專利名稱：：乳酸乳球菌食品級分泌表達載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體的說，涉及可在乳酸乳球菌中分泌表達外源基因的分泌表達載體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：食品級表達系統(tǒng)因其安全、符合FDA要求而日益受到重視。食品級表達系統(tǒng)必須具有如下條件(1)載體必須是食品級的，不得含有非食品級功能性DNA片段，如抗生素抗性基因等；(2)表達宿主必須是安全的、特性清楚而穩(wěn)定的食品級微生物(generallyregardedassafe，GRAS)，如乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌及其它已在食品工業(yè)中得到長期而廣泛應(yīng)用的菌株。此外，食品級系統(tǒng)的宿主菌在生產(chǎn)狀況下，在食品中和進入人體后必須是足夠穩(wěn)定的。乳酸乳球菌(丄actococcw/acfe)是一種廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)的微生物，用來生產(chǎn)和保存乳制品，被公認為安全的食品級微生物。以乳酸乳球菌作為異源蛋白的輸送載體，逐漸成為食品工業(yè)、生物制藥和疫苗研究的熱點。一系列基于乳酸乳球菌的表達系統(tǒng)已經(jīng)構(gòu)建，某些異源蛋白、細胞因子和酶以各種形式得到表達。申請人于2004年提交的中國專利申請(申請?zhí)?00410093875.7)中公幵了一個食品級載體系統(tǒng)，它以染色體上基因缺失的乳酸乳球菌MBP71作為宿主菌，以質(zhì)粒pSH91作為克隆表達載體。質(zhì)粒pSH91由來自乳酸乳球菌乳脂亞種(Xa"ococcws/actorafep.cre仿o^^Wg2隱性質(zhì)粒pWVOl的復(fù)制子(RepA、ORFC禾Bori+)、來自pUC18質(zhì)粒的全部多克隆位點和來自乳酸乳球菌MG1363的選擇標(biāo)記構(gòu)成，質(zhì)粒載體和宿主菌實現(xiàn)營養(yǎng)缺陷互補。在整個載體系統(tǒng)中，除了來源于pUC18質(zhì)粒的多克隆位點外，其余成分均來源于GRAS級微生物(乳酸菌)，不含有抗生素抗性基因，符合食品級載體系統(tǒng)的要求。但該載體系統(tǒng)為克隆載體系統(tǒng)，不能表達外源蛋白。為了實現(xiàn)外源蛋白的表達，需要表達載體。而表達載體需要表達調(diào)控元件，如啟動子、核糖體結(jié)合位點、調(diào)控序列等等。對于食品級載體系統(tǒng)來說，要求所有的表達調(diào)控元件均來自食品級微生物，而且表達調(diào)控的誘導(dǎo)物也是食品級的。乳酸乳球菌表達的外源蛋白在細胞的定位有非分泌形式(胞內(nèi)、胞壁結(jié)合)和分泌等形式。非分泌形式有很多缺點，例如不能及時將合成的外源蛋白輸送到胞外，容易被胞內(nèi)蛋白酶降解；表達蛋白不能夠正確折疊，從而不能保持良好的生物學(xué)活性；同時，非分泌性表達的蛋白(抗原或酶)不能直接與底物或腸道黏膜作用，需下游的蛋白純化操作。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，一方面，本發(fā)明提供一種乳酸乳球菌食品級分泌表達載體。另一方面，本發(fā)明提供一種乳酸乳球菌食品級分泌表達系統(tǒng)。另一方面，本發(fā)明提供一種疫苗，其含有本發(fā)明所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達系統(tǒng)。另一方面，本發(fā)明提供一種本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體的構(gòu)建方法。另一方面，本發(fā)明提供一種本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體在分泌表達外源蛋白中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供一種乳酸乳球菌食品級分泌表達載體，其包括以下元件-AyA基因選擇標(biāo)記、質(zhì)粒pWVOl的復(fù)制子、多克隆位點、分泌表達用啟動子、Usp45的核糖體結(jié)合位點、Usp45的信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述部分Usp45成熟肽編碼序列為Usp45成熟肽前9、10、11、12、13、14或15個氨基酸編碼序列。在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，所述分泌表達用啟動子為P32啟動子。在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，所述的P32啟動子與所述Usp45的核糖體結(jié)合位點、Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列形成融合基因。在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，所述融合基因位于i^'ndll和J^d多克隆位點之間。在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，所述的^^A基因選擇標(biāo)記為乳酸乳球菌MG1363的基因；所述P32啟動子為pMG36e的P32啟動子；所述的Usp45信號肽序列為乳酸乳球菌MG1363的Usp45信號肽序列；優(yōu)選所述載體包含如SEQIDNO:1所示的序列。另一方面，本發(fā)明提供一種乳酸乳球菌食品級分泌表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體以及乳酸乳球菌A^yA突變株；優(yōu)選所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體位于所述的乳酸乳球菌AAj;A突變株中。另一方面，本發(fā)明提供一種疫苗，其含有本發(fā)明所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達系統(tǒng)。另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體的構(gòu)建方法，該方法包括制備分泌表達用啟動子、Usp45的核糖體結(jié)合位點、Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列以及制備包含？&A基因選擇標(biāo)記、質(zhì)粒pWVOl的復(fù)制子和質(zhì)粒pUC18的多克隆位點的載體骨架；將所述分泌表達用啟動子、Usp45的核糖體結(jié)合位點、Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列克隆入所述載體骨架的多克隆位點；優(yōu)選所述的分泌表達用啟動子為P32啟動子。另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體在分泌表達外源基因中的應(yīng)用。