利用金屬離子促進(jìn)枯草芽孢桿菌芽孢形成的方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種利用金屬離子促進(jìn)枯草芽孢桿菌芽孢形成的方法，包括步驟：1）制作培養(yǎng)基其中加入0.009-0.02%的MnSO4，制備平板，在4℃保存?zhèn)溆茫?）將枯草芽孢桿菌菌株保存在所述培養(yǎng)基中，"之"字形劃平板，37℃下培養(yǎng)過夜；3）將過夜后的枯草芽孢桿菌菌株進(jìn)行活化，4）將經(jīng)過活化的枯草芽孢桿菌的種子液接種至豆粕或棉籽中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵；5）將發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行烘干至水分≤10-13%、粉碎，即得到富含活性肽蛋白飼料。本發(fā)明的方法縮短了發(fā)酵周期。對發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的條件進(jìn)行了優(yōu)化，對發(fā)酵溫度、pH值、轉(zhuǎn)速以及裝液量進(jìn)行了條件優(yōu)化，得到了效果最佳的發(fā)酵條件，可以顯著提高發(fā)酵生物量的效果，適用于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)。
【專利說明】利用金屬離子促進(jìn)枯草芽孢桿菌芽孢形成的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程中的微生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體涉及一種利用金屬離子促進(jìn)枯草芽孢桿菌芽孢形成的方法，該方法可顯著提高枯草芽孢生物量。
【背景技術(shù)】
[0002]草場的退化和生態(tài)環(huán)境的要求，促進(jìn)了牲畜圈養(yǎng)方式的發(fā)展，圈養(yǎng)方式限制了動物接觸土壤以及其周圍的自然環(huán)境，這種飼養(yǎng)條件下不利于動物建立胃腸道的正常菌群。但外界條件發(fā)生變化時，容易導(dǎo)致動物胃腸道微生態(tài)菌群失調(diào)，從而降低對病原菌的抵抗力。目前主要是通過改善飼養(yǎng)管理和在飼料中添加微生物來降低這種損失，但是隨著抗生素的廣泛使用導(dǎo)致的耐藥性和殘留問題日益凸現(xiàn)出來，引起了從科學(xué)工作者到普通消費(fèi)者的高度關(guān)注。益生素因其安全性、無殘留、有利于生態(tài)環(huán)境的持續(xù)性發(fā)展等優(yōu)點(diǎn)成為抗生素替代品更是益生素中使用更為廣泛的一種微生態(tài)制劑。
[0003]飼料級微生物添加劑是近年來發(fā)展起來的一類新型飼料添加劑，在提高飼料利用率，增加生產(chǎn)性能，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，增加免疫力等方面具有顯著的促進(jìn)作用。目前在飼料及動物生產(chǎn)上使用較多的微生物有乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌及光合細(xì)菌，其中芽孢桿菌具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫高壓、耐酸堿膽鹽、易貯存等獨(dú)特的生物特性，從動物生產(chǎn)和飼料工業(yè)角度評價，其能更好地滿足飼料用微生物現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)的要求。
[0004]枯草芽孢桿菌在代謝過程種可產(chǎn)生大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及其他有益因子，進(jìn)入生物體內(nèi)后能快速定殖，在腸道內(nèi)形成良好的微生態(tài)環(huán)境，具有加強(qiáng)動物消化能力，降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，增加飼料利用率，增強(qiáng)動物免疫力等功效。我國農(nóng)業(yè)部公布的可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌種中就包括了枯草芽孢桿菌，其作為安全益生菌，現(xiàn)已在飼料領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
[0005]但是，現(xiàn)報道生產(chǎn)的微生物菌株存在諸多問題，如發(fā)酵時間長(因此容易引起霉變)、發(fā)酵過程水分過高，抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解不徹底、發(fā)酵后粗蛋白和小肽(酸溶蛋白)含量不聞等問題。
[0006]目前對枯草芽孢桿菌的研究主要集中在抑菌作用、抑菌物質(zhì)的分離純化與表征、以及枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性的應(yīng)用效果研究等。但是，在相同條件下獲得更多生物量的枯草芽孢桿菌同樣具有重要意義。而現(xiàn)有技術(shù)中雖有少量報道，且效果均不明顯。
