專利名稱：：可降解的基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物、制法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可降解的基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物、制法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：基因轉(zhuǎn)染是多年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，而限制基因轉(zhuǎn)染發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素是基因載體材料的發(fā)展。基因載體材料一般分為病毒類和非病毒類，而非病毒基因載體材料中最為著名的是超支化的重均分子量為25K的聚乙烯亞胺，簡稱PEI25K，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，研究學(xué)者將其歸因于"質(zhì)子海綿效應(yīng)"參見Boussif0，ZantaM.A，BehrJ.P，etal.Aversatilevectorforgeneandoligonucleotidetransferintocellsincultureandinvivo-polyethylenimine.PROCEEDINGSOFTHENATIO亂ACADEMYOFSCIENCESOFTHEUNITEDSTATESOFAMERICA,1995，92(16):7297-7301。然而，其不可降解的特性和很高的細(xì)胞毒性極大地限制了其應(yīng)用前景參見LungwitzU，BreunigM，BlunkT，etal.Polyethylenimine—basednon_viralgenedeliverysystems.EUROPEANJ0URNAL0FPHARMACEUTICSANDBIOPHA薩CEUTICS，2005，60(2):247-266。而具有相似結(jié)構(gòu)的寡聚乙烯亞胺由于分子量小，生物可以排泄出去，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛關(guān)注參見YangC，WangX，LiHZ，GohSH，LiJ.Synthesisandcharacterizationofpolyrotaxanesconsistingofcationicalpha-cyclodextrinsthreadedonpoly[(ethyleneoxide)_ran_(propyleneoxide)]asgenecarriers.BI0MACR0M0LEC1XES，2007,8(11):3365-3374。聚磷腈類化合物由于其可降解性和良好的生物相容性在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用，包括其在基因載體領(lǐng)域的應(yīng)用參見LutenJ，vanSteenisJH，vanSomerenR，etal.Water—solublebiodegradablecationicpolyphosphazenesforgenedelivery.JOURNALOFCONTROLLEDRELEASE,2003，89(3):483-497。而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，直接以單體六氯環(huán)三磷腈而非聚磷腈的應(yīng)用尚未見諸報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容為了解決已有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明通過將寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)形成一種可降解的基因載體材料，不僅提高了轉(zhuǎn)染效率，而且降低了細(xì)胞毒性，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明涉及可降解的基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物、制法和應(yīng)用?？山到獾幕诠丫垡蚁﹣啺放c六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物，其結(jié)構(gòu)式如下NH:優(yōu)選分子量為4231800的寡聚乙烯亞胺?？山到獾幕诠丫垡蚁﹣啺放c六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物的制備方法的步驟和條件如下(1)按照寡聚乙烯亞胺在干燥氯仿中質(zhì)量體積濃度為550g/L，將寡聚乙烯亞胺溶于干燥氯仿中，注入到干燥反應(yīng)器內(nèi)；(2)然后，按照寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈的物質(zhì)量的比為2:13:l，稱取六氯環(huán)三磷腈并按照六氯環(huán)三磷腈在干燥氯仿中質(zhì)量體積濃度為520g/L，將六氯環(huán)三磷腈溶于干燥氯仿；(3)把步驟(2)得到的六氯環(huán)三磷腈的氯仿溶液注入到干燥的恒壓滴液漏斗中，攪拌條件下，以14ml/min的速度滴加到步驟(1)的寡聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，室溫下反應(yīng)510天，G4砂芯漏斗過濾，旋蒸，濃縮濾液，于0°C的正己烷中沉降，真空干燥，得到的粗產(chǎn)物溶于去離子水中，于截留分子量為3，500的透析袋中對去離子水透析3天，G4砂芯漏斗過濾，凍干，得到基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物(簡稱PTP)?？山到獾幕诠丫垡蚁﹣啺放c六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物的應(yīng)用，其在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。可降解的基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的用法，其步驟和條件如下(1)細(xì)胞的培養(yǎng)將細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37t:含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。