圖1顯示P32-SPw/^5基因結(jié)構(gòu)示意圖2A顯示P32-SP"^C片段核苷酸序列；圖2B顯示本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體的部分序列，其中包括質(zhì)粒pWVOl的復(fù)制子、多克隆位點、^yA基因選擇標(biāo)記、分泌表達用啟動子P32、乳酸乳球菌Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列；圖3顯示質(zhì)粒pSQ的構(gòu)建示意圖4A顯示重組分泌性表達質(zhì)粒pSQ的鑒定結(jié)果，其中，1:分子量標(biāo)準；2:pSQ質(zhì)粒；3:P32擴增片段；4:S尸WS;45擴增片段；5:P32-SPz^^5擴增片段；圖4B顯示重組分泌性表達質(zhì)粒pSQZ的鑒定結(jié)果，其中，1:分子量標(biāo)準；2:pSQZ質(zhì)粒；3:ww45(以pSQZ質(zhì)粒為模板)；4:wp45陽性對照(以MG1363染色體為模板)；圖5A顯示重組質(zhì)粒pSQ-"W"的鑒定結(jié)果，其中，1:分子量標(biāo)準；2:P32-SPw/^5擴增片段；3:擴增片段；圖5B顯示重組質(zhì)粒pSQZ-rad的鑒定結(jié)果，其中，1:分子量標(biāo)準；2:pSQZ-"W"質(zhì)粒；3:基因擴增產(chǎn)物；4:"""基因擴增產(chǎn)物；5:"S/Om^4擴增產(chǎn)物；圖6A和圖6B顯示乳酸乳球菌MBP71表達核酸酶活性檢測及不同工程菌表達量的比較，其中，圖6A為37。C培養(yǎng)15min;圖6B為37。C培養(yǎng)45min;在圖6A和圖6B中，A區(qū)乳酸乳球菌MBP71/pSQ-racA菌落；B區(qū)乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-"wcA菌落；C區(qū)、D區(qū)乳酸乳球菌MBP71/pSH91菌落；圖7顯示上清和菌體樣品核酸酶SDS-PAGE;其中，M:蛋白分子量標(biāo)準；1:乳酸乳球菌MBP71/pSH91上清；2:乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-"wcA上清；3:乳酸乳球菌MBP71/pSQ-"wcA上清；4:乳酸乳球菌MBP71/pSH91菌體；5:乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-m/cA菌體；6:乳酸乳球菌MBP71/pSQ-"wcA菌體；圖8顯示核酸酶酶譜檢測結(jié)果，其中，M:分子量標(biāo)準；1:乳酸乳球菌MBP71/pSH91上清；2:乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-"wcA上清；3:乳酸乳球菌MBP71/pSQ-""cA上清；4:乳酸乳球菌MBP71/pSH91菌體；5:乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-m/cA菌體；6:乳酸乳球菌MBP71/pSQ-做cA菌體。具體實施例方式本發(fā)明創(chuàng)造性地將Usp45的核糖體結(jié)合位點、乳酸乳球菌Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列與fA基因選擇標(biāo)記、質(zhì)粒pWVOl的復(fù)制子、多克隆位點、分泌表達用啟動子組合，獲得了本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體。因此本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體包括以下元件^^A基因選擇標(biāo)記、質(zhì)粒pWVOl的復(fù)制子、多克隆位點、分泌表達用啟動子、Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列。在本領(lǐng)域，為實現(xiàn)分泌性表達，通常在啟動子后、目的蛋白前融合一分泌信號肽，以引導(dǎo)目的蛋白分泌到細胞膜外。Usp45是一種分子量為45kDa的未知功能的分泌蛋白，也是乳酸乳球菌中唯一能通過考馬斯亮蘭染色檢測到的分泌蛋白(Liebl,W.，A.J.Sinskey，andK.H.Schleifer.Expression,secretion,andprocessingofstaphylococcalnucleasebyCo^ywe6acfen'wwg/wtomZcwn.J.Bacteriol.1992;174:1854-1861)，其蛋白質(zhì)前體的N端有由27個氨基酸組成的信號肽序列，能被乳酸乳球菌的分泌系統(tǒng)識別，引導(dǎo)蛋白通過胞質(zhì)膜，信號肽隨后被切割和降解，成熟肽釋放到上清中。本發(fā)明不但選擇來源于乳酸乳球菌的Usp45信號肽序列并且還同時選擇位于其后的部分Usp45成熟肽編碼序列，作為本發(fā)明的分泌表達載體的一個元件，從而有效地構(gòu)建了一個分泌性表達載體。上述"部分Usp45成熟肽編碼序列"為Usp45成熟肽編碼序列的一部分序列，可以為成熟肽前9、10、11、12、13、14或15個氨基酸編碼序列，例如成熟肽前9個氨基酸編碼序列、成熟肽前11個氨基酸編碼序列、成熟肽前13個氨基酸編碼序列或成熟肽前15個氨基酸編碼序列。所述"部分Usp45成熟肽編碼序列"作為宿主菌的自身蛋白在外源目的蛋白的N端或C端融合后，增加了外源目的蛋白mRNA和表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性，防止了外源目的蛋白因被宿主菌自身表達的蛋白酶所識別和切割而影響產(chǎn)量和功能；另外，對于分子量較小的外源目的蛋白，還可以增強其免疫原性。在本發(fā)明中，利用該分泌表達載體轉(zhuǎn)化入宿主菌乳酸乳球菌MBP71，實現(xiàn)了報告蛋白核酸酶(NucA)的有效分泌表達。TB-D試驗中，分泌表達的核酸酶水解細菌周圍的DNA，形成特殊的菌落周圍光暈；SDS-PAGE中，在上清中可見區(qū)別于陰性對照的陽性條帶；在酶譜檢測中，在上清和菌體樣品中均可見陽性條帶，但上清條帶的亮度和寬度明顯大于菌體中，估計上清核酸酶含量是菌體的10倍，說明核酸酶大多以分泌的形式表達。分泌性表達具有諸多優(yōu)點，如能及時將合成的外源蛋白輸送到胞外，避免了被胞內(nèi)蛋白酶降解；表達蛋白能夠正確折疊，保持良好的生物學(xué)活性；同時，分泌性表達的蛋白(抗原或酶)可以直接與底物或腸道黏膜作用，無需下游的蛋白純化操作。為了實現(xiàn)分泌性表達，通常在表達目的蛋白的C端或N端融合一分泌信號肽，以引導(dǎo)目的蛋白釋放到胞外。由于現(xiàn)有技術(shù)的質(zhì)粒pSH91(中國專利申請200410093875.7)包括^^4選擇標(biāo)記、質(zhì)粒pWVOl的復(fù)制子、pUC18質(zhì)粒的全部多克隆位點，所以為了使用方便，本發(fā)明直接使用質(zhì)粒pSH91，至于該質(zhì)粒中的其它元件，并不影響本發(fā)明的分泌表達，不是本發(fā)明的分泌表達載體的必要元件；其中質(zhì)粒pWV01的復(fù)制子為質(zhì)粒復(fù)制所必需，不用于分泌表達。本發(fā)明的分泌表達載體中的A_yA基因(胸苷酸合成酶基因，thymidylatesynthasegene)選擇標(biāo)記可來自任何包含其的食品級微生物或者載體，優(yōu)選例如來自乳酸乳球菌MG1363或質(zhì)粒pSH91(該選擇標(biāo)記基因應(yīng)為與宿主菌染色體中^yv4基因同源性不高，防止發(fā)生同源重組)。