[0007]目前國內(nèi)眾多枯草芽孢桿菌生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)過程中普遍存在菌數(shù)偏低特別是芽孢率偏低的問題，一般芽孢含量在2.0 X 109CFU/ml以下，大大影響了產(chǎn)品的成本以及質(zhì)量。為此，采取措施提高枯草芽孢桿菌的芽孢率是十分必要的。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的通過調(diào)整培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵條件，獲得更多生物量的枯草芽孢桿菌，在發(fā)酵過程中盡快達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，縮短發(fā)酵周期。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用以下技術(shù)方案:[0010]一種利用金屬離子促進(jìn)枯草芽孢桿菌芽孢形成的方法，所述方法包括步驟:
[0011]I)使用0.4-0.6%的玉米淀粉，1.8-2.2%的玉米面，3%的蔗糖，1-1.4%的豆芽汁，0.075% 的 MgSO4,0.25% 的 KH2PO4,0.8% 的 CaCO3, 0.009-0.02% 的 MnSO4,余量為蒸溜水制作培養(yǎng)基，經(jīng)120-125°C高壓滅菌20min，制備平板；每塊平板倒入15_20mL超凈臺中冷卻凝固后，加蓋板，封口，在4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0012]2)將購買得到的枯草芽孢桿菌菌株保存在所述培養(yǎng)基中，置于室溫下的超凈臺中，用經(jīng)高壓滅菌過的牙簽蘸取培養(yǎng)基，然后〃之〃字形劃平板，37°C下培養(yǎng)過夜；
[0013]3)將過夜后的枯草芽孢桿菌菌株接種于所述培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，其中，枯草芽孢桿菌菌株與與培養(yǎng)基之比為1:25，放置于發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵溫度35-37°C，pH 值 7.0-7.2，轉(zhuǎn)速 180-220r/min，通氣培養(yǎng) 24h ；
[0014]4)將經(jīng)過活化的枯草芽孢桿菌的種子液接種至豆柏或棉籽中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，接種量OD6tltl為豆柏或棉籽重量的8~12% ;接種時進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，發(fā)酵過程中監(jiān)測溫度變化，溫度高于50°C時，進(jìn)行翻料處理，發(fā)酵時間為48h ；
[0015]5)將發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行烘干至水分≤10-13%、粉碎，粉碎細(xì)度45~55目，即得到富含活性肽蛋白飼料。
[0016]所述步驟I)中，MnSO4S 0.01%，玉米淀粉為0.5%，玉米面為2%，豆芽汁為1-1.4%。
[0017]所述步驟3對枯草芽孢桿菌菌株接種于所述培養(yǎng)基中進(jìn)行活化的培養(yǎng)條件為:溫度36。。，壓力0.lOKpa，通氣量:120m3/h，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，接種量4%，ρΗ7.0。
[0018]所述步驟4)中，種`子液接種至豆柏或棉籽中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的接種量0D_為豆柏或棉籽重量的10%。
[0019]本發(fā)明的方法使發(fā)酵過程中盡快達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，縮短了發(fā)酵周期。促進(jìn)枯草芽孢桿菌提早產(chǎn)生芽孢，從而盡快結(jié)束發(fā)酵過程。
[0020]本發(fā)明還對發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的條件進(jìn)行了優(yōu)化，對發(fā)酵溫度、pH值、轉(zhuǎn)速以及裝液量進(jìn)行了條件優(yōu)化，得到了效果最佳的發(fā)酵條件，適用于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)。
[0021]本發(fā)明對培養(yǎng)基配方進(jìn)行了調(diào)整，獲得了可以顯著提高發(fā)酵生物量的效果。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0023]解決該技術(shù)方案的要點(diǎn)是在工業(yè)培養(yǎng)基中加入適量的硫酸錳，Mn2+能夠促進(jìn)枯草芽孢桿菌提早產(chǎn)生芽孢，從而盡快結(jié)束發(fā)酵過程，為枯草芽孢桿菌在生防領(lǐng)域的應(yīng)用奠定堅實(shí)的基礎(chǔ)。
[0024]本發(fā)明的利用金屬離子促進(jìn)枯草芽孢桿菌芽孢形成的方法包括如下步驟:
