茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶CsECGT能夠催化非酯型兒茶素形成酯型兒茶素，為體外催化非酯型兒茶素生成酯型兒茶素，以及茶樹體內(nèi)調(diào)控兒茶組分的組成提供了一種新的可選擇途徑。此外，本發(fā)明通過原核表達(dá)制備重組CsECGT，克服了直接從茶葉中分離該蛋白的困難，降低了成本。
【專利說明】茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT及其編碼蛋白與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT及其編碼蛋白與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]茶是國際上公認(rèn)的世界六大健康食品之一，也是世界上三大無酒精飲料中最有益于健康的產(chǎn)業(yè)。國內(nèi)外的研究已經(jīng)證明，茶具有“三抗三降三增”的保健功能:抗衰老、抗輻射、抗癌癥，降血脂、降血糖、降血壓，增強(qiáng)免疫、增強(qiáng)智力、增加美麗。飲茶已成為生活的新潮流，全球飲茶人口約占總?cè)丝诘?0%，現(xiàn)每年仍以2%以上的速度增長；全球人均茶葉年消費為0.46公斤，且正以每年4%以上的速度遞增。我國目前有凈飲茶人口 2.6億，飲茶人口量和年均消費量均以5%以上的速度遞增。為此，21世紀(jì)為全球茶葉傳統(tǒng)消費市場提供了巨大的增長潛力和增長空間。進(jìn)入90年代以來，世界茶飲料就以17.0%的年增長速度遞增，中國茶飲料市場進(jìn)入21世紀(jì)后每年以30%的速度增長，2005年消費量超過580萬噸，占中國飲料消費市場份額的20%，超過了果汁飲料而有趕超碳酸飲料之勢，2006和2007年茶飲料繼續(xù)成為中國軟飲料市場的新主流。面對我國茶飲料的迅猛發(fā)展，有關(guān)業(yè)內(nèi)人士預(yù)言，茶飲料將在我國掀起第三次飲料浪潮，甚至取代飲用水地位，與發(fā)展多年的碳酸飲料爭奪市場_王。
[0003]作為茶樹的主要次生代謝產(chǎn)物，兒茶素是決定茶葉品質(zhì)及其健康功效的重要組分，約占茶鮮葉干重的12-24%。兒茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，根據(jù)兒茶素B環(huán)的羥基數(shù)目、C環(huán)上2，3位同分異構(gòu)體、C環(huán)上3位是否連接沒食子酸等可以劃分為若干種組分。根據(jù)兒茶素B環(huán)的羥基數(shù)目，兒茶素主要可以分為B環(huán)雙羥基和三羥基兒茶素，其中表兒茶素(EC)、兒茶素(C)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)屬于B環(huán)雙羥基化合物，而沒食子兒茶素(GC)、表沒食子兒茶素(EGC)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)屬于B環(huán)三羥基化合物。根據(jù)C環(huán)上2，3位同分異構(gòu)體，兒茶素可分為順式(表型)和反式兒茶素，其中順式兒茶素主要有EC、EGC、ECG和EGCG，反式兒茶素主要有C、GC和GCG。根據(jù)C環(huán)上3位是否連接沒食子酸基團(tuán)，兒茶素可分為酯型和非酯型兒茶素，其中非酯型兒茶素主要包括C、GC、EC和EGC，酯型兒茶素主要包括ECG、EGCG和GCG。酯型兒茶素占茶兒茶素總量76%。酯型兒茶素的保健功能要高于非酯型兒茶素特別是EGCG，具有抗氧化活性、抗誘變、抗癌、抗心血管疾病作用，紫外線輻射的保護(hù)作用，抗糖尿病、抗菌消炎、減肥和帕金森病的治療等作用。
[0004]長期以來，有關(guān)酯型兒茶素的合成途徑調(diào)控備受茶業(yè)界的關(guān)注。原因之一是茶樹中酯型和非酯型兒茶素的含量與比例，決定著茶葉加工技術(shù)的設(shè)定和最終產(chǎn)品的品質(zhì)；其二是EGCG和ECG對人類健康的藥理功效強(qiáng)于非酯型兒茶素，是當(dāng)今藥物開發(fā)的主要目標(biāo)物，尋找及開發(fā)高含量酯型兒茶素的茶樹資源也是茶業(yè)界的長期攻關(guān)目標(biāo)之一。雖然，表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶可以從茶鮮葉中分離獲得，但成本高，技術(shù)難度大，且其氨基酸序列尚未知。本發(fā)明通過基因工程的方法，首次發(fā)現(xiàn)表兒茶素沒食子酰基轉(zhuǎn)移酶基因CsECGT及其編碼蛋白，該基因可用于酯型兒茶素的生物合成，調(diào)控茶葉中非酯型兒茶素與酯型兒茶素的比例。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT編碼的蛋白，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]本發(fā)明的表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT是從茶樹(Camelliasinensis)中克隆得到的一種新的表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因(現(xiàn)將該基因命名為CsECGT)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，該基因全長為1726bp，分析表明，該序列包含一個完整的編碼區(qū)1443bp，5’非翻譯區(qū)(UTR)72bp，3’非翻譯區(qū)180bp和polyA尾巴31bp，編碼區(qū)GC含量為51.83%,編碼480個氨基酸組成的蛋白(表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶)。