f/y^在生物體內(nèi)DNA合成中起關(guān)鍵作用，它催化dUMP轉(zhuǎn)變?yōu)閐TMP的甲基化，同時使5,10-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)?，8-二氫葉酸。多克隆位點可以為任何食品級載體中的多克隆位點，優(yōu)選例如pUC18質(zhì)粒的多克隆位點，包括歷"dIII、^ZzI、尸WI、Wal、5amHI、SmdU本發(fā)明的食品級分泌表達載體中的"分泌表達用啟動子"為適于分泌表達的食品級啟動子。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述分泌表達用啟動子為來自乳酸乳球菌MG1363染色體上Usp45蛋白的啟動子，發(fā)明人利用該啟動子以及乳酸乳球菌MG1363染色體上Usp45蛋白的核糖體結(jié)合位點(RBS)、信號肽和部分成熟肽的編碼序列，成功構(gòu)建了一個組成性分泌表達載體pSQZ，并且實現(xiàn)了報告蛋白NucA的分泌性表達。但是，該啟動子的啟動效率較低，表達的報告蛋白量較少。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述分泌表達用啟動子為P32啟動子，P32啟動子是vanderVossen等從乳酸乳球菌乳脂亞種(丄./actora^;.cremon's)Wg2染色體中分離的啟動子(vanderVossenJM,vanderLD,VenemaG.IsolationandcharacterizationofS/re_p/ococcw>screwon'sWg2-specificpromoters.Appl.Environ.Microbiol.1987;53:2452-2457)。vanderMaarten等以此啟動子構(gòu)建了乳酸菌表達載體pMG36和pMG36e，并成功表達了雞蛋白溶菌酶。但是，pMG36及其系列衍生質(zhì)粒攜帶卡那霉素或紅霉素抗性基因，存在抗性基因橫向轉(zhuǎn)移的可能，限制了其作為食品級載體的應(yīng)用。本發(fā)明創(chuàng)造性地利用P32啟動子以及乳酸乳球菌MG1363染色體上Usp45蛋白的核糖體結(jié)合位點、信號肽和部分成熟肽的編碼序列，成功構(gòu)建了分泌表達載體pSQ，與以Usp45本身啟動子構(gòu)建的表達載體pSQZ比較，pSQ分泌表達報告蛋白NucA的能力顯著提高。在TB-D平板試驗中，培養(yǎng)相同時間時，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-""cA菌落周圍光暈直徑大于乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-做cA;而在SDS-PAGE中，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-w"cA上清樣品在18KD位置可見特異的、區(qū)別于陰性對照的陽性條帶，而乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-m/cA在相應(yīng)位置卻沒有特異陽性條帶出現(xiàn)；在酶譜檢測中，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-"wcA和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-""cA的上清和菌體在18KD位置都有特異的陽性條帶，但乳酸乳球菌MBP71/pSQ-m/cA上清和菌體條帶的亮度和寬度均大于乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-m/cA，估計乳酸乳球菌MBP71/pSQ-racA表達的核酸酶總量是乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-m/cA的5倍，說明乳酸乳球菌MBP71/pSQ-""cA的表達效率高于乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-m/cA。分泌表達量的增加，可以增加目的蛋白的產(chǎn)量，減少后續(xù)的濃縮操作，節(jié)約了成本，簡化了操作。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種乳酸乳球菌食品級分泌表達載體，其中，所述的P32啟動子與所述Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列形成融合基因。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明將SPwpC克隆于P32的-10區(qū)后，其-10區(qū)與RBS間的距離為22bp，接近自身-10區(qū)與RBS間的距離(24bp);而RBS與ATG間的距離及RBS后堿基A、T含量維持w/745自身組成不變，有效保持了重組啟動子的啟動效率。在本發(fā)明的一個實施方式中，在本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體中，所述的P32啟動子與所述乳酸乳球菌MG1363Usp45信號肽序列形成的融合基因位于多克隆位點的歷mffll和^^I間；當(dāng)然，融合基因也可以在其他克隆位點間，但是為了在目的基因克隆中有盡可能多的克隆位點，宜選擇靠近/z/w^in的位點。在本發(fā)明的一個實施方式中，在所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體中，所述的基因選擇標(biāo)記優(yōu)選為乳酸乳球菌MG1363的A;^4基因；所述P32啟動子優(yōu)選為pMG36e的P32啟動子；所述的Usp45信號肽序列優(yōu)選為乳酸乳球菌MG1363的Usp45信號肽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，提供一種乳酸乳球菌食品級分泌表達載體，該載體包含如SEQIDNO:l所示的序列。在SEQIDNO:l中，包括質(zhì)粒pWVOl的復(fù)制子、多克隆位點、^yA基因選擇標(biāo)記、分泌表達用啟動子P32、乳酸乳球菌Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列。另一方面，本發(fā)明提供一種乳酸乳球菌食品級分泌表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體以及乳酸乳球菌AA少A突變株(胸苷酸合成酶缺陷突變株)。胸苷酸合成酶缺陷突變株(Af&A突變株)依靠外源性胸腺嘧啶(thymine)或胸腺嘧接核苷(thymidine)進行DNA的生物合成，如果突變株生存的環(huán)境不能提供足夠濃度的胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷，突變株將因DNA合成受阻而停止生長或死亡。可以通過將細菌涂于含胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷和抗葉酸的藥物如三甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim)、氨基喋呤(aminopterin)或氨甲喋呤(amethopterin)的培養(yǎng)基上，來篩選決3^基因突變的菌株。