[0025]步驟I，枯草芽孢桿菌的活化
[0026]活化培養(yǎng)基的平板制備:使用0.5%的玉米淀粉，2%的玉米面，3%的蔗糖，1.2%的豆芽汁，0.075% 的 MgSO4,0.25% 的 KH2PO4,0.8% 的 CaCO3,0.01% 的 MnSO4,余量為蒸溜水，經(jīng)121°C高壓滅菌20min，制備平板；每塊平板倒入15_20mL超凈臺中冷卻凝固后，加蓋板，封
口，在4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027]將購買得到的枯草芽孢桿菌菌株保存在培養(yǎng)基中，置于室溫下的超凈臺中，用經(jīng)高壓滅菌過的牙簽蘸取培養(yǎng)基，然后〃之〃字形劃平板，37°C下培養(yǎng)過夜。
[0028]將過夜后的枯草芽孢桿菌菌株接種于所述液體活化培養(yǎng)基中，其中，枯草芽孢桿菌菌株與與培養(yǎng)基之比為1:25，放置于發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵溫度37°C，通氣培養(yǎng) 24h, pH 值 7.0，轉(zhuǎn)速 200r/min。
[0029]步驟2，將經(jīng)過活化的枯草芽孢桿菌的種子液接種至豆柏或棉籽中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，接種量OD6tltl為豆柏或棉籽重量的8~12% ;接種時進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，發(fā)酵過程中監(jiān)測溫度變化，溫度高于50°C時，進(jìn)行翻料處理，發(fā)酵時間為48h。
[0030]步驟3，將發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行烘干至水分< 10%、粉碎，粉碎細(xì)度45~55目，即得到富含活性肽蛋白飼料。
[0031]為了獲得最佳效果，各種參數(shù)的優(yōu)化是通過以下實(shí)驗(yàn)測試獲得:
[0032]枯草芽孢桿菌生長曲線的測定
[0033]將枯草芽孢桿菌活化后，以4%的接種量接種到所述液體培養(yǎng)基中，所述液體培養(yǎng)基的PH值控制在7.0-7.2 ;使用裝液量IOOmL或300mL，在30°C、200r/min下培養(yǎng)，分別采用分光光度法和平板菌落計數(shù)法測定不同培養(yǎng)時間時的OD6c?值和菌落數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、分別以O(shè)D6c?值和菌落數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長曲線圖。生長曲線確定枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)時間為16h。
[0034]培養(yǎng)基的調(diào)整以及對枯草芽孢桿菌發(fā)酵生物量的影響
[0035]以如下質(zhì)量百分比，配比制成的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基:3%的蔗糖，0.075%的MgSO4,0.25% 的 KH2PO4,0.8% 的 CaCO3,0.01% 的 MnSO4,余量為蒸餾水；
[0036]在上述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)之上，以不同質(zhì)量百分比的玉米淀粉、玉米面和豆芽汁分別加入到培養(yǎng)基中，比較不同添加量對枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響。其中，
[0037]以玉米淀粉添加量為橫坐標(biāo)，OD600增長量為縱坐標(biāo)作圖，將菌懸液稀釋10倍后測定OD6c?結(jié)果表明，隨著玉米淀粉添加量的增加，0D_增長量也不斷提高:當(dāng)玉米淀粉添加量為0.5%時，枯草芽孢桿菌的0D_增長量達(dá)到最高，為0.619。
[0038]以玉米面添加量為橫坐標(biāo)，0D_增長量為縱坐標(biāo)。結(jié)果表明，玉米面添加量在
2.0%, 0D600增長量最高，為1.147。
[0039]以豆芽汁添加量為橫坐標(biāo)，0D_增長量為縱坐標(biāo)。結(jié)果表明，豆芽汁添加量在
1.2%, 0D600增長量最高，為1.213。
[0040]同時添加玉米淀粉、玉米面以及豆芽汁三種添加物對枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響:
[0041]在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別以上述三個實(shí)驗(yàn)獲得的最佳添加量同時添加，OD600增長量為縱坐標(biāo)，將菌懸液稀釋10倍后測定0D_。結(jié)果表明，當(dāng)添加上述的三種物質(zhì)后，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的發(fā)酵相比，枯草芽于包桿菌的細(xì)胞生物量有顯著提高，OD值增長量達(dá)到
0.9240。