(2)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時(shí)內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基稀釋，按每孔IX104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37t:含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到8090%，轉(zhuǎn)染時(shí)，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒以及無血清或者含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至終體積200ii1，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。(3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計(jì)測定轉(zhuǎn)染效率。(4)細(xì)胞毒性測試采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法比較評價(jià)基因載體材料的細(xì)胞毒性。:卩p/4實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)基稀釋，按每孔1X104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37t:含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度到達(dá)8090%，將不同濃度的材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔分別加入20ii1含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%MTT的PBS溶液，混合物在37"繼續(xù)作用4小時(shí)，加入200二甲基亞砜溶解MTT甲臢結(jié)晶10分鐘，然后用酶標(biāo)儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm，細(xì)胞存活率按下公式計(jì)算細(xì)胞存活率(％)=(As—乂A一r?！稾100Asam*是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞樣品孔的吸收，A。。ntw是不與復(fù)合物溶液作用的細(xì)胞樣品孔的吸收，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。可降解的基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的用法，其步驟和條件如下取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細(xì)胞的細(xì)胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機(jī)分為兩組，每組6只，分別在瘤內(nèi)注射含5i！g熒光素酶質(zhì)粒的基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒溶液100iU。第二天重復(fù)注射一次，注射后48小時(shí)，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。在進(jìn)行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉。麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200iU熒光素酶底物，10分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。有益效果通過本發(fā)明制備的交聯(lián)網(wǎng)狀聚合物用作非病毒基因載體材料時(shí)，其最高轉(zhuǎn)染效率為商品化的PEI25K的3倍多，而細(xì)胞毒性在濃度20iig/ml時(shí)僅為PEI25K的1/3左右，是一種低毒高效的非病毒基因載體，具有廣泛的應(yīng)用前景。圖1是實(shí)施例2的用分子量為600的超支化寡聚乙烯亞胺制備的目標(biāo)產(chǎn)物的體外轉(zhuǎn)染效率柱形圖。圖2是用分子量為600的超支化寡聚乙烯亞胺制備的目標(biāo)產(chǎn)物的細(xì)胞毒性曲線。B為實(shí)施例2的PTP-2-3，A為實(shí)施例2的PTP-2-2.5，V為實(shí)施例2的PTP-2-2，參為PEI25K。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:用分子量為423的線形寡聚乙烯亞胺制備目標(biāo)產(chǎn)物(1)按照寡聚乙烯亞胺在干燥氯仿中質(zhì)量濃度為50g/L，稱取0.423g分子量為423的線形寡聚乙烯亞胺溶于8.5ml干燥氯仿中，注入到干燥反應(yīng)器內(nèi)；(2)然后，分別按照表1的寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈的物質(zhì)的量比為2:1、2.5:l和3:1，稱取六氯環(huán)三磷腈并按照六氯環(huán)三磷腈在干燥氯仿中質(zhì)量濃度為5g/L，將六氯環(huán)三磷腈分別溶于干燥氯仿；(3)把步驟(2)得到的六氯環(huán)三磷腈的氯仿溶液分別注入到干燥的恒壓滴液漏斗中，攪拌條件下，以lml/min的速度滴加到步驟(1)的寡聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，室溫下反應(yīng)5天，G4砂芯漏斗過濾，旋蒸，濃縮濾液，于(TC的正己烷中沉降，真空干燥，分別得到的粗產(chǎn)物溶于去離子水中，于截留分子量為3，500的透析袋中對去離子水透析3天，G4砂芯漏斗過濾，凍干，分別得到基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物PTP-l-2、PTP-l-2.和PTP-l-3。詳見表1。