此外，還可以通過同源重組的方法獲得^)^基因缺失突變株。某些菌株的基因可以對同種屬或不同種屬的基因缺陷的菌株提供功能互補作用，使基因缺陷株恢復(fù)野生型表型。如果在質(zhì)粒中提供同源或異源的功能互補的A^4基因后，缺陷株在不含外源性胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷的情況下也能恢復(fù)生長，此即細菌營養(yǎng)缺陷型互補的原理。在本發(fā)明的一個優(yōu)選表達系統(tǒng)中，載體以來源于宿主菌乳酸乳球菌MG1363的基因作為篩選標(biāo)志，與宿主菌乳酸乳球菌MBP71AA;^4構(gòu)成營養(yǎng)缺陷互補。本發(fā)明的食品級分泌表達載體中的P32啟動子、SP^p^及其它各組分均來自食品級微生物，不含有任何抗生素抗性基因；而且宿主菌也為食品級微生物，因此此系統(tǒng)完全符合食品級表達系統(tǒng)的要求。此外，本發(fā)明的載體中包含乳酸乳球菌的Usp45信號肽序列和部分Usp45成熟肽編碼序列，能夠有效地進行分泌表達。而分泌形式表達外源蛋白有胞內(nèi)形式不可比擬的優(yōu)點例如可以持續(xù)培養(yǎng)、蛋白直接分泌到上清中，減少了下游的純化操作；分泌的蛋白在腸道或發(fā)酵物中直接與底物或免疫系統(tǒng)作用，作用直接；乳酸乳球菌分泌性表達蛋白避免如大腸桿菌那樣形成包涵體，無須復(fù)性處理；乳酸乳球菌為腸道益生菌，其基因工程菌可以在腸道中持續(xù)表達外源蛋白。在本發(fā)明的一個優(yōu)選食品級分泌表達載體系統(tǒng)中，所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體位于所述的乳酸乳球菌A/Z2;;A突變株中。通過在選擇培養(yǎng)基上進行篩選，就可以篩選出導(dǎo)入了含有基因的質(zhì)粒的/W/y^突變株。所述選擇培養(yǎng)基，例如改良SA培養(yǎng)基，只有導(dǎo)入了含有^yj基因的質(zhì)粒的Af/y^突變株才能在改良SA培養(yǎng)基上恢復(fù)生長。另一方面，本發(fā)明提供一種疫苗，其包含本發(fā)明的食品級分泌表達系統(tǒng)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的食品級分泌表達載體中包含保護性抗原基因，使保護性抗原在乳酸菌中進行分泌表達，讓其在人體或動物體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的保護性抗體。這樣就使乳酸菌如虎添翼，發(fā)揮更大的作用。本發(fā)明的食品級分泌表達系統(tǒng)的好處(或特色)在于能通過口服或飼喂施用，簡單方便；能在體內(nèi)定植，可以在腸道中持續(xù)表達外源蛋白；能直接產(chǎn)生有益的保護性抗原，省去了常規(guī)的發(fā)酵過程和繁瑣的提取工藝；分泌的保護性抗原在腸道或發(fā)酵物中直接與底物或免疫系統(tǒng)作用，作用直接。另一方面，本發(fā)明提供一種本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體的構(gòu)建方法，該方法包括制備分泌表達用啟動子、Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列以及制備包含^y乂基因選擇標(biāo)記、質(zhì)粒pWVOl的復(fù)制子、和多克隆位點的載體骨架；將所述分泌表達用啟動子、Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列克隆入載體骨架的多克隆位點。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的分泌表達用啟動子為P32啟動子。另一方面，本發(fā)明提供一種乳酸乳球菌食品級分泌表達載體在分泌表達外源基因中的應(yīng)用。用包含本發(fā)明的食品級分泌表達載體的分泌表達系統(tǒng)，可以分泌表達有益于人和動物的外源基因，如某些營養(yǎng)物質(zhì)(各種必需氨基酸、維生素等)、保健和治病的藥物(如抗癌藥物、防衰老藥物、避孕藥物、各種免疫源和有關(guān)的酶類)、生長發(fā)育的激素(如促乳素、生長素等)。還可以將包含本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體的分泌表達系統(tǒng)制成活菌制劑，需要時口服或飼喂，從而引入人體和動物體內(nèi)(定植或短暫定植)，產(chǎn)生機體所需的外源基因的產(chǎn)物。本發(fā)明的食品級分泌表達系統(tǒng)，集菌體本身和有益基因于一體，既可加強營養(yǎng)，也可防病治病，促進生長發(fā)育或禽畜生長增重。以下以實施例的方式進一步說明本發(fā)明，所述實施例并不用于限定本發(fā)明的范圍。實施例本發(fā)明實驗中使用的培養(yǎng)基(一)CBT培養(yǎng)基5XM9鹽溶液(5XM9鹽溶液的配制Na2HP04，71^0，64.0g;KH2P04，15.0g;NaCl，2.5g;NH4Cl，5.0g)，200ml;葡萄糖，20.0g;酪蛋白胨，0.5g;色氨酸(10mg/ml)，1.0ml;維生素B1(lmg/ml)，1.0ml。加蒸餾水定容至1000ml，pH7.2;8lb仍n2高壓蒸氣滅菌1520分鐘。(二)改良SA培養(yǎng)基A、20X氨基酸混合液纈氨酸，3.0g;谷氨酸，3.0g;蛋氨酸，2.5g;組氨酸，0.5g;亮氨酸，2.0g;異亮氨酸，l.Og;谷氨酰胺，l.Og;天冬酰胺，l.Og。*將上述氨基酸溶于蒸餾水中，加入10N的NaOH溶液直至完全溶解，定容至500ml，4'C保存。B、20XSA鹽溶液氯化鈉，30.0g;乙酸鈉，12.5g;氯化銨，5.0g;磷酸氫鉀，2.0g;氯化鎂，l.Og;硫酸鉀，0.5g;硫酸鐵，20.0mg;氯化鈣，1.0mg。"各上述鹽溶于500ml蒸餾水中，分裝后置于-20。C保存。C、200X混合維生素溶液維生素B1，20.0mg;維生素B6，50.0mg;生物素，20.0mg;核黃素，20.0mg;泛酸鈣，20.0mg;葉酸，20.0mg;煙酸，20.0mg。*將上述維生素溶于100ml磷酸鉀溶液(0.067mol/L)中，4'C避光保存。將上述A、B、C溶液混合至終濃度為1X，然后加入20.0g葡萄糖、0.5g酪蛋白胨，15.0gMOPS[3-(N-嗎啉代)丙磺酸]，加蒸餾水定容至1000ml，pH7.0。8lbf/in2高壓蒸氣滅菌1520分鐘。(三)GM17液體培養(yǎng)基多價蛋白胨，5.0g;酪蛋白胨，5.0g;牛肉膏，5.0g;葡萄糖，5.0g;酵母粉，2.5g;維生素C，0.5g;MgS04'7H20，0.25g;GP(卩-磷酸甘油鈉)，19.0g。加蒸餾水定容至1000ml，pH7.0。8lbf/in2高壓蒸氣滅菌1520分鐘。