專利名稱：大黃魚和小黃魚種質(zhì)鑒別引物和鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及四種引物、大黃魚和小黃魚，尤其是涉及大黃魚和小黃魚種質(zhì)鑒別的 引物和鑒別方法。
背景技術(shù)：
大黃魚(Pseudosciaena crocea(Richardson)，Large Yellow Croaker)禾口 小黃魚(Pseudosciaena plyactis (Bleeker), Small Yellow Croaker)隸屬于倉盧形目 (Perciformes)，鱸亞目(Percoidei)，石首魚科(Sciaenidae)，黃魚屬(Larimichthys)，曾 占據(jù)了中國“四大漁業(yè)”的半壁江山，在過去數(shù)量多、魚群大，形成具有首要經(jīng)濟(jì)意義的黃花 魚漁汛。上世紀(jì)70年代末以來，由于過度捕撈和環(huán)境變化，小黃魚資源嚴(yán)重衰退，而大黃魚 資源接近枯竭。繼我國政府及相關(guān)管理部門采取一系列漁政保護(hù)措施后，近10年來，大黃 魚和小黃魚資源呈逐年恢復(fù)之勢，但其群體仍表現(xiàn)出小型化、低齡化與早熟化等特征。為更 好地保護(hù)與合理開發(fā)大黃魚和小黃魚種質(zhì)資源，亟待準(zhǔn)確評(píng)估二者的資源量和分布狀況， 而此項(xiàng)工作的前提是必須找到能夠準(zhǔn)確鑒別大黃魚和小黃魚的方法。大黃魚和小黃魚親緣關(guān)系十分相近，外形又很相似，目前，國內(nèi)外對(duì)兩物種的鑒別 主要依據(jù)形態(tài)學(xué)特征判斷其一，大黃魚的尾柄長度(即臀鰭基部終點(diǎn)至尾鰭基底之間的 垂直距離)為其高度的3倍以上，而小黃魚的尾柄長僅為其高的2倍以上；其二，大黃魚在 側(cè)線之上的魚鱗有8-9行，而小黃魚只有5-6行，相形之下，大黃魚的魚鱗顯得較小，小黃魚 反而較大，但這也僅僅是兩者比較而言；如果在外形上難以區(qū)別它們時(shí)，可剖開腹腔觀察其 鰾側(cè)肢的分枝的情況，大黃魚的鰾側(cè)肢的前小枝和后小枝一樣長，小黃魚的鰾側(cè)肢的前小 枝延長，后小枝短小。一般情況下，成熟個(gè)體大黃魚的體形較小黃魚大，但這并非固定特征， 不能作為判斷大黃魚和小黃魚的主要依據(jù)。由此可見，這種僅靠肉眼識(shí)別的形態(tài)學(xué)鑒定方 法不僅要求具有較高水平的專業(yè)分類學(xué)知識(shí)，只有成熟的大黃魚和小黃魚個(gè)體才具有一定 的可操作性，但也很容易發(fā)生二者混淆的現(xiàn)象。另外，大黃魚和小黃魚的魚卵、仔稚幼魚的 形態(tài)學(xué)特征不明顯，所以無法依據(jù)形態(tài)學(xué)特征對(duì)二者進(jìn)行鑒別。另外，大黃魚和小黃魚肉質(zhì)都細(xì)嫩鮮美，營養(yǎng)豐富，是人們喜食的海鮮。除鮮食外， 還可加工成鲞，為名貴的水產(chǎn)品。但加工之后，已失去原有外部形態(tài)特征，更使得二者之間 的鑒別難以進(jìn)行。因此，亟需一種快捷方便、準(zhǔn)確可靠的物種鑒別方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有大黃魚和小黃魚鑒別形態(tài)學(xué)鑒別方法的不足，提供一 種能夠同時(shí)鑒別大黃魚和小黃魚兩個(gè)物種的鑒別引物。本發(fā)明的另一目的在于利用上述鑒 別引物建立大黃魚和小黃魚種質(zhì)鑒別的方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種大黃魚和小黃魚種質(zhì)鑒別引物和 鑒別方法，引物序列為Fl :5，-TCGGCCTCCTGGGATTTATTGTC-3，；
F2 :5’ -ATTATCCTGACGGGTACGCTCTAT-3’ ；Rl :5，-ACACGCGGGGGTCTAAC-3，；