由該基因編碼的表兒茶素沒食子酰基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。該蛋白的分子量為54.51KDa，等電點為5.32。為便于表述，將該表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶命名為CsECGT。
[0008]應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。因而，本發(fā)明表兒茶素沒食子酰基轉(zhuǎn)移酶基因還包括由SEQ ID N0.1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸，得到編碼CsECGT的核苷酸序列。[0009]此外，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(SEQ ID N0.2)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第56位的L替換為I。因此，本發(fā)明表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶還包括SEQ ID N0.2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有與CsECGT同等活性的由CsECGT衍生得到的蛋白質(zhì)。
[0010]本發(fā)明的又一目的是提供含有表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT的重組表達(dá)載體 pET28a(+) -CsECGT 和基因沉默載體 pHellsgate8_CsECGT。
[0011]將本發(fā)明的CsECGT基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明蛋白的重組表達(dá)載體或抑制本發(fā)明基因表達(dá)的基因沉默載體，進(jìn)一步將該重組表達(dá)載體或者基因沉默載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，獲得表達(dá)本發(fā)明CsECGT的基因工程菌，或者轉(zhuǎn)基因茶樹或組織。
[0012]在本發(fā)明實例中，根據(jù)CsECGT編碼區(qū)序列設(shè)計包含酶切位點的引物，通過RT-PCR的方法先克隆到T-easy載體上，測序正確后將CsECGT克隆到原核表達(dá)載體pET28的多克隆位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化條件，獲得具有活性的表兒茶素沒食子酰基轉(zhuǎn)移酶。實驗表明，CsECGT能夠催化非酯型兒茶素形成酯型兒茶素。
[0013]在本發(fā)明實例中，根據(jù)CsECGT全長序列設(shè)計引物，擴(kuò)增CsECGT全長序列中的300bp-600bp左右的基因片段，通過BP反應(yīng)連接到pD0NR221構(gòu)建中間載體，測序正確后將中間載體與pHellsgate8通過LR反應(yīng)獲得CsECGT基因沉默載體pHellsgate8_CsECGT，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌LBA4404，浸染茶樹葉片等外植體，獲得轉(zhuǎn)基因茶樹或組織，其體內(nèi)CsECGT表達(dá)水平得以改變，從而調(diào)控非酯型兒茶素與酯型兒茶素的比例。
[0014]本發(fā)明首次提供了一種表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT序列，其編碼蛋白其能夠催化非酯型兒茶素形成酯型兒茶素，為體外催化非酯型兒茶素生成酯型兒茶素，以及茶樹體內(nèi)調(diào)控兒茶組分的組成(非酯型兒茶素與酯型兒茶素的比例)提供了一種新的可選擇途徑。此外，本發(fā)明通過原核表達(dá)制備重組CsECGT，克服了直接從茶葉中分離該蛋白的困難，降低了成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是RACE產(chǎn)物電泳圖，左側(cè)起泳道I為Marker。
[0016]圖2是重組表達(dá)載體質(zhì)粒電泳圖(引物為M13F與M13R)。
[0017]其中，從左至右，泳道I為Marker，其余泳道均為目的條帶。
[0018]圖3是重組表達(dá)載體質(zhì)粒酶切電泳圖。
[0019]圖4是重組載體轉(zhuǎn)化后的BL21菌落PCR產(chǎn)物電泳圖(引物為M13F與M13R)。其中，從左至右，泳道I為Marker,其余為目的條帶。
[0020]圖5是重組蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )圖。
[0021]其中，從左至右，泳道I為Marker，其余為目的條帶。
