一種構建TAL效應子和TALENs的簡化方法及質粒的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種構建TAL效應子和TALENs的簡化方法及質粒，具體是通過研究發(fā)現(xiàn)dTALE的半個重復(LHR)是可以省略的，因而設計并構建了一個通用的RAR質粒pSK-RAR-U。由于通用RAR質粒pSK-RAR-U能夠接受任何一個通過單元裝配法組裝的dTALE重復區(qū)，進而構建dTALEs表達載體的方法簡化為：第一步為dTALE重復區(qū)序列組裝，第二步為將dTALE重復區(qū)序列克隆到pSK-RAR-U中。本發(fā)明優(yōu)點是為dTALEs和TALENs的構建提供了更簡便的方法，節(jié)約時間和成本。【專利說明】—種構建TAL效應子和TALENs的簡化方法及質?！?br>技術領域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物【
技術領域：
】，涉及一種構建TAL效應子和TALENs的構建方法及其相應的質粒?！?br>背景技術：
】[0002]黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)的多個致病變種，在多種作物上造成嚴重的病害，包括辣椒和番茄的細菌性斑點病、水稻的白葉枯病和細菌性條斑病[I]。TAL效應子(TranscriptionactivatorLikeeffector,TALE)作為黃單胞桿菌的蛋白類效應子之一，能夠通過三型分泌系統(tǒng)(TypeIIIsecretionsystem,TTSS)進入植物的細胞核,并與特定基因啟動子DNA結合，類似于真核生物轉錄因子，啟動植物基因的表達，以控制植物的生理生化進程，促進病害發(fā)生[2]。黃單胞桿菌通過進化產生一系列的TAL效應子以利于在寄主上的定殖和傳播，而寄主植物亦進化出一系列的抗病策略以抑制該病原菌引起的病害。因此針對不同的寄主植物的基因型，TAL效應子既有可能是毒性因子，也可能是無毒因子。近年來關于黃單胞桿菌TAL效應子的研究有許多新進展，尤其是TAL效應子與寄主DNA特異性識別的分子密碼的破解，并由此研發(fā)出的可對生物基因組進行定點激活、敲出或修飾的dTALEs(designerTALEs)和TALENs(TALEnuclease)技術，已成為生物技術研究和利用的前沿熱點之一[3]。[0003]天然的TALEs家族蛋白具有結構的相似性:1)N端高度保守，其mRNA水平上存在著TTSS分泌信號；2)C端含有亮氨酸拉鏈結構(Leucinezipper,LZ)、核定位信號(Nuclearlocalizationsignals,NLSs)和酸性轉錄激活域(Acidicactivationdomain,AD)；3)中間為多個串聯(lián)重復單元組成的串聯(lián)重復區(qū)，每個重復單元含有34個氨基酸，其中第12和13位氨基酸高度可變，被稱為重復可變區(qū)(Repeat-variablediresidue,RVD)[I]。目前鑒定的TALEs的34個氨基酸的重復單元數目變幅為1.5到33.5個，重復單元的數目和順序決定了TALEs的特異性。每一個重復單元識別一個特異的DNA堿基，且這種識別由每一個重復單元的第12和第13個氨基酸殘基決定[4，5]。第12和13位雙連氨基酸識別DNA堿基的規(guī)律為:NG識別T，HD識別C，NI識別A，NK或NN識別G[5，6]。TALEs通過結合目標基因的啟動子激活寄主基因的表達。[0004]根據天然TALEs的DNA識別密碼，用TALE的34個氨基酸重復單元模塊就可以裝配組建成一個TALE的中間重復區(qū)或DNA結合域[7]。根據需要在基因組中選擇一段DNA序列作為靶點，設計者就可以裝配出能夠識別這段DNA序列的TALE(dTALE)，也可進一步將dTALE的轉錄激活域(AD)換成非特異性核酸內切酶FokI從而構建成反因子核酸酶TALENs(TALEnucleases)[8,9]。dTALE技術和TALENs技術已分別成為基因定點激活與基因組定點編輯的有力工具[10，11，12]。這種基因的定點編輯已經在酵母、果蠅、蛔蟲、斑馬魚、老鼠、豬、牛、擬南芥、水稻、蠶、人類軀體及干細胞等中得到證明[13]。[0005]奇怪的是所有天然的TALEs在重復可變區(qū)末端都含一個僅有19-20個氨基酸的半個重復單元，稱之為LHR(last-half-repeat)[3],LHR的存在可能意味著既是進化的原點也可能是TALEs生物功能的必需。