專利名稱：：一種在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種表達牛胰蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
：牛胰蛋白酶(bovinetrypsin,EC3.4.21.4)是一種絲氨酸蛋白酶，選擇性地切除賴氨酸和精氨酸殘基的C末端。作為一種動物源性消化酶，它被廣泛應(yīng)用于酶解法制備乳源生物活性肽。此酶主要來源于牛胰腺，但隨著海綿樣腦病等一系列疾病的出現(xiàn)，從動物體中制備的產(chǎn)品尤其是用于食品業(yè)的產(chǎn)品存在很大的安全性問題。另外，還可以采用大腸桿菌重組法制備該酶，但會形成包涵體。因此，探索一種安全有效的牛胰蛋白酶制備方法意義重大。乳酸乳球菌Lactococcuslactis(L.lactis)是公認的安全性菌株，常用于生產(chǎn)發(fā)酵乳制品。近年來，隨著對其分子遺傳學的不斷深入了解，乳酸乳球菌被廣泛地應(yīng)用于現(xiàn)代生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。但是乳酸乳球菌是一種高度富含AT堿基的原核生物，因此導致牛胰蛋白酶目前還不能在該菌中表達。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有牛胰蛋白酶目前還不能在乳酸乳球菌中表達的問題，而提供一種在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法。在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法按以下步驟實現(xiàn)一、將編碼野生型牛胰蛋白酶氨基酸序列N端的8個氨基酸的密碼子和牛胰蛋白酶中所有編碼Leu和Ary的稀有密碼子替換為乳酸乳球菌的偏愛密碼子，得人工合成牛胰蛋白酶基因(trym)，并在其5'、3'端分別引入帶有NsiI和SpeI的識別序列，然后與克隆載體pUC57—起連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，再篩選陽性轉(zhuǎn)化子pUC57-trym;二、將pUC57_trym和表達載體pSEC-E7分別經(jīng)Nsil和Spel雙酶切后，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建重組表達載體pSEC-trym;三、將pSEC-trym經(jīng)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌感受態(tài)細胞NZ9000,得含有重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌NZ9000-pSEC-trym，然后PCR鑒定；四、將NZ9000-pSEC-trym接種于GM17液體培養(yǎng)基中，在3(TC下厭氧培養(yǎng)過夜后，取培養(yǎng)物，然后以1:25的體積比接種于GM17液體培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，在3(TC下厭氧培養(yǎng)至0D600為0.40.6，再用質(zhì)量濃度lng/ml的乳鏈菌肽Nisin誘導3h，即完成在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶。本發(fā)明不僅能夠安全地制備牛胰蛋白酶，而且能夠提高乳酸乳球菌的水解能力，這對乳源生物活性肽的發(fā)酵法和水解法制備都具有重大的意義。本發(fā)明采用乳酸乳球菌重組法制備牛胰蛋白酶，使人工合成牛胰蛋白酶成功地在乳酸乳球菌中進行表達，且具有生物學活性。4圖1是具體實施一中對所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSEC-trym的PCR鑒定電泳圖，其中M表示DNAMarker,從上到下為2000，1000，750，500，250，lOObp，泳道1是PCR結(jié)果，目的帶大小為892bp;圖2是具體實施一中在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的Westernblot分析圖，其中泳道1是NZ9000-pSEC-trym誘導；圖3是具體實施方式一中在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的活性測定圖。具體實施例方式具體實施方式一本實施方式在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法按以下步驟實現(xiàn)一、將編碼野生型牛胰蛋白酶氨基酸序列N端的8個氨基酸的密碼子和牛胰蛋白酶中所有編碼Leu和Ary的稀有密碼子替換為乳酸乳球菌的偏愛密碼子，得人工合成牛胰蛋白酶基因(trym)，并在其5'、3'端分別引入帶有Nsil和Spel的識別序列，然后與克隆載體pUC57—起連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，再篩選陽性轉(zhuǎn)化子pUC57_trym;二、將pUC57_trym和表達載體pSEC-E7分別經(jīng)NsiI和Spel雙酶切后，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建重組表達載體pSEC-trym;三、將pSEC_trym經(jīng)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌感受態(tài)細胞NZ9000，得含有重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌NZ9000-pSEC-trym，然后PCR鑒定；四、將NZ9000-pSEC-trym接種于GM17液體培養(yǎng)基中，在3(TC下厭氧培養(yǎng)過夜后，取培養(yǎng)物，然后以1:25的體積比接種于GM17液體培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，在3(TC下厭氧培養(yǎng)至0D6。。