實施例1、分泌性表達質(zhì)粒pSQ的構(gòu)建根據(jù)發(fā)表的啟動子P32的序列設(shè)計引物(SEQIDNO:2和3，試驗中所用的引物請參見表l)，以質(zhì)粒pMG36e(vandeGM，vanderVossenJM,KokJ，etal.Constructionofalactococcalexpressionvector:expressionofheneggwhitelysozymein丄acfococcw/acfesw^/./adAppl.Environ.Microbiol.1989;55:224-228)為模板擴增啟動子片段P32，包括-35區(qū)、-10區(qū);根據(jù)GenBank公布的乳酸乳球菌MG1363w;^5基因序列(vanAsseldonk，M.,Rutten,G.,Oteman，M.，etal.Cloningofusp45,ageneencodingasecretedproteinfrom丄actococcws/actosw^sp.MG1363,Gene.1990;95:155-160)設(shè)計引物對(SEQIDNO:4和5)，以乳酸乳球菌MG1363(NCD0712,plasmidfree,GassonMJ,J.Bacteriol.1983;154(1):1-9)染色體為模板擴增SPw一5，包括船;^5的核糖體結(jié)合位點、翻譯起始密碼子、信號肽序列及Usp45成熟肽前11個氨基酸編碼序列(圖1、圖2A、圖2B)。PCR擴增產(chǎn)物分別回收純化，以Sa/I酶切，T4連接酶連接，取連接產(chǎn)物為模板，以引物對(SEQIDNO:2和5)擴增片段P32-SPw;C擴增產(chǎn)物膠回收純化，克隆到載體pMD18-T(購自大連TaKaRa公司)，CaCl2法轉(zhuǎn)化五.co/ZDH5a感受態(tài)細胞(購自天象生物技術(shù)公司)，藍白斑篩選陽性克隆子送上海生物工程公司測序。測序正確的克隆子以/Z/"dIH和^aI雙酶切，膠回收目的基因片段，與經(jīng)同樣雙酶酶切的pSH91質(zhì)粒(見中國專利申請200410093875.7，保藏號為CGMCCNO:1253)連接。以CaCl2法制備￡.co/z.X51感受態(tài)細胞(OkadaT,etal.Nature.1960;188:340-341)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，在CBT培養(yǎng)基上挑選陽性菌落，經(jīng)質(zhì)粒提取、PCR擴增鑒定，質(zhì)粒命名為pSQ(構(gòu)建流程圖見圖3)。結(jié)果上述P32、5P"^^基因片段經(jīng)PCR擴增及l(fā)。/。瓊脂糖電泳檢測，所得產(chǎn)物片段分別約為138bp和170bp，符合預(yù)期片段長度。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，酶切連接，以連接產(chǎn)物為模板擴增融合基因P32-SPw;^5，所得產(chǎn)物大小約為308bp，符合預(yù)期片段長度。融合基因擴增產(chǎn)物經(jīng)T-A克隆測序(TA克隆系統(tǒng)購自TAKARA公司)，證實與文獻和GenBank上公布的P32和SP"wW序列完全一致。將測序正確的片段以WaI、i^"dl1酶切后，與同樣酶切的pSH91質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化Eco/z'X51，獲得多個克隆子。提取質(zhì)粒，PCR擴增P32、SP^;^5及P32-SPwp^5基因片段，分別在138bp、170bp和308bp位置有相應(yīng)的條帶，表明重組分泌性表達質(zhì)粒pSQ構(gòu)建成功(圖4A)。實施例2、表達質(zhì)粒pSQ-rtWcA的構(gòu)建1、報告基因m/"的克隆根據(jù)文獻報道的基因序列(Kuroda,M.，Ohta，T.，Uchiyama,I.,etal.Wholegenomesequencingofmeticillin-resistantS鄉(xiāng)/^/ococci^Lancet.2001;357:1225-1240)設(shè)計引物(SEQIDNO:6和7)，以金黃色葡萄球菌25923(購自中國藥品生物制品鑒定所)染色體為模板，PCR擴增"""基因序列。擴增產(chǎn)物為核酸內(nèi)切酶成熟肽的編碼序列，不包括分泌信號肽編碼序列，擴增產(chǎn)物預(yù)期長度約為510bp。擴增產(chǎn)物回收純化后，T-A克隆測序，與發(fā)表的序列比對。2、表達質(zhì)粒pSQ-racA的構(gòu)建測序正確的基因擴增片段經(jīng)^aI和I雙酶切，與同樣雙酶切的pSQ質(zhì)粒連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞ECO//X51,經(jīng)提取質(zhì)粒、PCR擴增鑒定，質(zhì)粒命名為pSQ-"McA。結(jié)果w"cA基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在約500bp位置有一片段，符合""cA基因預(yù)期片段長度(513bp)。擴增產(chǎn)物經(jīng)T-A克隆測序，證實與GenBank上公布的iV"cA序列完全一致。將測序正確的片段以^&aI、尺p^I酶切后，與同樣酶切的pSQ質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化五.co"X51。提取質(zhì)粒，PCR擴增m/cA和P32-67^一5序列片段鑒定，分別在500bp和300bp位置有相應(yīng)的條帶，表明重組分泌性表達質(zhì)粒pSQ-m^A構(gòu)建成功(圖5A)。實施例3、分泌性表達質(zhì)粒pSQZ^mcA的構(gòu)建根據(jù)GenBank公布的L.lactisMG1363w;^5基因序列(GenBankNC009004)設(shè)計引物(SEQIDNO:8和9)，以丄./ac^MG1363染色體為模板，擴增ww"有關(guān)序列，包括wj^5的啟動子(-35、-10區(qū))、核糖體結(jié)合位點(RBS)、信號肽序列(SPt^")及"s/^5成熟肽前11個氨基酸編碼序列。PCR擴增片段預(yù)期長度為230bp。按照與實施例12類似的方法，對該目的基因進行T-A克隆測序，證實與GenBank上公布的有關(guān)序列完全一致。將測序正確的克隆子以^￥^1、歷^III酶切后，膠回收小片段，與同樣酶切的pSH91質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化Eco"X51，獲得多個克隆子；提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板PCR擴增基因片段，在約230bp位置有相應(yīng)的條帶，表明重組分泌性表達質(zhì)粒pSQZ構(gòu)建成功(圖4B)。將測序正確的基因擴增片段以^aI、尺/wI酶切后，與同樣酶切的pSQZ質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化￡.co//X51。提取質(zhì)粒，PCR擴增"wcA、和"McA-w/^5片段鑒定，分別在約500bp、230bp和730bp位置有相應(yīng)的條帶，重組分泌性表達質(zhì)粒pSQZ-m^A構(gòu)建成功(圖5B)。