因為每一個天然的TALEs都有一個LHR，導致每一個報道的dTALE或TALEN在裝配的DNA結合區(qū)也都含有一個LHR[6,8，9，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27]。因此，從此前的研究及報道來看，研究人員似乎都認為這半個重復(LHR)在DNA結合與基因激活中是必需的。為了使dTALE或TALEN含有LHR，在重復模塊裝配過程中，需要單獨合成4個LHRs(分別帶有RVDs以識別‘A’，‘C’，‘T’和‘G’)[22]，或是構建4種分別含有編碼LHRs(分別帶有識別‘A’，‘C’，‘T’和‘G’的RVDs)之一的骨架載體[25，26，28]。這顯然增加了構建dTALEs或TALENs的復雜性及費用。[0006]參考文獻[0007][I]BochJjBonasU(20IO)XanthomonasAvrBs3family-typeIIIeffectors:discoveryandfunction.AnnualReviewofPhytopathology48(I):419-436.[0008][2]李巖強，王春連，趙開軍(2011)病原細菌TAL效應子與寄主靶基因識別的分子密碼，生物工程學報，27(8):1132-1141。[0009][3]趙開軍楊兵，(2012)TALENs:植物基因組定點編輯的分子剪，中國農業(yè)科學，45(14):2787-2792.[0010][4]DoyleELjStoddardBLjVoytasDFjBogdanoveAJ.(2013)TALeffectors:highlyadaptablephytobacterialvirulencefactorsandreadilyengineeredDNA-targetingproteins.TrendsCellBiol.23(8):390-398.[0011][5]MoscouMJjBogdanoveAJ(2009)AsimpleciphergovernsDNArecognitionbyTALeffectors.Science326:1501.[0012][6]BochJjScholzeHjSchornackSjLandgrafA,HahnS，etal.(2009)BreakingthecodeofDNAbindingspecificityofTAL-typeIIIeffectors.Science326:1509-1512.[0013][7]MorbitzerRjRomerP，BochJjLahayeT(2010)Regulationofselectedgenomelociusingdenovo-engineeredtranscriptionactivator-1ikeeffector(TALE)-typetranscriptionfactors.ProcNatlAcadSciUSA107:21617-21622.[0014][8]ChristianMjCermakTjDoyleELjSchmidtC，ZhangF，etal.(2010)TargetingDNAdoubIe-strandbreakswithTALeffectornucleases.Genetics186:757-761.[0015][9]LiT，HuangS，JiangWZjWrightD，SpaldingMH，etal.(2011)TALnucleases(TALNs):HybridproteinscomposedofTALeffectorsandFokIDNA-cleavagedomain.NucleicAcidsResearch39(I):359-372.[0016][10]MakAN,BradleyPjBogdanoveAJjStoddardBL(2013)TALeffectors:function,structure,engineeringandapplications.CurrOpinStructBiol23(l):93-99(do1:10.1016/j.sb1.2012.11.001).[0017][11]LiT，HuangS，ZhouJ，YangB(2013)DesignerTALeffectorsinducediseasesusceptibilityandresistancetoXanthomonasoryzaepv.0ryzaeinrice.MolPlant6(3):781-789(do1:10.1093/mp/sst034).