為0.40.6，再用質(zhì)量濃度lng/ml的乳鏈菌肽Nisin誘導3h，即完成在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶。本實施方式步驟一中人工合成牛胰蛋白酶基因由上海旭冠公司合成。本實施方式步驟一中篩選陽性轉(zhuǎn)化子pUC57-trym，是送到上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行雙向測序；使用DNAMAN進行比對，結(jié)果表明合成的基因與預(yù)期突變結(jié)果一致。本實施方式步驟三中PCR鑒定針對重組質(zhì)粒pSEC-trym設(shè)計引物，如重組質(zhì)粒被成功構(gòu)建，則如圖1所示，經(jīng)PCR會出現(xiàn)預(yù)期892bp大小的條帶。本實施方式步驟四中誘導終止后經(jīng)溶菌酶處理提取菌體總蛋白進行SDS-PAGE(蛋白質(zhì)電泳)、Westernblot(免疫印跡雜交)分析Westernblot結(jié)果如圖2所示，重組菌NZ9000-pSEC-trym經(jīng)乳鏈菌肽Nisin誘導后有目的條帶出現(xiàn)，說明經(jīng)突變的人工合成牛胰蛋白酶在乳酸乳球菌中成功表達。如圖3所示，活性測定結(jié)果顯示在牛胰蛋白酶的預(yù)期大小處紫色凝膠變?yōu)辄S色，說明表達的人工合成牛胰蛋白酶具有生物學活性。具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一不同的是步驟一中野生型牛胰蛋白酶基因序列如SEQIDN0:1所示。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。本實施方式中野生型牛胰蛋白酶基因序列來自基因文庫(美國國立生物技術(shù)信息中心，www.ncbi.nlm.nih.gov)。具體實施方式三本實施方式與具體實施方式一不同的是步驟一中人工合成牛胰蛋白酶基因的序列SEQIDNO:3。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式四本實施方式與具體實施方式一不同的是步驟二中雙酶切的體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>雙酶切反應(yīng)條件為37t:下反應(yīng)2h。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式五本實施方式與具體實施方式一不同的是步驟二中雙酶切的體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>雙酶切反應(yīng)條件為37t:下反應(yīng)2h。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式六本實施方式與具體實施方式一不同的是步驟三中PCR的體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>PCR反應(yīng)條件為98"下預(yù)變性20s，98t:下變性10s，56"下退火15s，72"下延伸1.5min，共循環(huán)35次，72。C下終延伸2min，4t:下保存。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式七本實施方式與具體實施方式一不同的是步驟四中GM17液體培養(yǎng)基由4.225%肉湯和0.5%葡萄糖組成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。序列表〈110〉東北農(nóng)業(yè)大學〈120〉在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法〈160>5〈210>1〈211>672〈212>DNA〈213〉牛(Bos)〈220〉〈221>CDS〈222〉(1).(672)〈400>1atcgtgggcggctacacctgtggggcaaatactgtcccctacc朋gtg48lieValGlyGlyTyrThrCysGlyAlaAsnThrValProTyrGinVal151015tccctgaactctggctacC3Cttctgcgggggctccetcate朋cage96SerLeuAsnSerGlyTyrHisPheCysGlyGlySerLeulieAsnSer202530cagtgggtggtgtctgcggetC3Ctgctac朋gtccggaatec朋gtg144GlnTrpValValSerAlaAlaHisCysTyrLysSerGlylieGinVal354045cgtctgggag朋g￡lC朋catt朋tgtcgttgagggcgagc朋ttc192ArgLeuGlyGluAspAsnlieAsnValValGluGlyAsnGluGinPhe505560atc3gCgC3tcc朋gElgtategtccatcccagetactea朋c3CC240lieSerAlaSerLysSerlieValHisProSerTyrAsnSerAsnThr65707580ttaaacaacg￡lCateEltgctgattctgteagetgccElgtetc288LeuAsnAsnAsplieMetLeulieLysLeuLysSerAlaAlaSerLeu859095朋cageCg3gt￡lgcctctatetctctgCC3tcctgtgcctctget336AsnSerArgValAlaSerlieSerLeuProThrSerCysAlaSerAla100105110ggcacccagtgtetcatetctggctggggc3CCageElgtggc384GlyThrGinCysLeulieSerGly7TrpGlyAsnThrLysSerSerGly1151201253CCagetaccctgatgtcctg朋gtgtctg朋ggetcccateetatea432ThrSerTyrProAspValLeuLysCysLeuLysAlaProlieLeuSer130135140g3Cagetcttgc333agtgcctacCC3ggcCElgate3CCage朋cEltg■AspSerSerCysLysSerAlaTyrProGlyGinlieThrSerAsnMet145150155160ttctgtgcgggctacctggagggc朋gg￡lCtectgcCElgggtg￡lC528PheCysAlaGlyTyrLeuGluGlyGlyLysAspSerCysGinGlyAsp165170175tecggtggccctgtggtctgcElgt朋getcCElgggcattgtctec576SerGlyGlyProValValCysSerGlyLysLeuGinGlylieValSer180185190tggggctctggctgcgetcag朋c朋gcctggtgtctac3CC624TrpGlySerGlyCysAlaGinLysAsnLysProGlyValTyrThrLys195200205gtctgc朋ctacgtgagetggatt朋gCElg3CCategcctec朋ctea672ValCysAsnTyrValSerTrplieLysGinThrlieAlaSerAsn210215220〈210>2〈211>223〈212>PRT〈213〉牛(Bos)〈400>2lieValGlyGlyTyrThrCysGlyAlaAsnThrValProTyrGinVal151015SerLeuAsnSerGlyTyrHisPheCysGlyGlySerLeulieAsnSer202530GinTrpValValSerAlaAlaHisCysTyrLysSerGlylieGinVal354045ArgLeuGlyGluAspAsnlieAsnValValGluGlyAsnGluGinPhe505560lieSerAlaSerLysSerlieValHisProSerTyrAsnSerAsnThr65707580LeuAsnAsnAsplieMetLeulieLysLeuLysSerAlaAlaSerLeu859095AsnSerArgValAlaSerlieSerLeuProThrSerCysAlaSerAla100105110GlyThrGinCysLeulieSerGlyTrpGlyAsnThrLysSerSerGly8ThrAsp145PheSerTrpValSer130SerCysGlyGly115TyrProSerCysAlaGlyGlyPro180SerGly195AsnTyrAspValLeu135LysSerAla150TyrLeuGlu165ValValCysCysAlaGin120LysTyrGlySerLys200lieCysLeuLysProGlyGin155GlyLysAsp170GlyLysLeu185AsnLysProCysAsnTyrValSerTrplieLysGinThr210215〈210>3〈211>688〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工合成牛胰蛋白酶基因的序列。〈400>3atgcatcaatttaactctggcggctcactgttg3gggc朋caaacaccttgccgtgtagctctctggctgttaaggctccgcaacatgttgtggccctgtagaccatcgc〈210>4〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR上游引物的序列〈400>4Ala140lieSerGinGlylie220125ProlieLeuSerThrSerAsnMet160AspCysGlyVal205AlaGinGly175lieVal190TyrThrSerAsnSerLyscgttggtggttacacttgtgtgtcccctaccaagtgtccc60ctaccacttctgcgggggctcccttatcaaC3gCC3gtgggtggtgtctg120ctacaagtccgg^tcc^gtgcgtcttggattaatgtcg180tgagcaattcatcagcgcatcgtccatcccagctacaact240■ac^cgacatcatgcttaatcagctgccagtcttaaca300ctctatctctcttccaacatcctgtgcctctgctggcacccagtgtctta360gggC33C3CC■■gcagtggcaccagctaccctgatgtccttaagtgtc420catcctttcagacagctcttgc^^gtgcctacccaggccagatcacca■ctgtgcgggctaccttgagggCgg3卿g3ctcctgccagggtgactccg540ggtctgcagtctcctggggctctggctgcg600caagcctggtgtctacaccactacgtgagc660ctccaactaaggactegt688tgaacgaacttaatgggagg20〈210>5〈211>21〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉PCR下游引物的序列?！?00>5gacggtatcgataagcttga2010權(quán)利要求一種在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法，其特征在于在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法按以下步驟實現(xiàn)一、將編碼野生型牛胰蛋白酶氨基酸序列N端的8個氨基酸的密碼子和牛胰蛋白酶中所有編碼Leu和Ary的稀有密碼子替換為乳酸乳球菌的偏愛密碼子，得人工合成牛胰蛋白酶基因，并在其5′、3′端分別引入帶有NsiI和SpeI的識別序列，然后與克隆載體pUC57一起連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，再篩選陽性轉(zhuǎn)化子pUC57-trym；二、將pUC57-trym和表達載體pSEC-E7分別經(jīng)NsiI和SpeI雙酶切后，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建重組表達載體pSEC-trym；三、將pSEC-trym經(jīng)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌感受態(tài)細胞NZ9000，得含有重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌NZ9000-pSEC-trym，然后PCR鑒定；四、將NZ9000-pSEC-trym接種于GM17液體培養(yǎng)基中，在30℃下厭氧培養(yǎng)過夜后，取培養(yǎng)物，然后以1∶25的體積比接種于GM17液體培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，在30℃下厭氧培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，再用質(zhì)量濃度1ng/ml的乳鏈菌肽Nisin誘導3h，即完成在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟一中野生型牛胰蛋白酶基因序列如SEQIDNO:l所示。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟一中人工合成牛胰蛋白酶基因的序列SEQIDNO:3。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法，其特征在于是步驟二中雙酶切的體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>雙酶切反應(yīng)條件為37t:下反應(yīng)2h。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法，其特征在于是步驟二中雙酶切的體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>雙酶切反應(yīng)條件為37t:下反應(yīng)2h。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟三中PCR的體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>PCR反應(yīng)條件為98t:下預(yù)變性20s，98t:下變性10s，56t:下退火15s，72t:下延伸1.5min，共循環(huán)35次，72。C下終延伸2min，4。C下保存。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟四中GM17液體培養(yǎng)基由4.225%肉湯和0.5%葡萄糖組成。全文摘要一種在乳酸乳球菌中表達牛胰蛋白酶的方法，它涉及一種表達牛胰蛋白酶的方法。解決了現(xiàn)有牛胰蛋白酶目前還不能在乳酸乳球菌中表達的問題。方法將野生型牛胰蛋白酶N端的8個密碼子和所有編碼Leu和Ary的稀有密碼子替換為乳酸乳球菌的偏愛密碼子，得人工合成牛胰蛋白酶基因，并引入識別序列，然后與pUC57連接轉(zhuǎn)化DH5α，篩選陽性轉(zhuǎn)化子pUC57-trym，再與表達載體pSEC-E7同時雙酶切后，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建重組表達載體pSEC-trym，電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ9000，厭氧培養(yǎng)后經(jīng)乳鏈菌肽Nisin誘導，即完成。本發(fā)明使人工合成牛胰蛋白酶成功地在乳酸乳球菌中進行表達，且具有生物學活性。文檔編號C12N9/76GK101735994SQ200910217470公開日2010年6月16日申請日期2009年12月31日優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日發(fā)明者周艷秋,姚麗燕,姜毓君,張光輝,曲行光,趙鳳,韓希妍申請人:東北農(nóng)業(yè)大學