[0022]圖6是EC和1 ，2，3，4，6-0-五沒食子酰葡萄糖的反應(yīng)產(chǎn)物HPLC分析圖。
[0023]其中:A為混合標(biāo)樣；B為反應(yīng)體系中未加CsECGT重組蛋白的對照；C為反應(yīng)體系中添加CsECGT重組蛋白。
[0024]圖7是attB-PCR產(chǎn)物電泳圖。
[0025]其中，M為Marker, I為目的條帶。
[0026]圖8是中間載體轉(zhuǎn)化后的DH5 α菌落PCR電泳圖。
[0027]其中，M為Marker，l和2為目的條帶。
[0028]圖9是CsECGT基因沉默載體PCR電泳圖。
[0029]其中，M:Marker，1F:以 Agri51 和 Agri56 為引物；1R:PDKFP 和 Agri69 為引物。
[0030]圖10是農(nóng)桿菌菌落PCR電泳圖。
[0031]其中，M:Marker，1F:以 Agri51 和 Agri56 為引物；1R:PDKFP 和 Agri69 為引物。
[0032]圖11是轉(zhuǎn)基因茶葉愈傷組織(T)和未轉(zhuǎn)基因的茶葉愈傷組織(W) PCR產(chǎn)物電泳圖，引物為NPTIIF和NPIIRo
[0033]其中，從左至右，泳道I為Marker，泳道2 (W)為未轉(zhuǎn)基因的茶葉愈傷組織，泳道3和4 (T)均為目的條帶。
【具體實施方式】
[0034]以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0035]若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0036]實施例1、CsECGT基因序列的獲得
[0037]以茶樹(Camellia sinensis)幼嫩新鮮葉片為材料,提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，根據(jù)公布的?；D(zhuǎn)移酶基因的保守序列設(shè)計引物(引物序列如下)，PCR擴(kuò)增編碼區(qū)序列，
[0038]上游引物:5’-TGAGTATAGACCCAGCAA-3’，如 SEQ ID N0.3 所示；
[0039]下游引物:5’-CATTTCACAGTACCCACA-3’，如 SEQ ID N0.4 所示。
[0040]對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶純化回收，將回收的DNA片段連接到pGEM-T easy載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Esherichia coli)DH5 α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)藍(lán)白斑篩選，提取陽性克隆質(zhì)粒并酶切圖譜分析后，再將單克隆測序，插入片段位488bp。應(yīng)用Blast在線軟件，將測序的序列與已報道的基因進(jìn)行同源比較，發(fā)現(xiàn)插入片段與?；D(zhuǎn)移酶基因家族的保守區(qū)有著較高的一致性，其中與玉米的一致性達(dá)63.2%。
[0041]根據(jù)已獲得保守區(qū)片斷的序列設(shè)計5’ -RACE引物:
[0042]ECGT5-1:5’ -CCTTCGTGCTGCAGGTTCTTCTC-3’ ；如 SEQ ID N0.5 所示；
[0043]3’-RACE 引物:
[0044]ECGT3-1:5，-GATCTGTTTCGCAATGATATTTTG-3，，如 SEQ ID N0.6 所示。
[0045]引物ECGT5和UPM的產(chǎn)物在1000bp左右有一條亮帶(見圖1 )，而引物ECGT3和UPM的產(chǎn)物在800bp左右有一條亮帶(見圖1)。將PCR產(chǎn)物回收、連接后轉(zhuǎn)化，在得到的大量克隆中，選取陽性克隆進(jìn)行測序。通過測序并于保守區(qū)序列拼接，去掉重疊部分，得到脫氧核糖核苷酸序列全長為1726bp，包含一個完整的編碼區(qū)1443bp，5’非翻譯區(qū)(UTR) 72bp，3’非翻譯區(qū)180bp和poIyA尾巴31bp。
[0046]該基因全長為1726bp，分析表明，該序列包含一個完整的編碼區(qū)1443bp，5’非翻譯區(qū)(UTR) 72bp，3’非翻譯區(qū)180bp和polyA尾巴31bp，編碼區(qū)GC含量為51.83%，編碼480個氨基酸組成的蛋白(表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶)。由該基因編碼的表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。該蛋白的分子量為54.51KDa，等電點為5.32。為便于表述，將該表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶命名為CsECGT。
[0047]通過blast軟件在線比較分析，發(fā)現(xiàn)CsECGT編碼的氨基酸序列與其它物種的絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶具有較高的一致性，尤其與來玉米(Zea mays)、潘那利番爺(Solanumpennellii)、蝶豆(Clitoria ternatea)的絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶的相似性達(dá)40%以上。