[0018][12]RichterA，BochJ(2013)DesignerTALEsteamupforhighlyefficientgeneinduction.NatMethodslO(3):207-208(do1:10.1038/nmeth.2373).[0019][13]JoungJK，SanderJD(2013)TALENs:awidelyapplicabletechnologyfortargetedgenomeediting.NatRevMolCellBiol14(I):49-55(do1:10.1038/nrm3486).[0020][14]LiuJjLiC，YuZ，HuangPjWuH，etal.(2012)EfficientandspecificmodificationsoftheDrosophilagenomebymeansofaneasyTALENstrategy.JGenetGenom39:209-215.[0021][15]WoodAJjLoTWjZeitlerB，PickleCS，RalstonEJjetal.(2011)TargetedgenomeeditingacrossspeciesusingZFNsandTALENs.Science333:307.[0022][16]SanderJD，CadeLjKhayterCjReyonDjPetersonRTjetal.(2011)TargetedgenedisruptioninsomaticzebrafishcellsusingengineeredTALENs.NatureBiotechnology29:697-698.[0023][17]HuangP，XiaoA，ZhouMG，ZhuZYjLinS，etal.(2011)HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs.NatureBiotechnology29:699-700.[0024][18]DahlemTJ，HoshijimaKjJurynecMJjGuntherDjStarkerCGjetal.(2012)SimpleMethodsforGeneratingandDetectingLocus-SpecificMutationsInducedwithTALENsintheZebrafishGenome.PLoSGenet8(8):e1002861,do1:10.1371/journal,pgen.1002861.[0025][19]BedelIVM.WangY，CampbellJM，PoshustaTL,StarkerCGjetal.(2012)Invivogenomeeditingusingahigh-efficiencyTALENsystem.Nature491:114-118(do1:10.1038/naturell537).[0026][20]TessonLjUsalCjMenoretS，LeungE，NilesBJjetal.(2011)KnockoutratsgeneratedbyembryomicroinjectionofTALENs.NatureBiotechnology29:695-696.[0027][21]CarlsonDF，TanWjLillicoSG,StverakovaDjProudfootC，etal.(2012)EfficientTALEN—mediatedgeneknockoutinlivestock.ProcNatlAcadSciUSA109:17382-17387[0028][22]CermakTjDo`yleELjChristianMjWangL，ZhangY，etal.(2011)EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedco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發(fā)明內容】[0039]本發(fā)明人通過一系列實驗證明上述半個重復是可以省略的，因此可以簡化dTALEs或TALENs的裝配技術，為dTALEs和TALENs的構建提供了更簡便且節(jié)約成本的方法。[0040]本發(fā)明提供的技術方案是:一種通用載體pSK-RAR-U的構建方法，包括以下步驟:[0041]第一步，以pSK-avrXa23質粒DNA為模板，分別用引物對TalenFl/TalenRl、TalenF2-U/TalenR2進行PCR擴增，將擴增出的兩個PCR產物混合作模板，再用引物對TalenFl/TalenR2進行搭橋PCR；[0042]第二步，將擴增出的片段回收，與pEASY-Blunt載體重組連接，測序正確的克隆用SphI酶切；[0043]第三步，將酶切片段克隆到中間載體pSK-avrXa23ΔSphF-XH載體，構建成通用的重復可變區(qū)受體質粒載體，命名為pSK-RAR-U；[0044]其中，所述TalenFl、TalenRl、TalenF2-U、TalenR2的序列分別是SEQIDN0.6、SEQIDN0.7、SEQIDN0.11、SEQIDN0.15。