一種基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，通過核酸互補雜交，目標miRNA可以特異性識別與三元探針并形成穩(wěn)定的三元雜交結(jié)構(gòu)；三元雜交結(jié)構(gòu)中的三元引物沿著三元模板起始鏈置換擴增反應并產(chǎn)生大量的SDA模板產(chǎn)物；SDA模板產(chǎn)物可以打開雙功能發(fā)卡探針，最終觸發(fā)切口酶信號放大反應，循環(huán)酶切分子信標，產(chǎn)生級聯(lián)放大的熒光信號。本發(fā)明可以檢測低至100fM的miRNA；該檢測方法具有超高的特異強，能夠很好區(qū)分不同錯配位置的高度同源序列，從而解決了現(xiàn)有檢測方法中由于特異性不強而導致假陽性結(jié)果的難題。
【專利說明】—種基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于miRNA檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]MiRNA是一類細胞內(nèi)源性非蛋白編碼單鏈RNA分子，其長度約為18~25個堿基，廣泛存在于真核生物中。MiRNA源于胞內(nèi)miRNA基因的轉(zhuǎn)錄，整個過程與其它基因的轉(zhuǎn)錄同步，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為由幾百個核苷酸組成的pr1-miRNA。Pri_miRNA在核內(nèi)經(jīng)過酶切，最終形成帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNA (pre-miRNA,約為70個堿基)。之后，pre_miRNA會進入細胞質(zhì)，并被Dicer酶加工為成熟的miRNA。而成熟的miRNA可與信使RNA (mRNA)的非編碼區(qū)作用，形成基因沉默復合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC)抑制mRNA的蛋白表達。大量研究表明，超過60%的哺乳動物的編碼基因都受到miRNA的調(diào)控。miRNA在細胞的增殖、凋亡、分化以及腫瘤的發(fā)病機制中扮演著重要的調(diào)控作用，細胞miRNA的表達水平與人類疾病特別是癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以作為標志物用于一些癌癥的早期診斷。
[0003]由于大部分miRNA分子在細胞內(nèi)的表達程度比較低、存在多種相似程度極高的同源序列、序列過短等特點，發(fā)展高選擇性、高靈敏度、簡單、快速的miRNA檢測方法顯得尤為重要。目前，miRNA的檢測方法仍然以傳統(tǒng)方法包括Northern印跡法、原位雜交法以及基因芯片技術(shù)為主，其中Northern印跡法作為miRNA檢測的標準方法被廣泛應用。然而，這些檢測方法的靈敏度較低，選擇性一般，需要多步、耗時反應，洗滌過程繁雜，樣品需求量大。近來，多種基于核酸擴增技術(shù)的miRNA檢測方法陸續(xù)發(fā)展起來，如RT-PCR、RCA、EXPAR等。其中，RT-PCR是研究最多、應用最廣的檢測方法。該方法首先通過特殊引物對miRNA進行反轉(zhuǎn)錄反應，得到響應的cDNA ;在以cDNA為模板進行實時熒光PCR，實現(xiàn)信號的指數(shù)擴增。該方法靈敏度高，同時能區(qū)分單堿基錯配的同源序列。然而，該方法需要設(shè)計復雜的引物，還需要對miRNA進行反轉(zhuǎn)錄反應；更為重要的是，PCR需要使用昂貴的熱循環(huán)儀器。相對于RT-PCR，基于RCA、EXPAR等恒溫擴增技術(shù)發(fā)展起來的檢測方法更簡單、更直接。然而這些方法存在強烈的非特異性擴增信號，選擇性較差或者耗時長等缺點。因此，發(fā)展一種簡單、直接、快速、高靈敏、高選擇性的miRNA檢測方法依舊是一個挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)選擇性不高、設(shè)計復雜、耗時長等缺點。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0006]一種基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒，包括:
[0007]能夠與miRNA形成三元雜交結(jié)構(gòu)的組合物，包括3_WJ引物和3_WJ模板，3-ffJ弓丨物由兩部分序列組成:其5’端部分與目的miRNA3’端部分互補，3’端部分與3-WJ模板的中間段互補；3-WJ模板由三部分序列組成:其5’端部分與目的miRNA5’端部分互補，中間段與3-WJ引物3’端部分互補，其3’端部分為含核酸切口酶識別位點的SDA模板區(qū)域；
[0008]擴增底物，包括dNTPs混合物；
[0009]DNA分子機器工具，包括具有鏈置換擴增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；SDA模板與目的miRNA雜交后觸發(fā)DNA分子機器工具，產(chǎn)生SDA模板產(chǎn)物；