[0042]在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，玉米淀粉、玉米面以及豆芽汁三種添加物分別以上述實(shí)驗(yàn)獲得的最佳添加量添加，調(diào)節(jié)枯草芽于包桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的MnSO4分別為0.02%,
0.015%，0.01%, 0.0095%, 0.009%, OD600增長量為縱坐標(biāo)，將菌懸液稀釋10倍后測定0D6(I(I。結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的MnSO4添加量為當(dāng)0.01%,與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的發(fā)酵相比，枯草芽于包桿菌的細(xì)胞生物量有顯著提高，OD600值增長量達(dá)到0.95%。[0043]培養(yǎng)條件的優(yōu)化pH值
[0044]培養(yǎng)基初始pH值對枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
[0045]在上述優(yōu)化的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)枯草芽于包桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別為
4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0、10.0，以培養(yǎng)基初始pH值為橫坐標(biāo)，以0D600增長量為縱坐標(biāo)，將菌懸液稀釋10倍后測定0D600。
[0046]結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高，其0D600增長量也隨之增加:當(dāng)pH值為
7.0時，枯草芽孢桿菌的0D600增長量達(dá)到最高為0.731。
[0047]培養(yǎng)溫度對枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
[0048]將枯草芽孢桿菌以5%的接種量接種到己優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別置于26°C、30 V、36°C、40°C、46°C、50°C下，在200r/min條件下培養(yǎng)16h，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD6tltl增長量為縱坐標(biāo)，將菌懸液稀釋10倍后測定0D_，結(jié)果表明，當(dāng)溫度為36°C時，枯草芽孢桿菌的OD6tltl值最高，為0.6870。
[0049]轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌細(xì)胞生物量的影響
[0050]將枯草芽孢桿菌以4%的接種量接種到己優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在lOOrpm、130rpm、170rpm、200rpm、230rpm、260rpm的轉(zhuǎn)速下，在36°C培養(yǎng)16h。以轉(zhuǎn)速為橫坐標(biāo)，以0D_增長量為縱坐標(biāo)，將菌懸液稀釋10倍后測定。結(jié)果表明，隨著轉(zhuǎn)速的增加，枯草芽孢桿菌的OD6tltl增長量上升，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200r/min時，OD600增長量達(dá)到最大值，為0.885。
[0051]本發(fā)明的方法使枯草芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢率從50%提升至95%以上，產(chǎn)芽孢的時間從調(diào)整前的46-50小時縮短為調(diào)整后的15-17小時，大大提高了生產(chǎn)效率?？莶菅挎邨U菌的芽孢率可從50%提升到95%以上，比優(yōu)化前提高了 1.9倍。
[0052]枯草芽孢桿茵茵株的生理特性和代謝特性:
[0053]枯草芽孢桿菌易培養(yǎng)，能利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉等多種有機(jī)物質(zhì)，是需氧菌，能夠迅速消耗環(huán)境中得到游離氧，可以作為動物腸道菌培養(yǎng)，造成腸道低氧，促進(jìn)有益厭氧菌生長。
[0054]枯草芽孢桿菌發(fā)酵有機(jī)物可產(chǎn)生乳酸、丙酸等有機(jī)酸。
[0055]枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的生物酶種類較多，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等。在大豆分離蛋白、酪蛋白等培養(yǎng)基上有明顯的水解圈，顯示出較高蛋白酶活性。在淀粉平板上，經(jīng)過碘染色觀察有透明圈，顯示出淀粉水解酶活性。