[0045]本發(fā)明提供所述方法構建獲得的通用載體pSK-RAR-U。[0046]本發(fā)明還提供所述的通用載體pSK-RAR-U用于構建dTALEs表達載體的方法，包括如下步驟:[0047]第一步，dTALE重復區(qū)序列組裝；[0048]第二步，將dTALE重復區(qū)序列克隆到pSK-RAR-U中。[0049]進一步地，所述的方法，第一步，裝配識別A、T、G和/或C的dTALE重復區(qū)于中間載體中；第二步，將中間載體用Spe1-NheI雙酶切，并將含Spe1-NheI酶切片段回收，再克隆到pSK-RAR-U的NheI位點，即構建成dTALEs表達質粒載體。[0050]本發(fā)明還提供所述的通用載體pSK-RAR-U或所述的方法在對生物基因組進行定點激活、敲除或修飾的dTALEs和TALENs方法中的應用。[0051]上述的應用，其用于黃單胞桿菌屬造成的作物病害；其中的所述作物是水稻，所述病害為白葉枯病，或細菌性條斑病。[0052]本發(fā)明具有以下有益效果:[0053]本發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)dTALE的半個重復(LHR)是可以省略的，因而設計并構建了一個通用的RAR質粒pSK-RAR-U。由于通用RAR質粒pSK-RAR-U能夠接受任何一個通過單元裝配法組裝的dTALE重復區(qū)，進而構建dTALEs表達載體的方法簡化為:第一步為dTALE重復區(qū)序列組裝，第二步為將dTALE重復區(qū)序列克隆到pSK-RAR-U中。相對于現(xiàn)有技術而言，本發(fā)明為dTALEs和TALENs的構建提供了一種全新的更簡便的方法，可以大大節(jié)約時間和和降低成本?！緦＠綀D】【附圖說明】[0054]圖1現(xiàn)有技術中構建dTALE表達質粒載體的程序。[0055]圖2avrXa23部分序列及設計引物位置。[0056]圖3dTALE設計和瞬時表達系統(tǒng)的激活分析。[0057]圖4裝配重復序列載體示意圖。[0058]圖5dTALEs激活水稻感病基因xa27表達并誘導抗病反應。[0059]圖6本發(fā)明簡化的構建dTALE表達質粒載體的程序。[0060]圖7dTEl_0Plus和dTE2_0Plus的激活分析?！揪唧w實施方式】[0061]實施例1工程效應子蛋白(dTALE)表達質粒載體的設計與構建[0062]為了證明dTALE的半個重復(LHR)是可以省略的，首先設計和構建了一系列dTALEs表達質粒及中間載體。[0063]利用具有本申請人:擁有專利的來自水稻白葉枯病菌的天然TALEs之一AvrXa23(專利號為ZL201010256332.8)為構建dTALEs提供骨架載體。dTALEs重復序列模塊的裝配采用“單元模塊裝配方法”(參見參考文獻[17])。[0064]首先構建pSK_avrXa23質粒載體:[0065]根據avrXa23(專利號為:ZL201010256332.8)的C端BamHl酶切(GGATCC)位點至終止子(TGA)的序列(序列長度175bp)設計引物，弓丨物AvrXa23F05’端引入CTGAT和XbaI酶切位點(AvrXa23R):5’-TCTAGACTGATGGATCCTGGTACGCCCATCGC),AvrXa23R05>端引入HindIII酶切位點(AvrXa23R0:5’-AAGCTTTCAGATCGTCCCTCCGACTGAGCCTG)，擴增P99ACo45克隆(專利號為:ZL201010256332.8)，擴增出180bp,連接到pEASY-Blunt(北京全式金生物技術有限公司)載體上，測序正確的克隆用Xbal/Hindlll雙酶切，回收180bp片段，與pBluescriptIIsk(Xbal/Hindlll雙酶切)線性載體連接,命名為pSK_180bp。[0066]將pSK_180bp質粒DNA用BamHl酶切,堿性磷酸酶脫磷(Shrimp),脫磷后無水乙醇沉淀，備用。將P99ACo45克隆用BamHl酶切，回收4.3Kb的DNA片段，與pSK_180bp(BamHl酶切)連接，轉化后在含有氨芐青霉素(100μg/ml)LB固體培養(yǎng)基上生長，隨機挑取單克隆，提質粒，PCR檢測方向正確的，命名為PSK-avrXa23。