表1:用分子量為423的線形寡聚乙烯亞胺制備目標(biāo)產(chǎn)物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例2:用分子量為600的超支化寡聚乙烯亞胺制備目標(biāo)產(chǎn)物(1)按照寡聚乙烯亞胺在干燥氯仿中質(zhì)量濃度為20g/L，稱取0.6g分子量為600的超支化寡聚乙烯亞胺溶于30ml干燥氯仿中，注入到干燥反應(yīng)器內(nèi)；(2)然后，分別按照表2的寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈的物質(zhì)的量比為2:1、2.5:l和3:1，稱取六氯環(huán)三磷腈并按照六氯環(huán)三磷腈在干燥氯仿中質(zhì)量濃度為10g/L，將六氯環(huán)三磷腈分別溶于干燥氯仿；(3)把步驟(2)得到的六氯環(huán)三磷腈的氯仿溶液分別注入到干燥的恒壓滴液漏斗中，攪拌條件下，以2ml/min的速度滴加到步驟(1)的寡聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，室溫下反應(yīng)7天，G4砂芯漏斗過濾，旋蒸，濃縮濾液，于(TC的正己烷中沉降，真空干燥，分別得到的粗產(chǎn)物溶于去離子水中，于截留分子量為3，500的透析袋中對去離子水透析3天，G4砂芯漏斗過濾，凍干，分別得到基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物PTP-2-2、PTP-2-2.5和PTP-2-3。i羊見表2。表2:用分子量為600的超支化寡聚乙烯亞胺制備目標(biāo)產(chǎn)物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例3:用分子量為1800的超支化寡聚乙烯亞胺制備目標(biāo)產(chǎn)物。(1)按照寡聚乙烯亞胺在干燥氯仿中質(zhì)量濃度為5g/L，稱取0.9g分子量為1800的超支化寡聚乙烯亞胺溶于180ml干燥氯仿中，注入到干燥反應(yīng)器內(nèi)；(2)然后，分別按照表3的寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈的物質(zhì)的量比為2:1、2.5:l和3:1，稱取六氯環(huán)三磷腈并按照六氯環(huán)三磷腈在干燥氯仿中質(zhì)量濃度為20g/L，將六氯環(huán)三磷腈分別溶于干燥氯仿；(3)把步驟(2)得到的六氯環(huán)三磷腈的氯仿溶液分別注入到干燥的恒壓滴液漏斗中，攪拌條件下，以4ml/min的速度滴加到步驟(1)的寡聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，室溫下反應(yīng)IO天，G4砂芯漏斗過濾，旋蒸，濃縮濾液，于0t:的正己烷中沉降，真空干燥，分別得到的粗產(chǎn)物溶于去離子水中，于截留分子量為3，500的透析袋中對去離子水透析3天，G4砂芯漏斗過濾，凍干，分別得到基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物PTP-3-2、PTP-3-2.5和PTP-3-3。詳見表3。表3:用分子量為1800的超支化寡聚乙烯亞胺制備目標(biāo)產(chǎn)物目標(biāo)產(chǎn)物編號寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈物質(zhì)的量比分子量PDIPTP-3-22/1168001.35PTP-3-2.52.5/164861.25PTP-3-33/156501.22實(shí)施例4:目標(biāo)產(chǎn)物介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒對人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)的體外轉(zhuǎn)染1、HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)取HeLa細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37。C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。2、體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時(shí)內(nèi)，取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔1乂104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于體積分?jǐn)?shù)為5%0)2、371:孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度到達(dá)8090%。轉(zhuǎn)染時(shí)，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，更換200ii1/孔含有體積分?jǐn)?shù)10X胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液，再選用熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)分別加入實(shí)施例1-3得到的各種目標(biāo)產(chǎn)物與pGL3及PEI25k/pGL3的復(fù)合物顆粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染對比，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。3、體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，使用照度計(jì)測定轉(zhuǎn)染效率，表示為每毫克蛋白的發(fā)光單元數(shù)(RLU/mgProtein)，測試結(jié)果見圖1。實(shí)施例5:目標(biāo)產(chǎn)物的細(xì)胞毒性測試1、HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)取HeLa細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37。C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。