[0010]具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的發(fā)卡分子H，能夠與SDA模板產(chǎn)物相識別，在識別后雜交打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)；
[0011]具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標探針，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，分子信標探針具有能夠與被打開的發(fā)卡分子H相互補的序列；
[0012]以及DNA分子機器擴增反應緩沖液。
[0013]所述3-WJ引物與3-WJ模板有5~7個堿基的互補，3_WJ引物:3_WJ模板的摩爾比為1:1;
[0014]發(fā)卡分子H與SDA模板產(chǎn)物互補，也與分子信標探針互補，該互補序列中含有Nt.BbvCI的酶切位點；發(fā)卡探針與分子信標的摩爾比為1:5 ;
[0015]DNA聚合酶與核酸切口酶的濃度為2.5U和0.8U。
[0016]所述反應緩沖液為:50mMNaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA,pH7.9 ;反應體積為20 μ L，反應溫度為37°C，反應時間為30min。 [0017]所述的3WJ-模板的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示；
[0018]3WJ-引物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示；
[0019]SDA模板產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.3所示；
[0020]發(fā)卡分子H的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.4所示；
[0021]分子信標探針的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5所示，其兩端分別標記有熒光基團FAM和淬滅基團DABCYL。
[0022]一種基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測方法，包括以下步驟:
[0023]I)通過核酸互補雜交，目標miRNA特異性識別3_WJ引物、3_WJ模板并形成穩(wěn)定的三元雜交結(jié)構(gòu)；
[0024]2)將三元雜交結(jié)構(gòu)與擴增底物、DNA分子機器工具、具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的發(fā)卡分子H、分子信標探針以及DNA分子機器擴增反應緩沖液混合；
[0025]3)在三元雜交結(jié)構(gòu)存在的情況下，DNA聚合酶識別3_WJ引物與3_WJ模板的SDA模板區(qū)域形成的擴增起始位置，并進行擴增，待擴增至一定長度后，擴增產(chǎn)物中的核酸切口酶識別位點被識別并在擴增鏈的相應位點發(fā)生切割，產(chǎn)生SDA產(chǎn)物，而三元雜交結(jié)構(gòu)中的SDA模板區(qū)域繼續(xù)被擴增；
[0026]4)擴增所獲得的SDA產(chǎn)物觸發(fā)打開發(fā)卡分子H構(gòu)成雜交體，發(fā)卡結(jié)構(gòu)H被打開后，暴露出的與分子信標互補的區(qū)域，從而破壞分子信標的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分子信標與雜交體構(gòu)成雙鏈結(jié)構(gòu)，其熒光恢復；而分子信標參與形成的雙鏈互補結(jié)構(gòu)中還含有核酸切口酶識別位點，在形成雙鏈結(jié)構(gòu)后該位點被識別，并在分子信標序列上進行切割；被切割的分子信標從雙鏈結(jié)構(gòu)上脫落產(chǎn)生熒光信號，而SDA產(chǎn)物與發(fā)卡分子H構(gòu)成的雜交體再打開新的分子信標，以產(chǎn)生更多的突光信號；
[0027]5)待達到規(guī)定的反應時間后，檢測熒光信號，對熒光信號分析得到待測溶液中miRNA的含量，在一定范圍內(nèi)，miRNA濃度越高，則熒光信號越強。[0028]所述3-WJ引物與3-WJ模板有5~7個堿基的互補，3_WJ引物:3_WJ模板的摩爾比為1:1;
[0029]發(fā)卡分子H與SDA模板產(chǎn)物互補，也與分子信標探針互補，該互補序列中含有Nt.BbvCI的酶切位點；發(fā)卡探針與分子信標的摩爾比為1:5 ;
[0030]DNA聚合酶與核酸切口酶的濃度為2.5U和0.8U ；
[0031]所述反應緩沖液為:50mMNaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA,pH7.9 ;反應體積為20 μ L，反應溫度為37°C，反應時間為30min。
[0032]所述SDA產(chǎn)物與發(fā)卡結(jié)構(gòu)有18個bp的互補序列，可以在37°C相互雜交從而打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
[0033]所述SDA模板區(qū)域中含有Nt.BbvCI識別雙鏈中不被切割的單鏈序列3’ -GGAGTCG-5’ ；為了防止發(fā)卡分子H自身3’端的非特異性擴增影響單鏈觸發(fā)的效率，發(fā)卡分子H的3’端修飾有磷酸基團。
[0034]所述發(fā)卡分子H的序列含有Nt.BbvCI識別雙鏈中不被切割的單鏈序列3’ -GGAGTCG-5’，發(fā)卡分子H沒有被打開時，發(fā)卡分子H和分子信標均是莖環(huán)結(jié)構(gòu)不發(fā)生作用；當發(fā)卡被打開后有12個bp與分子信標互補形成雙鏈并且被Nt.BbvCI識別切斷，切斷的兩段分子信標均不能夠在37°C下和發(fā)卡分子H形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)而和發(fā)卡分子H分開，被打開的發(fā)卡分子H能夠循環(huán)的打開多個分子信標，使熒光信號放大。
[0035]所述檢測中的反應溫度為37°C，反應時間為30分鐘。
[0036]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0037]1.本發(fā)明提供的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，采用一步法操作，只需要一步操作就可以完成酶協(xié)同級聯(lián)恒溫擴增反應；
[0038]2.本發(fā)明提供的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，具有超高的選擇性，經(jīng)試驗驗證可以很好地區(qū)分同族的各種錯配序列；
[0039]3.本發(fā)明提供的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，具有高靈敏度，級聯(lián)擴增的設(shè)計，可以提高靈敏度到IOOfM;
[0040]4.本發(fā)明提供的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，設(shè)計簡單，不需要涉及納米材料的合成和修飾等，反應快速，只需要30分鐘；
[0041 ] 5.與傳統(tǒng)的Northern印跡分析方法相比，本發(fā)明提供的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，上樣量很少，可以實現(xiàn)微量操作，尤其有利于檢測物中miRNA含量很少的情況，具有很高的適用范圍；
[0042]6.與實時定量PCR相比，本發(fā)明提供的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，由于采用的恒溫反應，無需使用昂貴的熱循環(huán)儀，應用范圍更廣泛；
[0043]7.本發(fā)明提供的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，具有通用性強，可以用于檢測所有物種的miRNA，包括3’末端甲基化的miRNA ;并且只需改變?nèi)结樀男蛄卸鵁o需改變發(fā)卡探針及分子信標即可檢測其他序列的miRNA，方便、價廉。尤其是還能檢測到腫瘤細胞中miRNA的表達水平，結(jié)果與商品化miRNA試劑盒相一致；甚至可以檢測各種修飾的miRNA序列，如3’末端2_0_甲基化修飾。
【專利附圖】

【附圖說明】[0044]圖1為本發(fā)明的方法流程示意圖；
[0045]圖2為miRNA，3WJ-引物和3WJ-模板形成穩(wěn)定的三元雜交結(jié)構(gòu)的檢測；
[0046]圖3為3-WJ引物長度對檢測方法的影響；
[0047]圖4為優(yōu)化3-WJ弓丨物與3-WJ模板的摩爾比；
[0048]圖5為是不同分析時間對檢測信號的影響；
[0049]圖6為是不同目標miRNA (let_7b)響應的熒光光譜；
[0050]圖7為表示各種同源序列對檢測方法的干擾。
【具體實施方式】
[0051]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0052]本發(fā)明提供的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，是一種基于三元雜交結(jié)構(gòu)和DNA聚合酶-切口酶協(xié)同級聯(lián)恒溫擴增策略(PONDA)的熒光miRNA檢測。參見圖1，本發(fā)明通過核酸互補雜交，目標miRNA可以特異性識別與三元探針(引物和模板)并形成穩(wěn)定的三元雜交結(jié)構(gòu)；三元雜交結(jié)構(gòu)中的三元引物沿著三元模板起始鏈置換擴增反應并產(chǎn)生大量的SDA模板產(chǎn)物(單鏈DNA) ；SDA模板產(chǎn)物可以打開雙功能發(fā)卡探針，最終觸發(fā)切口酶信號放大反應，循環(huán)酶切分子信標，產(chǎn)生級聯(lián)放大的熒光信號。