[0067]其次,按下述步驟構建dTALEs表達質粒載體:[0068]1.將含有avrXa23基因的pBluescriptSK+質粒DNA(pSK_avrXa23)(參見參考文獻[29])，用SphI酶切，去除SphI酶切的DNA片段(包含重復可變區(qū))，將含有avrXa23的N端和C端DNA序列的載體在T4連接酶作用下自連，形成一個中間質粒載體,命名為pSK-avrXa23ΔSphF(即avrXa23沒有SphI片段)[圖1:⑴]。[0069]2.根據avrXa23DNA序列在N端和C端設計引物，在N端引物的5’加入XbaI酶切位點(引物avrXa23F6，表1)，在C端引物的5’加入HindIII酶切位點(avrXa23R6)，以pSK-avrXa23ΔSphF質粒DNA為模板進行PCR擴增，擴增片段重組到pBluescriptIISK(SmaI酶切線性DNA)載體上，形成一個中間載體，命名為PSK_avrXa23ΔSphF-XH[圖1:⑵]。[0070]3.引入NheI酶切位點及pSK-RAR中間載體構建[0071]根據avrXa23序列設計引物，具體位置及序列如圖2和表1。以pSK_avrXa23質粒DNA為模板，分別用引物對TalenFl/TalenRl、Talen(HD,NG、NN)F2/TalenR2、TalenFl/TalenRl和TalenF2_0N(N代表A、T、C)/TalenR2進行PCR擴增，將擴增出的PCR產物再進行搭橋PCR，引入NheI酶切位點([圖1:(3)])。即TalenFl/TalenRl的PCR產物與Talen(HD、NG、NN)F2/TalenR2的PCR產物搭橋擴增片段(含有LHR)；TalenFl/TalenRl的PCR產物與TalenF2-0N/TalenR2的PCR產物搭橋擴增片段(缺失LHR)，將擴增出的片段分別膠回收，與pEASY-Blunt(北京全式金生物技術有限公司)載體重組連接，測序正確的克隆用SphI酶切[圖1:(4)]。將酶切片段分別克隆到上述構建的中間載體PSK-avrXa23ΔSphF-XH載體，構建成重復可變區(qū)受體(repeat-array-receptor,RAR)質粒載體，分別命名為pSK-RAR,pSK-RAR-Ο[圖1:(5)]。[0072]4.重復可變區(qū)(RVD)中間載體構建[0073]根據潮霉素基因HptII(GenBank:AF354045.1)的開放閱讀框的序列選擇了2個DNA片段作為dTALEs的結合兀件(EBE,TALeffectorbindingelement),其中EBEl的序列為5’-TCTCGTGCTTTCAGCTTC-3’;EBE2的序列為5’-TATTTACCCGCAGGACAT-3(圖3b)。根據水稻材料IR24含有的感病基因位點xa27的啟動子序列，選擇一段DNA片段作為EBE3，其序列為5’-TATAAATAGAAGAGACCAATAGAG-3’(圖5a)。根據重復可變區(qū)(RVD)結構特點，每一個重復含有34個氨基酸，每個重復的第12和13位雙連氨基酸識別DNA堿基的規(guī)律即:N1、HD、NG和NN分別識別A、C、T和G，構建RVD載體。[0074]根據HuangPeng等的裝配方法(參見參考文獻[17])，先合成4個分別識別核酸堿基A、C、T和G的102bp(編碼34個氨基酸)的DNA重復單元，分別連接到pUC19載體上，命名為pA、pC、pT和pG(圖1)，依此單元載體分別裝配含有15、16重復單元的識別EBEl和EBE2的中間載體TN-KJl、TN-KJl-1、TN-KJ2、TN-KJ2-1，含有21、22個重復單元的識別EBE3的中間載體TN-KJ24和TN-KJ24-1[圖1:(6)、圖4]。[0075]5.pdTE表達質粒載體構建[0076]將上述構建的TN-KJl、TN-KJl-1、TN-KJ2、TN-KJ2-1、TN-KJ24和TN-KJ24-1分別用Spe1-NheI雙酶切，回收含有重復單元的片段，分別與pSK-RAR、pSK-RAR-Ο連接，構建成pdTEl、pdTE2(含有標準的LHR)，pdTEl-O、pdTE2-0(缺失LHR)，pdTEl-1、pdTE2_l(LHR被一個完整的34個氨基酸取代)及pdTE24(含有標準的LHR)，pdTE24_0(缺失LHR)[圖1:⑵-⑶]、圖3a、圖5b、表2]。[0077]6.