R2 5，-ATATGCATCGGGGTAATCTGAGTA-3，。一種利用上述鑒別引物建立大黃魚和小黃魚種質(zhì)鑒別的方法，其特征在于，鑒別 方法步驟如下1)采用酚氯仿提取法提取大黃魚或小黃魚樣品的DNA ；2) PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR反應(yīng)體系為25 μ L，各種成分及終濃度為BufferlOmM，dNTP 0. 2mM, Mg2+L 5mM，4種引物每種0. 2mM, Taq 1U，疑似大黃魚或小黃魚樣品的DNA 50ng, 用雙蒸水補(bǔ)齊到 25 μ L, PCR 反應(yīng)程序是 95°C 5min, (95 °C 30sec — 55°C 30sec — 72°C lmin) X 30 個(gè)循環(huán)—72 °C IOmin ；3)電泳染色對(duì)比圖譜PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，加入 Genefinder，然后在紫外透射反射分析儀下觀察、照相和記錄，根據(jù)電泳結(jié)果與提供的標(biāo)準(zhǔn) 圖譜對(duì)比，如果同時(shí)出現(xiàn)一條大小為853bp和一條大小為371bp的兩條特異性條帶，則表明 該樣品為大黃魚；如果同時(shí)出現(xiàn)一條大小為853bp和一條大小為502bp的兩條特異性條帶， 則表明該樣品為小黃魚。詳見圖1。對(duì)上述技術(shù)方案的改進(jìn)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取8 μ L產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有許多優(yōu)點(diǎn)和積極效果本方法是國內(nèi)外首次基于分子生物學(xué)技術(shù)原理建立的一種大黃魚和小黃魚種質(zhì) 鑒別新方法，它利用來自大黃魚和小黃魚線粒體基因組設(shè)計(jì)合成了 4條特異性引物，建立 了一個(gè)PCR反應(yīng)就可以實(shí)現(xiàn)鑒別大黃魚和小黃魚種質(zhì)的新方法。本方法無需依賴專業(yè)的分 類學(xué)背景，也不要求具有長期從事魚類鑒別的豐富經(jīng)驗(yàn)，不僅可以鑒別大黃魚和小黃魚的 完整個(gè)體，還可以鑒別其加工產(chǎn)品，具有準(zhǔn)確快捷、客觀公正、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)。且可用于研 究黃魚魚卵、仔稚幼魚的群落結(jié)構(gòu)、產(chǎn)卵場位置及其擴(kuò)散路徑，了解其早期生活史，評(píng)估海 洋黃魚資源，查明海產(chǎn)品市場上存在的標(biāo)識(shí)錯(cuò)誤問題等方面。


圖1為大黃魚和小黃魚的特征譜帶，M是DNA marker (DL2000)，S是小黃魚的特征 譜帶，L是大黃魚的特征譜帶。圖2為大黃魚與小黃魚樣品電泳檢測結(jié)果，其中M是DNA marker (DL2000), S1-S5 是小黃魚樣品，L1-L5是大黃魚樣品。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例一本發(fā)明一種能夠同時(shí)鑒別大黃魚和小黃魚兩個(gè)物種的鑒別引物，引物 序列為Fl :5，-TCGGCCTCCTGGGATTTATTGTC-3，；F2 :5’ -ATTATCCTGACGGGTACGCTCTAT-3’ ；Rl :5，-ACACGCGGGGGTCTAAC-3，；R2 :5， -ATATGCATCGGGGTAATCTGAGTA-3，。
實(shí)施例二本發(fā)明一種利用上述鑒別引物建立大黃魚和小黃魚種質(zhì)鑒別的方法， 各選用5尾成熟個(gè)體的大黃魚和小黃魚，根據(jù)專業(yè)形態(tài)學(xué)鑒定后，按照常規(guī)方法采用酚/氯 仿抽提法(參見黃培堂等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)，科學(xué)出版社，2002年9月) 提取大黃魚或小黃魚的DNA，利用本方法中提供的4種引物，對(duì)其基因組進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反 應(yīng)體系為25 μ L，各種成分及終濃度為Buffer IOmM, dNTP 0. 2mM, Mg2+L 5mM，4種引物每 種0. 