[0053]本發(fā)明可以檢測低至IOOfM的miRNA ;該檢測方法具有超高的特異強，能夠很好區(qū)分不同錯配位置的高度同源序列，從而解決了現(xiàn)有檢測方法中由于特異性不強而導致假陽性結(jié)果的難題。
[0054]本發(fā)明提供的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒，包括:
[0055]能夠與miRNA形成三元雜交結(jié)構(gòu)的組合物，通過核酸互補雜交，目標miRNA可以特異性識別與3-WJ引物和3-WJ模板)并形成穩(wěn)定的3-WJ雜交結(jié)構(gòu)；
[0056]3-WJ引物和3-WJ模板，3-WJ引物由兩部分序列組成:其5’端部分與目的miRNA3’端部分互補，3’端部分與3-WJ模板的中間段互補；3-WJ模板由三部分序列組成:其5’端部分與目的miRNA5’端部分互補，中間段與3-WJ引物3’端部分互補，其3’端部分為含核酸切口酶識別位點的SDA模板區(qū)域；
[0057]具體的如圖2所示，圖A為只有3WJ-弓丨物和3WJ-模板時的溶解曲線，Tm=33.89°C，圖B為加入目的miRNA(Let-7b)后，miRNA，3WJ-引物和3WJ-模板的溶解曲線，Tm=40.93°C。由于反應溫度是37°C，該組圖證明了只有在miRNA存在的時候，miRNA, 3WJ-弓丨物和3WJ-模板才能形成穩(wěn)定的三元雜交結(jié)構(gòu)。
[0058]擴增底物，包括dNTPs混合物；
[0059]DNA分子機器工具，包括具有鏈置換擴增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；SDA模板與目的miRNA雜交后觸發(fā)DNA分子機器工具，產(chǎn)生SDA模板產(chǎn)物；具體為3-WJ雜交結(jié)構(gòu)中的3-WJ引物沿著3-WJ模板起始鏈置換擴增反應并被切割產(chǎn)生大量的SDA模板產(chǎn)物；SDA模板產(chǎn)物可以打開雙功能發(fā)卡探針，最終觸發(fā)切口酶信號放大反應，循環(huán)酶切分子信標，產(chǎn)生級聯(lián)放大的熒光信號；
[0060]具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的發(fā)卡分子H，能夠與SDA模板產(chǎn)物相識別，在識別后雜交打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)；[0061]具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標探針，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，分子信標探針具有能夠與被打開的發(fā)卡分子H相互補的序列；
[0062]以及DNA分子機器擴增反應緩沖液。
[0063]具體的給出以下實施例:
[0064]特異性識別目標miRNA的3_WJ引物和3_WJ模板，用于協(xié)同級聯(lián)恒溫擴增策略的探針包括雙功能發(fā)卡探針和分子信標，而DNA聚合酶為Klenow Fragment,核酸切口酶為Nt.BbvCI ；
[0065]3-WJ引物有兩部分序列組成:一部分(12個堿基)與模板miRNA互補，另一部分(5-7個堿基)與3-WJ模板互補；而3-WJ模板除了與3-WJ引物互補的一段之外，還含有識別目標miRNA的序列(10個堿基)和擴增區(qū)域(含有Nt.BbvCI酶切位點)；
[0066]3-WJ引物與3-WJ模板互補堿基為6個時，效果最佳；3_WJ引物:3_WJ模板的最優(yōu)摩爾比為1:1 (IOnM:10nM);發(fā)卡探針與鏈置換擴增產(chǎn)物互補，也與分子信標互補，該互補序列中含有Nt.BbvCI的酶切位點；發(fā)卡探針與分子信標的最優(yōu)摩爾比為1:5 ；KlenowFragment聚合酶與Nt.BbvCI切口酶的最優(yōu)濃度為2.5個單位和0.8個單位。
[0067]所述反應緩沖液為:50mMNaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA,pH7.9 ;反應體積為20 μ L，反應溫度為37°C，反應時間為30min。
[0068]具體的針對Let_7b進行的檢測用序列設(shè)計如下:
[0069]3WJ-模板的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示；
[0070]3WJ-引物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示；
[0071 ] SDA模板產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.3所示；