實施例4、質(zhì)粒pSQ-""cA、pSQZ-""cA轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MBP71乳酸乳球菌MBP71為乳酸乳球菌A決少A精確缺失株(PedersenMP,etal,AppLEnviron.Microbiol.2002;68(6):3010-3023)，MBP71感受態(tài)細胞的制備和電擊轉(zhuǎn)化見參考文獻[MartinB.Pedersen，PeterR.Jensen,etal.BacteriophageResistanceofa△Mutantof丄actococcwblockedinDNAreplication,appliedandenvironmentalmicrobiology,2002;68:3010-3023],于改良SA培養(yǎng)基上篩選陽性菌落。用質(zhì)粒pSQ-"wcA、pSQZ-m/cA轉(zhuǎn)化的陽性菌株分別稱為MBP71/pSQ-m/cA、MBP71/pSQZ-m/cA。類似地，用質(zhì)粒pSH91轉(zhuǎn)化的陽性菌株稱為MBP71/pSH91。結(jié)果MBP71/pSQ-"wcA、MBP71/pSQZ-"wcA克隆子在改良SA培養(yǎng)基上回復(fù)了生長能力。轉(zhuǎn)化克隆子經(jīng)PCR擴增鑒定，分別含有質(zhì)粒pSQ-""cA和pSQZ-wcA，乳酸乳球菌分泌表達系統(tǒng)乳酸乳球菌MBP71/pSQ-m/cA和MBP71/pSQZ-m/cA構(gòu)建成功。實施例5、乳酸乳球菌MBP71/pSQ-""cA表達核酸酶活性(平板法檢測)核酸酶活性檢測釆用TB-D平板法(Liebl,W.，A.J.Sinskey和K.H.Schleifer.1992.Expression,secretion,andprocessingofstaphylococcalnucleasebyCor_ywe6acfen.wwg/w^amZcww.J.Bacteriol.174:1854-1861)，具體步驟如下挑取乳酸乳球菌MBP71/pSH91、乳酸乳球菌MBP71/pSQ-做cA和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-"wcA單菌落涂在改良的SA平板上，3(TC培養(yǎng)2436小時，至出現(xiàn)大小合適的單菌落。將融化的TB-D瓊脂(LachicaRVF，GenigeorgisC，HoeprichPD.Metachromaticagar-diffUsionmethodsfordetectingstaphylococcalnucleaseactivity.ApplMicrobiol，1971,21:585-587)倒在SA平板上，完全覆蓋單菌落(10ml/皿)，置37t:培養(yǎng)1530min，觀察單菌落周圍顏色變化，比較不同菌株單菌落周圍橙色光暈大小。結(jié)果分別涂乳酸乳球菌MBP71/pSQ-"wcA、乳酸乳球菌MBP71/pSH91和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-mfcA到改良SA平板上，30。C培養(yǎng)2436h后，菌落生長至針尖大小。將融化的TB-D培養(yǎng)基覆蓋單菌落，37"C培養(yǎng)15min后，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-wwcA和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-racA菌落周圍出現(xiàn)橙色光暈，但乳酸乳球菌MBP71/pSQ-""cA菌落光暈半徑較乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-"wcA菌落光暈半徑大，乳酸乳球菌MBP71/pSH91菌落周圍沒有橙色光暈出現(xiàn)(圖6A);37'C培養(yǎng)45min后，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-""cA和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-m/cA菌落周圍光暈半徑較15min時增大；乳酸乳球菌MBP71/pSH91菌落周圍沒有橙色光暈出現(xiàn)(圖6B)。結(jié)果提示乳酸乳球菌MBP71/pSQ-做cA和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-做cA能夠分泌性表達核酸酶，而且乳酸乳球菌MBP71/pSQ-做cA表達核酸酶量較乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-m/cA多，表達效率高。實施例6、乳酸乳球菌上清和菌體蛋白樣品的制備乳酸乳球菌上清和菌體蛋白樣品的制備參照文獻[LeLoirY,GrussA,EhrlichSD,etal.Anine-residuesyntheticpropeptideenhancessecretionefficiencyofheterologousproteinsin丄actococctw/adJ.Bacteriol.1998;180:1895-1903]，具體步驟如下分別接種乳酸乳球菌MBP71/pSQ-"wcA、乳酸乳球菌MBP71/pSH91和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-wwcA單菌落至GM17液體培養(yǎng)基中，30。C靜止培養(yǎng)過夜，次日以1:100稀釋靜止培養(yǎng)至OD=1.0。取2ml培養(yǎng)液，4°C6000Xg離心5min，分別收集上清和菌體。上清和菌體樣品按照每IOD培養(yǎng)液用100^溶液定容(即20倍濃縮)。上清以0.2pm孔徑濾器過濾，三氯乙酸(TCA，終濃度15%)沉淀lh，4°C6000Xg離心5min，沉淀以lml預(yù)冷丙酮洗一遍，冷凍干燥，以100pl50mMNaOH溶解，-20°。保存?zhèn)溆?。菌體以lml預(yù)冷的TES(蔗糖，25%;EDTA,1mM;Tris-HCl,50mM[pH8])洗過后，以TCA(終濃度10%)沉淀lh，4°C6000Xg離心5min，沉淀用1ml丙酮洗過后，重懸于70piTESL(蔗糖，25%;EDTA，1mM;Tris-HCl,50mM[pH8];溶菌酶，lmg/ml)，37°。孵育30min，加30jal20%SDS(終濃度6%)溶解，-20^保存?zhèn)溆?。實施?、核酸酶SDS-PAGE和酶譜檢測分別取15上述上清和菌體樣品與5pl蛋白上樣緩沖液混合，95。C變性5min后，取15pl上樣進行SDS-PAGE，考馬斯亮蘭染色后，觀察核酸酶特異條帶并掃描保存。酶譜檢測參照文獻[Liebl，W.，A.LSinskey，andK.H.Schleifer.Expression,secretion,andprocessingofstaphylococcalnucleasebyCo，e6ac加.訓(xùn)g/由/w'c應(yīng).J.Bacteriol.1992;174:1854-1861]:樣品進行SDS-PAGE后，進行蛋白復(fù)性處理，將復(fù)性處理后的膠平鋪到TB-D瓊脂上，保鮮膜包裹后置37X:孵育，觀察橙色條帶，比較其顏色深淺并拍照。結(jié)果上清和菌體樣品SDS-PAGE電泳后，經(jīng)考馬斯亮蘭染色和脫色處理，與空白對照比較，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-m/cA上清樣品在18KD位置有一條特異的條帶，而乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-w"cA在相應(yīng)位置沒有明顯的特異條帶；MBP71/pSQ-"wcA和MBP71/pSQZ-"wcA的菌體樣品與空白對照比較，沒有觀察到特異條帶的存在(圖7)。