[0056]枯草芽孢桿菌能夠分泌豐富的蛋白酶等酶系，具有顯著的發(fā)酵豆柏或棉籽的能力。利用該菌株及相應(yīng)的發(fā)酵工藝對豆柏或棉籽進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵處理，可降解豆柏或棉籽粉中大分子量的蛋白質(zhì)，使其轉(zhuǎn)化成具有生物活性的小肽蛋白，促進(jìn)了動物的吸收。同時，豆柏或棉籽發(fā)酵后其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗原蛋白得到了有效地降解，顯著提高豆柏或棉籽的營養(yǎng)品質(zhì)，提高動物對豆柏或棉籽的利用效率并改善動物腸道和促進(jìn)健康。
[0057]使用該菌株發(fā)酵豆柏后顯著改善了豆柏或棉籽的營養(yǎng)價值，測定一些指標(biāo)結(jié)果為:發(fā)酵豆柏或棉籽的粗蛋白含量達(dá)到51%以土，酸溶蛋白含量達(dá)到8%以上，活菌數(shù)達(dá)到40億個/克發(fā)酵豆柏或棉籽，揮發(fā)性鹽基氮低于50mg/100g，同時含有較高的蛋白酶活性。
[0058]發(fā)酵后的豆柏或棉籽蛋白含量可以達(dá)到5%以上，酸溶蛋白等小肽含量提高明顯，可以提高10%以上，乳酸含量提高2%以上。發(fā)酵產(chǎn)物中，富含蛋白酶、淀粉酶等豐富的酶系，可以降解豆柏或棉籽中的抗?fàn)I養(yǎng)因子等有害物質(zhì)。同時，發(fā)酵豆柏或棉籽中含有大量的抗逆性較強(qiáng)的枯草芽孢桿菌芽孢，便于貯存和運(yùn)輸。在動物食用后，枯草芽孢桿菌在腸道內(nèi)迅速繁殖，顯著抑制有害菌的生長，改善動物腸道健康，提高飼料的利用率，改善動物營養(yǎng)水平，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。
[0059]以上所述的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用金屬離子促進(jìn)枯草芽孢桿菌芽孢形成的方法，其特征在于，所述方法包括步驟: 1)使用0.4-0.6%的玉米淀粉，1.8-2.2%的玉米面，3%的蔗糖，1-1.4%的豆芽汁，0.075%的 MgSO4,0.25% 的 KH2PO4,0.8% 的 CaCO3,0.009-0.02% 的 MnSO4,余量為蒸溜水制作培養(yǎng)基，經(jīng)120-125°C高壓滅菌20min，制備平板；每塊平板倒入15_20mL超凈臺中冷卻凝固后，加蓋板，封口，在4°C保存?zhèn)溆茫? 2)將購買得到的枯草芽孢桿菌菌株保存在所述培養(yǎng)基中，置于室溫下的超凈臺中，用經(jīng)高壓滅菌過的牙簽蘸取培養(yǎng)基，然后〃之〃字形劃平板，37°C下培養(yǎng)過夜； 3)將過夜后的枯草芽孢桿菌菌株接種于所述培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，其中，枯草芽孢桿菌菌株與與培養(yǎng)基之比為1:25，放置于發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵溫度35-37°C，pH值7.0-7.2，轉(zhuǎn)速 180-220r/min，通氣培養(yǎng) 24h ； 4)將經(jīng)過活化的枯草芽孢桿菌的種子液接種至豆柏或棉籽中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，接種量OD600為豆柏或棉籽重量的8?12% ;接種時進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，發(fā)酵過程中監(jiān)測溫度變化，溫度高于50°C時，進(jìn)行翻料處理，發(fā)酵時間為48h ； 5)將發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行烘干至水分<10-13%、粉碎，粉碎細(xì)度45?55目，即得到富含活性肽蛋白飼料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)枯草芽孢桿菌芽孢形成的方法，其特征在于，所述步驟I)中，MnSO4 為 0.01%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促進(jìn)枯草芽孢桿菌芽孢形成的方法，其特征在于，所述步驟O中，玉米淀粉為0.5%，玉米面為2%，豆芽汁為1-1.4%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的促進(jìn)枯草芽孢桿菌芽孢形成的方法，其特征在于，所述步驟3對枯草芽孢桿菌菌株接種于所述培養(yǎng)基中進(jìn)行活化的培養(yǎng)條件為:溫度36°C，壓力0.lOKpa，通氣量:120m3/ h，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，接種量4%，pH 7.00
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促進(jìn)枯草芽孢桿菌芽孢形成的方法，其特征在于，所述步驟4)中，種子液接種至豆柏或棉籽中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的接種量OD6tltl為豆柏或棉籽重量的10%。
【文檔編號】C12R1/125GK103766586SQ201410045030
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月7日
【發(fā)明者】程淑琴 申請人:范紅玉