[0072]發(fā)卡分子H的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.4所示；
[0073]分子信標探針的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5所示，其兩端分別標記有熒光基團FAM和淬滅基團DABCYL。
[0074]基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測方法，包括以下步驟:
[0075]I)通過核酸互補雜交，目標miRNA特異性識別3_WJ引物、3_WJ模板并形成穩(wěn)定的三元雜交結(jié)構(gòu)；
[0076]2)將三元雜交結(jié)構(gòu)與擴增底物、DNA分子機器工具、具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的發(fā)卡分子H、分子信標探針以及DNA分子機器擴增反應緩沖液混合；
[0077]3)在三元雜交結(jié)構(gòu)存在的情況下，DNA聚合酶識別3_WJ引物與3_WJ模板的SDA模板區(qū)域形成的擴增起始位置，并進行擴增，待擴增至一定長度后，擴增產(chǎn)物中的核酸切口酶識別位點被識別并在擴增鏈的相應位點發(fā)生切割，產(chǎn)生SDA產(chǎn)物，而三元雜交結(jié)構(gòu)中的SDA模板區(qū)域繼續(xù)被擴增；
[0078]4)擴增所獲得的SDA產(chǎn)物觸發(fā)打開發(fā)卡分子H構(gòu)成雜交體，發(fā)卡結(jié)構(gòu)H被打開后，暴露出的與分子信標互補的區(qū)域，從而破壞分子信標的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分子信標與雜交體構(gòu)成雙鏈結(jié)構(gòu)，其熒光恢復；而分子信標參與形成的雙鏈互補結(jié)構(gòu)中還含有核酸切口酶識別位點，在形成雙鏈結(jié)構(gòu)后該位點被識別，并在分子信標序列上進行切割；被切割的分子信標從雙鏈結(jié)構(gòu)上脫落產(chǎn)生熒光信號，而SDA產(chǎn)物與發(fā)卡分子H構(gòu)成的雜交體再打開新的分子信標，以產(chǎn)生更多的突光信號；
[0079]5)待達到規(guī)定的反應時間后，檢測熒光信號，對熒光信號分析得到待測溶液中miRNA的含量，在一定范圍內(nèi)，miRNA濃度越高，則熒光信號越強。
[0080]所提供的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測方法，包括以下步驟:
[0081]加入目標miRNA，其可與3_WJ引物和模板形成穩(wěn)定的3_WJ雜交結(jié)構(gòu)；之后，在酶和dNTPs的存在下，3-WJ引物沿著3-WJ模板進行鏈置換擴增反應，產(chǎn)生數(shù)以千計的單鏈產(chǎn)物；該單鏈產(chǎn)物可以與發(fā)卡探針互補雜交，并將其打開；發(fā)卡探針被打開之后，可以與分子信標雜交形成DNA復合物，包含有切口酶的識別位點，并被Nt.BbvCI酶切；該酶切反應導致熒光基團和淬滅基團分開，產(chǎn)生熒光信號，同時將發(fā)卡探針釋放出來；該游離存在的發(fā)卡探針又可結(jié)合另一個分子信標，進行下一輪的酶切反應；如此循環(huán)，最初每分子的目標miRNA可以觸發(fā)放大的熒光信號。
[0082]在上述基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，包括3-WJ引物長度對檢測方法的影響，如圖2所示；優(yōu)化3-WJ引物與3-WJ模板的摩爾比，如圖3所示；優(yōu)化反應時間，如圖4所示；優(yōu)化結(jié)果如下:
[0083]其中，3-WJ引物有兩部分序列組成:一部分(12個堿基)與模板miRNA互補，另一部分(5-7個堿基)與3-WJ模板互補；
[0084]而3-WJ模板除了與3-WJ弓丨物互補的一段之外，還含有識別目標miRNA的序列(10個堿基)和擴增區(qū)域(含有Nt.BbvCI酶切位點)；
[0085]3-WJ引物與3-WJ模板互補堿基為6個時，效果最佳；3_WJ引物:3_WJ模板的最優(yōu)摩爾比為 1:1 (IOnM:10nM)；
[0086]雙功能發(fā)卡探針與鏈置換擴增產(chǎn)物互補，也與分子信標互補，該互補序列中含有Nt.BbvCI的酶切位點； 發(fā)卡探針與分子信標的最優(yōu)摩爾比為1:5 (50nM:250nM)；
[0087]Klenow Fragment聚合酶與Nt.BbvCI切口酶的最優(yōu)濃度為2.5個單位和0.8個單位；檢測反應緩沖液:50mM NaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA, pH7.9 ;反應溫度為37°C，最優(yōu)時間為30分鐘。
[0088]SDA產(chǎn)物與發(fā)卡結(jié)構(gòu)有18個bp的互補序列，可以在37°C相互雜交從而打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