酶譜結(jié)果顯示，TB-D瓊脂膠與SDS-PAGE膠作用1小時后，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-"wcA與乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-咖cA上清和菌體樣品在18KD位置出現(xiàn)橙色條帶，而且上清樣品中條帶的亮度和寬度遠遠高于菌體樣品條帶，根據(jù)條帶的寬度和亮度估計，上清樣品中核酸酶含量是菌體的10倍；乳酸乳球菌MBP71/pSQ-肌cA上清和菌體樣品條帶亮度和寬度高于乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-m/cA上清和菌體樣品，估計乳酸乳球菌MBP71/pSQ-m/cA核酸酶總量是乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-""cA的5倍(圖8)。結(jié)果提示在乳酸乳球菌MBP71/pSQ-"wcA中，核酸酶大多以分泌形式表達，分泌到培養(yǎng)液上清中，而菌體中含有少量核酸酶；乳酸乳球菌MBP71/pSQ-m^A表達的核酸酶量高于乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-"wcA。表l試驗中所用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>序歹U表〈110〉中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所〈120〉乳酸乳球菌食品級分泌表達載體及其制備方法和應(yīng)用〈130>GBI07CN0490-C<160〉9〈170〉Patentlnversion3.3<210>1〈211>2601<212>廳<213〉人工序列〈220〉<223>本發(fā)明的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體<400>1tgaaagccgatgactgaatgaaataataagcgcagcgcccttctatttcggttggaggag60gctcaagggagtatgagggaatgaaattccctcatgggtttgattttaaaaattgcttgc120aattttgccgagcggtagcgctggaaaatttttgaaaaaaatttggaatttggaaaaaasL180tggggggaaaggaagcgaattttgcttccgtactacgaccccccattaagtgccgagtgc240caatttttgtgccaaaaacgctctatcccaactggctcaagggtttaaggggtttttcaa300tcgccaacgaatcgccaacgttttcgccaacgttttttataaatctatatttaagtagct360ttattgttgtttttatgattacaaagtgatacactaactttataaaattatttgattgga420gttttttaaatggtgatttcagaatcgaaaaaaagagttatgatttctctgacaaaagag480caagataaaaaattaacagatatggcgaaacaaaaaggtttttcaaaatctgcggttgcg540gcgttagctatagaagaatatgcaagaaaggaatcagaacaaaaaaaataagcgaaagct600cgcgtttttagaaggatacgagttttcgctacttgtttttgataaggtaattatatcatg660gctattaaaaatactaaagctagaaattttggatttttattatatcctgactcaattcct720aatgattggaaLeLgaaaaattagagagtttgggcgtatctatggctgtcagtcctttacac780gatatggacgaELaaEiaaEigataaagaLtacatggaatagtagtgatgttatacgEia^atggEL840aagcactataaaaaaccacactatcacgttatatatattgcacgaaatcctgtaacaata900gaaagcgttaggaacaagattaagcgaaaattggggaatagttcagttgctcatgttgag%0atacttgattatatcaaaggttcatatgaatatttgactca/tg犯tcaaaggacgctatt1020gctaagaataaacatatatacgacaaELaaeLgatattttgaacattaatgattttgatatt1080gaccgctatataacacttgatgaaagccaaa犯agagaattgaagaatttacttttagat1140已tagtggatgactataatttggtaaatacaaaagatttaatggcttttattcgccttagg1200ggagcggagtttggaattttaaatacgaatgatgtaaaagatattgtttceLacaaactctagcgcctttagattatggtttgagggcaattatcagtgtggatatagagcaagttatgca1320aaggttcttgatgctgaaacgggggaaatetEtaatgacELaacaaagaaaaagagttatttg1380ctgaB"taatgaggaMta^aaaagatagga6Laatttcatgacttacgcagatcaagtttt1440taaacaaaatatccaaaatatcctagataatggtgttttttcagaaaatgcaagaccaaa1500gtataaggatggtca已atggcgaatagcaaatatgtcactggttcattcgttacttatgEi1560tttgcaaaagggggagtttccaattaccactttgcgtccaattccaatcaaatctgctat1620taaagaattgatgtggatataccaagaccaaacaagtgaactttctgttctcgaagagaa1680gtatggagtca^atactggggagaatggggaattggtgatggtacgattgggcaacgtta1740tggtgcaacagtcaaeLaaatataatatcattggtaaattattagaaggcttggcca犯aa1800tccatggaatcgtcgtaatatcatcaacctttggcagtatg3agattt;tgaggaaacaga1860aggtcttttaccatgtgctttccaaacgatgtttgatgtccgtcgagaaaaagatggtcal犯Ogatttatttggatgccacactgattcaacgttcaaacgatatgcttgtagcccaccatat1980caatgcgatgcaatatgttgctttgcaaatgatgattgcaaaacatttttcttgg犯agt2040tgggaaattcttttattttgtaaataatttacatatttatgataatcagtttgagcaggc2100aaatgaattaatgaagcgaacagcttctgaaaaagaacctcgtttggtccttaatgttcc2160