2、毒性測試采用MTT的方法比較評價(jià)實(shí)施例1-3得到的各種目標(biāo)產(chǎn)物和PEI25k的材料細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)內(nèi)，取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔1X104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37t:含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到8090%。將不同濃度的材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔分別加入20ii1含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%MTT的PBS溶液?；旌衔镌?7t:繼續(xù)作用4小時(shí)，加入200yl二甲基亞砜溶解MTT甲臢結(jié)晶10分鐘。然后用酶標(biāo)儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm。細(xì)7胞存活率按下公式計(jì)算細(xì)胞存活率(％)=(As—乂A一r?！稾100Asample是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞樣品孔的吸收，A。。ntw是不與復(fù)合物溶液作用的細(xì)胞樣品孔的吸收，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，測試結(jié)果見圖2。實(shí)施例6:PTP-2-2介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細(xì)胞的細(xì)胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機(jī)分為兩組，每組6只，分別在瘤內(nèi)注射含5iig熒光酶質(zhì)粒(pGL3)的PTP-2-2/pGL3與PEI25K/pGL3復(fù)合物顆粒溶液100yl。第二天重復(fù)注射一次，注射后48小時(shí)，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。在進(jìn)行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉。麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200ii1熒光素酶底物。10分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。權(quán)利要求可降解的基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如下F200910217839XC0000011.tif2.如權(quán)利要求1所述的可降解的基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物，其特征在于，寡聚乙烯亞胺的分子量為4231800。3.權(quán)利要求1所述的可降解的基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物的制備方法，其特征是步驟和條件如下(1)按照寡聚乙烯亞胺在干燥氯仿中質(zhì)量體積濃度為550g/L，將寡聚乙烯亞胺溶于干燥氯仿中，注入到干燥反應(yīng)器內(nèi)；(2)然后，按照寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈的物質(zhì)量的比為2:13:l，稱取六氯環(huán)三磷腈并按照六氯環(huán)三磷腈在干燥氯仿中質(zhì)量體積濃度為520g/L，將六氯環(huán)三磷腈溶于干燥氯仿；(3)把步驟(2)得到的六氯環(huán)三磷腈的氯仿溶液注入到干燥的恒壓滴液漏斗中，攪拌條件下，以14ml/min的速度滴加到步驟(1)的寡聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，室溫下反應(yīng)5IO天，G4砂芯漏斗過濾，旋蒸，濃縮濾液，于(TC的正己烷中沉降，真空干燥，得到的粗產(chǎn)物溶于去離子水中，于截留分子量為3，500的透析袋中對去離子水透析3天，G4砂芯漏斗過濾，凍干，得到基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物。4.權(quán)利要求1所述的可降解的基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物在基因傳遞中的應(yīng)用，其特征在于，其在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。5.權(quán)利要求1所述的可降解的高效基因載體材料在基因傳遞中的應(yīng)用，其特征在于，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。全文摘要本發(fā)明涉及可降解的基于寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈交聯(lián)化合物、制法和應(yīng)用。將寡聚乙烯亞胺與六氯環(huán)三磷腈分別溶解于干燥的有機(jī)溶劑中，在攪拌情況下，將六氯環(huán)三磷腈溶液通過恒壓滴液漏斗滴加到寡聚乙烯亞胺溶液中，在室溫下交聯(lián)形成網(wǎng)狀聚合物，透析，凍干提純。通過本發(fā)明制備的交聯(lián)網(wǎng)狀聚合物用作非病毒基因載體材料時(shí)，其最高轉(zhuǎn)染效率為商品化的PEI25K的3倍多，而細(xì)胞毒性在濃度20μg/ml時(shí)僅為PEI25K三分之一左右，是一種低毒高效的非病毒基因載體，具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號C12N15/85GK101735454SQ200910217839公開日2010年6月16日申請日期2009年11月12日優(yōu)先權(quán)日2009年11月12日發(fā)明者夏加亮,景遐斌,李非凡,田華雨,陳學(xué)思申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所