2mM, Taq 1U，大黃魚或小黃魚樣品DNA 50ng,用雙蒸水補(bǔ)齊到25 μ L，PCR反應(yīng)程序是 950C 5min, (95°C 30sec — 55°C 30sec — 72°C lmin) X 30 個(gè)循環(huán)—72°C IOmin0PCR反應(yīng)結(jié)束后，取8 μ L產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電 泳檢測，加入Genefinder，然后在 紫外透射反射分析儀下觀察、照相和記錄，根據(jù)電泳結(jié)果與提供的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 5份形態(tài)學(xué)鑒定為大黃魚的樣品均同時(shí)出現(xiàn)一條大小為853bp和一條大小為371bp的兩條 特異性條帶，表明樣品為大黃魚；5份形態(tài)學(xué)鑒定為小黃魚的樣品均同時(shí)出現(xiàn)一條大小為 853bp和一條大小為502bp的兩條特異性條帶，表明樣品為小黃魚。這一結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定 的結(jié)果完全一致，詳見圖2。當(dāng)然，上述說明并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種大黃魚和小黃魚種質(zhì)鑒別引物，引物序列為F15’ TCGGCCTCCTGGGATTTATTGTC 3’；F25’ ATTATCCTGACGGGTACGCTCTAT 3’；R15’ ACACGCGGGGGTCTAAC 3’；R25’ ATATGCATCGGGGTAATCTGAGTA 3’。
2.一種利用上述鑒別引物建立大黃魚和小黃魚種質(zhì)鑒別的方法，其特征在于，鑒別方 法步驟如下1)采用酚氯仿提取法提取大黃魚或小黃魚樣品的DNA；2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR反應(yīng)體系為25 μ L，各種成分及終濃度為Buffer 10mM，dNTP 0. 2mM, Mg2+ 1.5mM，4種引物每種0. 2mM，Taq 1U，疑似大黃魚或小黃魚樣品的DNA 50ng, 用雙蒸水補(bǔ)齊到 25 μ L, PCR 反應(yīng)程序是 95°C 5min, (95°C 30sec — 55°C 30sec — 72°C lmin) X 30 個(gè)循環(huán)—72 °C IOmin ；3)電泳染色對(duì)比圖譜PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，加入 Genefinder，然后在紫外透射反射分析儀下觀察、照相和記錄，根據(jù)電泳結(jié)果與提供的標(biāo)準(zhǔn) 圖譜對(duì)比，如果同時(shí)出現(xiàn)一條大小為853bp和一條大小為371bp的兩條特異性條帶，則表明 該樣品為大黃魚；如果同時(shí)出現(xiàn)一條大小為853bp和一條大小為502bp的兩條特異性條帶， 則表明該樣品為小黃魚。
3.按照權(quán)利要求2所述的利用上述鑒別引物建立大黃魚和小黃魚種質(zhì)鑒別的方法，其 特征在于，PCR反應(yīng)結(jié)束后，取8 μ L產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供一種大黃魚和小黃魚種質(zhì)鑒別引物和鑒別方法，其特點(diǎn)是引物序列為F15’-TCGGCCTCCTGGGATTTATTGTC-3’；F25’-ATTATCCTGACGGGTACGCTCTAT-3’；R15’-ACACGCGGGGGTCTAAC-3’；R25’-ATATGCATCGGGGTAATCTGAGTA-3’。鑒別方法如下采用酚氯仿提取法提取大黃魚或小黃魚樣品的DNA；PCR反應(yīng)體系為25μL，各種成分為Buffer、dNTP、Mg2+、4種引物、Taq、疑似大黃魚或小黃魚樣品的DNA，用雙蒸水補(bǔ)齊到25μL，進(jìn)行PCR；PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察、照相和記錄，根據(jù)電泳結(jié)果與提供的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，進(jìn)行鑒別。鑒別方法快捷、準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101942500SQ200910217269
公開日2011年1月12日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者莊志猛, 戴芳群, 林琳, 柳淑芳, 馬慧 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所