植物表達載體及病原菌表達載體構建[0078]首先將植物表達載體pCAMBIA1305中的⑶S基因片段酶切掉，將pdTEl、pdTEl_0、pdTEl-Ι、pdTE2、pdTE2-0和pdTE2_l分別用Xba1-HindIII雙酶切，將含有N端、C端、重復單元等編碼完整TALEs的片段分別克隆到pCAMBIA1305(無⑶S基因)中，構建成植物表達載體，分別命名為pCdTEl、pCdTEl-0、pCdTEl-l、pCdTE2、pCdTE2-0和pCdTE2_l，將上述質粒載體轉入農桿菌EHA105中，備用。[0079]將pdTE24和pdTE24_0用Hindi11單酶切，與pHMl載體(參見參考文獻[30])連接，構建成病原菌表達載體，命名為pHdTE24和pHdTE24-0，電擊轉入水稻白葉枯病強致病菌PX099中，備用。[0080]7.⑶S報告基因載體R印I和R印2的構建[0081]以誘導型啟動子BjChl(參見參考文獻[31])為模板，設計引物，上游引物在5’端引入HindIII酶切位點及EBEl或EBE2序列，下游引物在5’端引入NcoI酶切位點序列(表I)。[0082]以BjChl序列為模板，用URP1/URP2，URP3/URP2引物(表1)分別擴增，擴增產物分別克隆到pEASY-Blunt載體(北京全式金生物技術有限公司)中，測序正確后，質粒DNA用HindIII/Ncol雙酶切回收外源片段約142bp片段，分別克隆到pCAMBIA1305(已用Hindlll/Ncol雙酶切去除3`5S啟動子)中，構建成含有GUS基因的報告載體，命名為R印I和R印2(圖3b)，轉入農桿菌EHA105中，備用。[0083]表1設計引物序列[0084]【權利要求】1.一種通用載體PSK-RAR-U的構建方法，其特征在于，包括以下步驟:第一步，以含有avrXa23基因的pBluescriptSK+質粒即pSK_avrXa23質粒DNA為模板，分別用引物對TalenFl/TalenRl、TalenF2_U/TalenR2進行PCR擴增，將擴增出的兩個PCR產物混合作模板，再用引物對TalenFl/TalenR2進行搭橋PCR；第二步，將擴增出的片段回收，與pEASY-Blunt載體重組連接，測序正確的克隆用Sphl酶切；第三步，將酶切片段克隆到中間載體PSK-avrXa23ΔSphF-XH載體，構建成通用的重復可變區(qū)受體質粒載體，命名為pSK-RAR-U；其中，所述TalenFl、TalenRl、TalenF2-U、TalenR2的序列分別是SEQIDN0.6,SEQIDN0.7、SEQIDN0.1USEQIDN0.15；其中，所述中間載體pSK-avrXa23ΔSphF-XH載體構建方法如下:(1)將(PSK-avrXa23用Sphl酶切，去除Sphl酶切的DNA片段，將含有avrXa23的N端和C端DNA序列的載體在T4連接酶作用下自連，形成的載體命名為PSK-avrXa23ΔSphF,其中avrXa23沒有Sphl片段；(2)用引物avrXa23F6和avrXa23R6，以pSK_avrXa23ΔSphF載體為模板進行PCR擴增，擴增片段重組到pBluescriptIISK的5)胳1酶切線性DNA上，形成的中間載體即為pSK-avrXa23ΔSphF-XH;所述引物avrXa23F6和avrXa23R6的序列分別為SEQIDN0.4和SEQIDN0.5。2.一種如權利要求1所述方法構建獲得的通用載體pSK-RAR-U。3.一種如權利要求2所述的通用載體pSK-RAR-U用于構建dTALEs表達載體的方法，其特征在于包括如下步驟:第一步，dTALE重復區(qū)序列組裝；第二步，將dTALE重復區(qū)序列克隆到pSK-RAR-U中。4.一種如權利要求3所述的方法，其特征在于:第一步，裝配識別A、T、G和/或C的dTALE重復區(qū)于中間載體中；第二步，將中間載體用Spe1-NheI雙酶切，并將含Spe1-NheI酶切片段回收，再克隆到pSK-RAR-U的船eI位點，即構建成dTALEs表達質粒載體。5.如權利要求2所述的通用載體pSK-RAR-U、如權利要求3或4所述的方法在對生物基因組進行定點激活、敲除或修飾的dTALEs和TALENs方法中的應用。6.如權利要求5所述的應用，其用于黃單胞桿菌屬造成的作物病害。7.如權利要求5所述的應用，其中所述作物是水稻，所述病害為白葉枯病或細菌性條斑病。【文檔編號】C12N15/66GK103805624SQ201410032382【公開日】2014年5月21日申請日期:2014年1月23日優(yōu)先權日:2014年1月23日【發(fā)明者】趙開軍,王春連,鄭崇珂,張曉平,王福軍,秦騰飛申請人:中國農業(yè)科學院作物科學研究所