dǎo)高產(chǎn)株系的培養(yǎng)： 圖IA為雙氧水脅迫誘導(dǎo)后培養(yǎng)10天的生長情況； 圖IB為雙氧水脅迫誘導(dǎo)后培養(yǎng)30天的恢復(fù)生長情況； 圖IC為篩選的單株培養(yǎng)系的生長情況； 圖ID為葉狀體來源的野生原植株移植于花缽中供取材的樣本； 圖2高產(chǎn)株葉狀體提取物與原植株提取物、標(biāo)準(zhǔn)品石杉堿甲的高效液相圖譜： 圖2A中箭頭所示標(biāo)準(zhǔn)品石杉堿甲峰； 圖2B中箭頭所示高產(chǎn)株系葉狀體提取物中石杉堿甲峰； 圖2C中箭頭所示野生蛇足石杉原植株枝葉提取物中石杉堿甲峰。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0014] 實(shí)施例1: 〈一〉取本研究室離體培養(yǎng)建立的蛇足石杉葉狀體組織塊； 〈二〉在無菌條件下，將葉狀體組織塊分成單片葉狀體備用； 〈三〉將單片葉狀體分別置于3%濃度的雙氧水中，浸泡時(shí)間7分鐘，棄雙氧水處理液，然 后用無菌水重復(fù)多次洗去雙氧水殘液，將葉狀體接種到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)； 〈四〉誘導(dǎo)處理的葉狀體材料接種在繼代培養(yǎng)基上第三天至第十五天葉狀體幾乎全變 白色，直到20天后，誘導(dǎo)的葉狀體能長出綠色的培養(yǎng)物，以后生長速度加快，50天左右形成 葉狀體組織塊； 〈五〉當(dāng)代誘導(dǎo)的葉狀體培養(yǎng)50--60d后，取半致死劑量處理的恢復(fù)生長培養(yǎng)物建立株 系，將每塊葉狀體組織分割后建成單個(gè)株系，并標(biāo)記株系代號(hào)，以后按株系繼代擴(kuò)大培養(yǎng)， 每50天為繼代周期，連續(xù)培養(yǎng)5代，高效液相法檢測每個(gè)株系的石杉堿甲含量(ug/g); 〈六〉重復(fù)誘導(dǎo)篩選高產(chǎn)石杉堿甲葉狀體株系，選取石杉堿甲含量較高的葉狀體株系， 重復(fù)〈二〉、〈三 >取半致死劑量為3%雙氧水浸泡15分鐘誘導(dǎo)葉狀體、重復(fù)〈四〉、〈五 > 步驟，