[0089]SDA模板區(qū)域中含有Nt.BbvCI識別雙鏈中不被切割的單鏈序列3’ -GGAGTCG-5’ ；為了防止發(fā)卡分子H自身3’端的非特異性擴增影響單鏈觸發(fā)的效率，發(fā)卡分子H的3’端修飾有磷酸基團。
[0090]發(fā)卡分子H的序列含有Nt.BbvCI識別雙鏈中不被切割的單鏈序列3’ -GGAGTCG-5’，發(fā)卡分子H沒有被打開時，發(fā)卡分子H和分子信標均是莖環(huán)結(jié)構(gòu)不發(fā)生作用；當發(fā)卡被打開后有12個bp與分子信標互補形成雙鏈并且被Nt.BbvCI識別切斷，切斷的兩段分子信標均不能夠在37°C下和發(fā)卡分子H形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)而和發(fā)卡分子H分開，被打開的發(fā)卡分子H能夠循環(huán)的打開多個分子信標，使熒光信號放大。
[0091]待反應完成后，利用熒光分光光度計檢測熒光信號的強度，根據(jù)熒光信號的檢測結(jié)果與目標miRNA的濃度來繪制標準曲線，如圖6所示，其中，橫坐標為miRNA的濃度，縱坐標為為熒光強度；所述的標準曲線表示為Y=0.701X+5.229，Y表示熒光強度(X 105)，X表示miRNA濃度取以10為底的對數(shù)。
[0092]為了驗證本發(fā)明檢測的特異性，將let_7b的其他同族序列進行驗證，結(jié)果如圖7所示，可以看出被檢測的let-7b結(jié)果非常明顯，與其他相比具有顯著的區(qū)別，因此本發(fā)明的檢測試劑盒、檢測方法具有針對miRNA的特異性。
【權(quán)利要求】
1.一種基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒，其特征在于，包括: 能夠與miRNA形成三元雜交結(jié)構(gòu)的組合物，包括3-WJ引物和3-WJ模板，3-WJ引物由兩部分序列組成:其5’端部分與目的miRNA3’端部分互補，3’端部分與3-WJ模板的中間段互補；3_WJ模板由三部分序列組成:其5’端部分與目的miRNA5’端部分互補，中間段與3-WJ引物3’端部分互補，其3’端部分為含核酸切口酶識別位點的SDA模板區(qū)域； 擴增底物，包括dNTPs混合物； DNA分子機器工具，包括具有鏈置換擴增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；SDA模板與目的miRNA雜交后觸發(fā)DNA分子機器工具，產(chǎn)生SDA模板產(chǎn)物； 具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的發(fā)卡分子H，能夠與SDA模板產(chǎn)物相識別，在識別后雜交打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)； 具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標探針，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，分子信標探針具有能夠與被打開的發(fā)卡分子H相互補的序列； 以及DNA分子機器擴增反應緩沖液。
2.如權(quán)利要求1所述的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒，其特征在于，所述3-WJ引物與3-WJ模板有5~7個堿基的互補，3-WJ引物:3-WJ模板的摩爾比為1:1 ; 發(fā)卡分子H與SDA模板產(chǎn)物互補，也與分子信標探針互補,該互補序列中含有Nt.BbvCI的酶切位點；發(fā)卡探針與分子信標的摩爾比為1:5 ; DNA聚合酶與核酸切口酶的濃度為2.5U和0.8U。
3.如權(quán)利要求1所述的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒，其特征在于，所述反應緩沖液為:50mM NaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA，pH7.9 ;反應體積為20 μ L，反應溫度為37°C，反應時間為30min。
4.如權(quán)利要求1或2所述的基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒，其特征在于，所述的3WJ-模板的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示； 3WJ-引物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示； SDA模板產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.3所示； 發(fā)卡分子H的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.4所示； 分子信標探針的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5所示，其兩端分別標記有熒光基團FAM和淬滅基團DABCYL。