tgatggtacaaactttttcgatattaaacctgaagattttgaacttgtggactatgagcc2220agtaaeLacctcaattgaaatttgatttagcaatttaaattaatctaaagcttaga/ttaat2280agttttagctattaatctttttttatttttatttaagaatggcttaataaagcggttact2340ttggatttttgtgagcttggactagaaaaaaacttcacaaaatgctatactagggtcgac2400aaccgaacttaatgggeiggEiaaaattaaaaaagaacagttatgaaaaaaaagattatctc2460agctattttaatgtctacagtgatactttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgc2520tgacacaaactcagatattgctaaacaagatgcgtctagaggatccccgggtaccgagct2580cgaattcgtaatcatggtcat2601<210〉2〈211〉33〈212〉腿<213〉人工序列<220>〈223〉引物〈400〉2cgaagcttagattaatagttttagctattaate<210>3〈211〉30〈212〉腿〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物〈400〉3gcgtcgaccctagtatagcattttgtgaag3330<210〉4〈211>28<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物〈400〉4gcgtcgacaaccgaacttaatgggagga<210〉5<211>33<212〉腿<213>人工序列<220〉<223〉引物〈400〉5cgtctagacgcatcttgtttagcaatatctgag33〈210>6<211>34<212>腿<213>人工序列<220><223〉引物〈400〉6gatctagatcaactaaaaaattacataaagaacc34<210〉7〈211〉28〈212〉DNA〈213〉人工序列<220>〈223〉引物<400>7gcggtaccgatctaaaaattataaaagt28〈210>8〈211〉28<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物〈400〉8cgaagcttgtgttttgtaatcataaaga28<210〉9〈211〉33〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223〉引物<400>9cgtctagacgcatcttgtttagcaatatctgag3權(quán)利要求1、一種乳酸乳球菌食品級分泌表達載體，其包括以下元件thyA基因選擇標(biāo)記、質(zhì)粒pWV01的復(fù)制子、多克隆位點、分泌表達用啟動子、Usp45的核糖體結(jié)合位點、Usp45的信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列。2、如權(quán)利要求1所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體，其中，所述部分Usp45成熟肽編碼序列為Usp45成熟肽前9、10、11、12、13、14或15個氨基酸編碼序列。3、如權(quán)利要求1或2所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體，其中所述分泌表達用啟動子為P32啟動子。4、如權(quán)利要求3所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體，其中，所述的P32啟動子與所述Usp45的核糖體結(jié)合位點、Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列形成融合基因。5、如權(quán)利要求4所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體，其中，所述融合基因位于i^'wffll和^kzl多克隆位點之間。6、如權(quán)利要求1所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體，其中，所述的基因選擇標(biāo)記為乳酸乳球菌MG1363的A;^4基因；所述P32啟動子為pMG36e的P32啟動子；所述的Usp45信號肽序列為乳酸乳球菌MG1363的Usp45信號肽序列；優(yōu)選所述載體包含如SEQIDNO:1所示的序列。7、一種乳酸乳球菌食品級分泌表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含權(quán)利要求16任一項所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體以及乳酸乳球菌Af/^A突變株；優(yōu)選所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體位于所述的乳酸乳球菌A^j;A突變株中。8、一種疫苗，其含有權(quán)利要求7所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達系統(tǒng)。9、權(quán)利要求16任一項所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體的構(gòu)建方法，該方法包括制備分泌表達用啟動子、Usp45的核糖體結(jié)合位點、Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列以及制備包含fA基因選擇標(biāo)記、質(zhì)粒pWVOl的復(fù)制子和質(zhì)粒pUC18的多克隆位點的載體骨架；將所述分泌表達用啟動子、Usp45的核糖體結(jié)合位點、Usp45信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列克隆入所述載體骨架的多克隆位點；優(yōu)選所述的分泌表達用啟動子為P32啟動子。10、權(quán)利要求16任一項所述的乳酸乳球菌食品級分泌表達載體在分泌表達外源基因中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種乳酸乳球菌食品級分泌表達載體及其制備方法和應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明涉及乳酸乳球菌食品級分泌表達載體，其包括以下元件thyA基因選擇標(biāo)記、質(zhì)粒pWV01的復(fù)制子、多克隆位點、分泌表達用啟動子、Usp45的核糖體結(jié)合位點、Usp45的信號肽序列及部分Usp45成熟肽編碼序列。文檔編號C12N15/74GK101168741SQ200710175269公開日2008年4月30日申請日期2007年9月28日優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日發(fā)明者孫強正,徐建國申請人:中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所