[0048]實施例2表兒茶素沒食子酰基轉(zhuǎn)移酶基因CsECGT的異源表達(dá)
[0049]一、攜帶茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT的重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0050]以茶樹cDNA為模板，根據(jù)序列SEQ ID N0.1設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因編碼區(qū)的脫氧核糖核苷酸序列。引物兩端分別引入BamHI和Xho I酶切位點，引物序列如下:
[0051]上游:5’-ATGTTTCCACCAAAGTCATACAG-3’(如 SEQ ID N0.7 所示)，引入 BamHI 酶切位點，
[0052]下游:5’-CTAAAGAGGATAGTAATGAATCCATC-3’(如SEQ ID N0.8 所示)，引入 Xho I酶切位點；
[0053]對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶純化回收，將回收的DNA片段連接到pGEM-T easy載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Esherichia coli)DH5 α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)藍(lán)白斑篩選，提取陽性克隆質(zhì)粒測序，得到含有BamHI和Xho I酶切位點及編碼茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶的脫氧核糖核苷酸序列的質(zhì)粒pGEMT-CsECGT。[0054]將質(zhì)粒pGEMT-CsECGT和質(zhì)粒pET28a (+)先在30°C條件下分別用雙酶切2h后再在37 °C條件下分別用雙酶切2h，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收，用T4DNA連接酶4°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取Kan抗性平板上長出的單克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和酶切圖譜鑒定，結(jié)果如圖2和圖3所示，可知重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。將獲得的重組表達(dá)載體命名為pET28a(+)-CsECGT。
[0055]二、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主、陽性克隆鑒定
[0056]將步驟一中構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET28-CsECGT轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取Kan抗性平板上長出的單菌落進(jìn)行PCR鑒定。以CsECGT基因重組表達(dá)載體的單克隆菌落為模板，用M13F和M13R引物進(jìn)行PCR檢測。菌落PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖4，可知單克隆菌落含有目的基因片段，可用于蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)實驗。
[0057]三、CsECGT基因的原核表達(dá)
[0058]將步驟二中鑒定正確的克隆培養(yǎng)過夜，再將細(xì)菌100倍稀釋于含Kan(50mg/L)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液生長至0D600為0.6-0.8時，加入IPTG (終濃度為0.3mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，28°C誘導(dǎo)6h。取誘導(dǎo)過的菌液250ml離心IOmin,離心收集菌體(4000rpm, IOmin,4°C),用 50mL Binding buffer (20mM Tris-Cl, 500mM NaCl, andlOmM imidazole, pH7.9)洗漆菌體2遍后，重懸于30mLl Xbinding buffer中，進(jìn)行超聲波破碎以釋放蛋白，然后高速冷凍低溫離心(12000Xg，30min，4°C)除去不溶部分。取稍許上清和沉淀樣品100°C煮沸，離心后(12000xg, 20min, 4°C ),將上清部分上樣到鎳柱HisTrap HT column (ImL,GE Healthcare)上，待濾液全部過濾完后，用 wash buffer (20mM Tris-Cl, pH7.9, 500mMNaCl, 50mM imidazole)沖洗兩次，每次 3mL。然后用 2.5mlelution buffer (20mMTris-Cl, pH7.9, 500mM NaCl, 250mM imidazole)洗脫。用 Vivaspin (20mL, IOkD)濃縮至