5.一種基于級聯(lián)恒溫擴增的miRNA熒光檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)通過核酸互補雜交，目標miRNA特異性識別3-WJ引物、3-WJ模板并形成穩(wěn)定的三元雜父結(jié)構(gòu)； 2)將三元雜交結(jié)構(gòu)與擴增底物、DNA分子機器工具、具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的發(fā)卡分子H、分子信標探針以及DNA分子機器擴增反應緩沖液混合； 3)在三元雜交結(jié)構(gòu)存在的情況下，DNA聚合酶識別3-WJ引物與3-WJ模板的SDA模板區(qū)域形成的擴增起始位置，并進行擴增，待擴增至一定長度后，擴增產(chǎn)物中的核酸切口酶識別位點被識別并在擴增鏈的相應位點發(fā)生切割，產(chǎn)生SDA產(chǎn)物，而三元雜交結(jié)構(gòu)中的SDA模板區(qū)域繼續(xù)被擴增； 4)擴增所獲得的SDA產(chǎn)物觸發(fā)打開發(fā)卡分子H構(gòu)成雜交體，發(fā)卡結(jié)構(gòu)H被打開后，暴露出的與分子信標互補的區(qū)域，從而破壞分子信標的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分子信標與雜交體構(gòu)成雙鏈結(jié)構(gòu)，其熒光恢復；而分子信標參與形成的雙鏈互補結(jié)構(gòu)中還含有核酸切口酶識別位點，在形成雙鏈結(jié)構(gòu)后該位點被識別，并在分子信標序列上進行切割；被切割的分子信標從雙鏈結(jié)構(gòu)上脫落產(chǎn)生熒光信號，而SDA產(chǎn)物與發(fā)卡分子H構(gòu)成的雜交體再打開新的分子信標，以產(chǎn)生更多的突光信號； 5)待達到規(guī)定的反應時間后，檢測熒光信號，對熒光信號分析得到待測溶液中miRNA的含量，在一定范圍內(nèi)，miRNA濃度越高，則熒光信號越強。
6.如權(quán)利要求5所述的基于恒溫級聯(lián)核酸擴增的miRNA檢測方法，其特征在于，所述3-WJ引物與3-WJ模板有5~7個堿基的互補，3-WJ引物:3-WJ模板的摩爾比為1:1 ; 發(fā)卡分子H與SDA模板產(chǎn)物互補，也與分子信標探針互補,該互補序列中含有Nt.BbvCI的酶切位點；發(fā)卡探針與分子信標的摩爾比為1:5 ; DNA聚合酶與核酸切口酶的濃度為2.5U和0.8U ；
所述反應緩沖液為:50mM NaCl, IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 100 μ g/ml BSA，pH7.9 ;反應體積為20 μ L，反應溫度為37°C，反應時間為30min。
7.如權(quán)利要求5所述的基于恒溫級聯(lián)核酸擴增的miRNA檢測方法，其特征在于，SDA產(chǎn)物與發(fā)卡結(jié)構(gòu)有18個bp的互補序列，可以在37°C相互雜交從而打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
8.如權(quán)利要求5所述的基于恒溫級聯(lián)核酸擴增的miRNA檢測方法，其特征在于，SDA模板區(qū)域中含有Nt.BbvCI識別雙鏈中不被切割的單鏈序列3’ -GGAGTCG-5’;為了防止發(fā)卡分子H自身3’端的非特異 性擴增影響單鏈觸發(fā)的效率，發(fā)卡分子H的3’端修飾有磷酸基團。
9.如權(quán)利要求5所述的基于恒溫級聯(lián)核酸擴增的miRNA檢測方法，其特征在于，發(fā)卡分子H的序列含有Nt.BbvCI識別雙鏈中不被切割的單鏈序列3’ -GGAGTCG-5’，發(fā)卡分子H沒有被打開時，發(fā)卡分子H和分子信標均是莖環(huán)結(jié)構(gòu)不發(fā)生作用；當發(fā)卡被打開后有12個bp與分子信標互補形成雙鏈并且被Nt.BbvCI識別切斷，切斷的兩段分子信標均不能夠在37°C下和發(fā)卡分子H形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)而和發(fā)卡分子H分開,被打開的發(fā)卡分子H能夠循環(huán)的打開多個分子信標，使熒光信號放大。
10.如權(quán)利要求5所述的基于恒溫級聯(lián)核酸擴增的miRNA檢測方法，其特征在于，檢測中的反應溫度為37°C，反應時間為30分鐘。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789435SQ201410043512
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月29日
【發(fā)明者】趙永席, 陳鋒, 張青, 田苗, 趙越, 林曼麗 申請人:西安交通大學