2.5mL，經(jīng)PD-10脫鹽柱(GE· Healthcare)脫鹽后，溶解于含10%甘油的Tris-HCl緩沖液(50mM, ρΗ8.0),米用Bradford方法測定蛋白濃度后(Bradford et al.，1976),分裝保存于-80°C備用。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測重組蛋白，結(jié)果見圖5，表達(dá)蛋白的分子量約為55Kda。
[0059]四、CsECGT酶促反應(yīng)及其產(chǎn)物檢測
[0060]采用Tris-HCl緩沖液(50mM，pH7.5)進(jìn)行CsECGT的50 μ L酶促反應(yīng)，底物為EC和1，2，3，4，6-0-五沒食子酰葡萄糖，反應(yīng)3h。反應(yīng)后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，蒸干后用甲醇溶解，然后利用HPLC進(jìn)行分析，分析條件為:高效液相色譜(HPLC)檢測:采用LC-20A高效液相色譜儀(島津，日本)，KromasilTM C18色譜柱(5 μ m, 200mmX4.6mm)、柱溫為40°C,流速為lmL/min，進(jìn)樣量為10 μ L，檢測波長為278nm，流動相為水(含0.15%醋酸)-乙腈(含0.15%醋酸)，體積比為9:1。結(jié)合圖6，結(jié)果表明:在CsECGT酶作用下EC和1，2，3,4, 6_0_五沒食子酰葡萄糖反應(yīng)生成了 ECG，即CsECGT可將非酯型兒茶素轉(zhuǎn)變成酯型兒茶素。
[0061]實例3抑制表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT的表達(dá)
[0062]一、表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因沉默載體構(gòu)建
[0063]取0.5mL 的離心管 I 支，依次加入 5μ LlOX PCR Buffer，3 μ L25mmol/LMgC12，0.4μ L25mmol/L dNTP mix，I μ LlO μ mol/L 上游引物 ECGTRNAiF (如 SEQ ID N0.9 所示)，I μ LlOy mol/L 下游引物 ECGTRNAiR(如 SEQ ID N0.10 所示)，I μ L2U/μ L Taq 酶，2yL 實例I得到的cDNA，加雙蒸水至總體積20 μ L0采用如下程序進(jìn)行PCR:95°C 4min, 94°C 1.5min，62°C退火lmin，72°C 2min，35個循環(huán)，72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，如圖7所示獲得300bp左右的片段。加150 μ L TE ρΗ8.0緩沖液與于50 μ L的attB-PCR 產(chǎn)物，再加入 100 μ L30%PEG8000/30mM MgC12 溶液，充分混勻，室溫下 10，OOOXg離心15min,去除上清液，加入50 μ L TE ρΗ8.0緩沖液，得attB-PCR純化產(chǎn)物。取1.5mL離心管，于室溫下依次加入I μ L attB-PCR純化產(chǎn)物，0.5 μ LpD0NR221，2.5 μ L TE ρΗ8.0緩沖液。從-80°C冰箱中取出BP Clonase II enzyme mix,迅速放置冰上約2min,短暫潤旋2次，每次2s,加IyL of BP Clonase IIenzyme mix于反應(yīng)液中，混勻，短暫離心，25°C下孵育Ih,加入IyL ProteinaseK于反應(yīng)液中，短暫離心，37°C孵育IOmin終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，以M13F和M13R引物進(jìn)行PCR鑒定，鑒定克隆為陽性克隆，見圖8，選陽性克隆提取質(zhì)粒，得到中間載體。在1.5mL離心管中，室溫下分別加入I μ L中間載體，0.5μ LpHellsgate8, 2.5 μ L TE ρΗ8.0 緩沖液。從-8CTC冰箱中取出 LR Clonase II enzyme mix,迅速放置冰上約2min,短暫潤旋2次,每次2s,加I μ L of LR Clonase II enzyme mix于反應(yīng)液中，混勻，短暫離心，25°C下孵育lh，加入IyL Proteinase K于反應(yīng)液中，短暫離心，37°C孵育IOmin終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，以Agri51 (如SEQ ID N0.11所示)、Agri56 (如 SEQ ID N0.12 所示)、PDKFP (如 SEQ ID N0.13 所示)和 Agri69 (如 SEQ IDN0.14所示)兩對引物進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆，結(jié)果(如圖9所示)表明，CsECGT基因沉默載體 pHellsgate8_CsECGT 構(gòu)建成功。
[0064]二、基因沉默載體轉(zhuǎn)化宿主、陽性克隆鑒定
[0065]將步驟一中構(gòu)建的基因沉默載體pHellsgate8_CsECGT轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，挑取Spe抗性平板上長出的單菌落進(jìn)行PCR鑒定。菌落PCR產(chǎn)物的電泳(圖10)結(jié)果表明，單克隆菌落含有目的基因片段。
[0066]三、轉(zhuǎn)愈傷組織及分子鑒定與生化分析
[0067]挑取陽性單菌落接種于LB附加100mg/L Spe和50mg/L Rif的培養(yǎng)基中，于28°C、240r/min搖床上過夜培養(yǎng)至 0D600為0.5左右，然后于5000r/min離心6min，其沉淀用MS液體培養(yǎng)基重新懸浮，加入IOOuM As，28°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3個小時后，用作侵染液。取無菌茶葉為外植體，用上述工程菌侵染液浸泡外植體，間歇搖動使外植體與菌液充分接觸，侵染時間分別為20min。侵染完畢后取出外植體用無菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS)，于28°C、黑暗條件下共培養(yǎng)48h。共培養(yǎng)結(jié)束后將外植體轉(zhuǎn)移至茶葉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+0.5mg/L2, 4-D+0.lmg/L KT)，并添加 400mg/L Carb 和 25mg/L Kan，每二周更換新鮮培養(yǎng)基。4周后，提取愈傷組織DNA，以NPTIIF (如SEQ ID N0.15所示)和NPTIIR (如SEQ ID N0.16所示)為引物，PCR鑒定結(jié)果(圖11)表明基因轉(zhuǎn)化成功。將轉(zhuǎn)基因愈傷組織在45°C條件下烘干，粉碎后，用8倍體積的甲醇回流提取lh，取樣品進(jìn)行分析，分析條件為:高效液相色譜(HPLC)檢測:采用LC-20A高效液相色譜儀(島津，日本)，KromasilTM C18色譜柱(5μπι，200mmX 4.6mm)、柱溫為40°C，流速為lmL/min，進(jìn)樣量為10 μ L，檢測波長為278nm，A相為超純水，B相為有機(jī)相(N，N-二甲基甲酰胺:甲醇:冰醋酸=80: 4: 3);梯度條件:B 相，0.01min 時 17%、15min 時 20%、28min 時 32%、34min 時 32%、36min 時 17%、40min時 17%。
[0068]HPLC分析結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因茶葉愈傷組織中酯型兒茶素降低了72.33%，而非酯型兒茶素的含量提高了 50.61%。[0069]文中部分引物序列:
[0070]ECGTRNAiF:5’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGATGGAGCCCACGAACAGATT-3’ ；
[0071]ECGTRNAiR:5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT TTCGGGATCATTGGAGGT-3，；
[0072]Agri 51:5，-CAACCACGTCTTCAAAGCAA-3，；
[0073]Agri 56:5， -CTGGGGTACCGAATTCCTC-3，；
[0074]PDKFP:5’ -ATTACAGTTGGGAAATTGGGTT-3’ ； [0075]Agri 69:5， -AGGCGTCTCGCATATCTCAT-3，；
[0076]NPTIIF:5’ -GATTGA ACA AGA TGG ATT-3’ ；
[0077]NPTIIR:5’ -CATTTT CCA CCATGA TATTC-3’。
【權(quán)利要求】
1.一種茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所
2.權(quán)利要求1所述茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT編碼的蛋白，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，該載體為重組表達(dá)載體pET28a(+) -CsECGT 和基因沉默載體 pHellsgate8_CsECGT。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)基因茶樹或組織。
6.含有權(quán)利要求1所述基因的宿主菌。
7.權(quán)利要求1所述的茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT在催化非酯型兒茶素生成酯型兒茶素中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2所述的茶樹表兒茶素沒食子?；D(zhuǎn)移酶基因CsECGT的編碼蛋白在催化非酯型兒茶素生成酯型兒茶素中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的茶樹表兒茶素沒食子酰基轉(zhuǎn)移酶基因CsECGT在調(diào)控茶樹體內(nèi)非酯型兒茶素與酯型兒茶素的比例中的應(yīng)用。
10.一種體外表達(dá)茶樹表兒茶素沒食子酰基轉(zhuǎn)移酶CsECGT的方法,其特征在于,該方法是利用重組表達(dá)載體，將權(quán)利要求1所述的基因?qū)胨拗骶?，誘導(dǎo)該基因表達(dá)。
【文檔編號】C12N15/70GK103740740SQ201410041469
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】劉碩謙, 吳敦超, 鄧婷婷, 鄒文敏, 彭忠 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)